康 祺， 查 瑩， 曾萬江， 劉海意

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430022

早產(chǎn)是新生兒及5歲以下兒童死亡的主要原因[1]。早產(chǎn)的定義為妊娠37周前的活產(chǎn)[2]，是由分娩啟動過早發(fā)生引起的。因此，研究及預測分娩啟動有助于預防早產(chǎn)。目前預測早產(chǎn)的指標主要有兩種：經(jīng)陰道宮頸長度超聲檢測及宮頸分泌物(如胎兒纖維連接蛋白)生化檢測[3]，這兩種指標評估早產(chǎn)陰性的預測價值高，但對陽性預測價值較低[4]。因此，探索及發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)生物標記物對研究及預防早產(chǎn)具有重要臨床意義。

近年來，斯坦福大學及丹麥血清研究所對30名孕婦在孕期和產(chǎn)后每周采集血樣，對總共784份血樣進行了非靶向代謝組學分析。該研究發(fā)現(xiàn)，雌三醇-16-葡萄糖醛酸苷(estriol-16-glucuronide，E3-16-G)、17-羥基孕酮(17-hydroxyprogesterone，17-OHP)在妊娠期間發(fā)生了顯著改變，兩者皆隨孕周的增加而增加，于分娩前達高峰，分娩結(jié)束后迅速降至基線水平。此外，E3-16-G和17-OHP參與構(gòu)建的代謝物模型可以預測孕婦的分娩啟動[5]。然而，該研究并未進一步探索E3-16-G、17-OHP與分娩啟動的關(guān)系。

E3-16-G是類固醇激素雌三醇的葡萄糖醛酸衍生物[6]，是雌三醇的終末代謝產(chǎn)物。葡萄糖醛酸化反應有助于排泄有毒物質(zhì)、藥物或其他不能作為能量來源的物質(zhì)，因此常被稱作“解毒”過程[7]。葡萄糖醛酸通過糖苷鍵連接到雌三醇上，所得到的E3-16-G水溶性較雌三醇高，最終由腎臟排泄。目前，對妊娠晚期孕婦血漿E3-16-G的定量研究較少，且血漿E3-16-G水平與分娩啟動的關(guān)系仍不清楚。

17-OHP是孕酮的17α羥基衍生物，是多種內(nèi)分泌激素生物合成的中間體，主要在腎上腺中產(chǎn)生[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，血漿17-OHP濃度隨孕周的增加而增加，自發(fā)分娩啟動前30 d開始，血漿17-OHP水平變化呈顯著上升趨勢[9]。然而，另有研究表明，分娩啟動前后血漿17-OHP水平變化不明顯[10]或分娩啟動前17-OHP呈下降趨勢[11]。因此，17-OHP與分娩啟動的關(guān)系仍存在爭議。

本研究收集單胎孕婦妊娠晚期血漿，應用前期建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定血漿中E3-16-G、17-OHP水平，對測定結(jié)果進行Pearson相關(guān)分析、單因素Logistic回歸分析、受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線等統(tǒng)計學分析來探索這兩種代謝物與分娩啟動的關(guān)系及其對分娩啟動的預測價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究為病例對照研究，選擇2020年11月至2022年2月至我院診治的孕婦為研究對象。納入標準包括：孕周≥ 28周且<42周；單胎；無吸煙、飲酒史；學歷高中以上的孕婦。排除標準包括：妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓疾病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、妊娠合并甲減等產(chǎn)科并發(fā)癥及合并癥。

本研究共募集妊娠晚期孕婦150例，排除妊娠期高血壓疾病者9例、糖尿病者10例、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥者2例、雙胎妊娠者5例、妊娠合并甲狀腺疾病者7例。最終符合入排標準的孕婦共117例，其中包括足月孕婦97例，早產(chǎn)孕婦20例。采集117例孕婦血漿用于檢測。本研究獲得華中科技大學同濟醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準，倫理編號：[2020]倫審字(S190)號。所有納入研究的孕婦均已簽署知情同意書。

1.2 分組

根據(jù)采血時孕婦是否足月、臨產(chǎn)分為4組，早產(chǎn)未臨產(chǎn)組(preterm non-labor，PNL)、早產(chǎn)臨產(chǎn)組(preterm labor，PL)、足月未臨產(chǎn)組(term non-labor，TNL)、足月臨產(chǎn)組(term labor，TL)。其中，PNL組和PL組統(tǒng)稱為早產(chǎn)組；TNL組與TL組統(tǒng)稱為足月組；PNL組和TNL組統(tǒng)稱為未臨產(chǎn)組(non-labor，NL)；PL組與TL組統(tǒng)稱為臨產(chǎn)組(labor，L)。

1.3 標本采集與檢測

使用EDTA抗凝采血管采集孕婦靜脈血4 mL，并立刻輕輕上下顛倒混勻采血管5～10次，以確?？鼓齽┌l(fā)揮作用，采血后盡快離心分離出血漿，保存于-80 ℃冰箱。本課題組前期已建立了血漿E3-16-G、17-OHP同步定量檢測的LC-MS/MS法，并進行了方法學驗證，包括精密度與準確度、基質(zhì)效應、回收率、穩(wěn)定性等。應用此方法同批次檢測所有血漿樣本。

1.4 統(tǒng)計學分析

Logistic回歸分析用于探究分娩啟動的相關(guān)因素，包括年齡、體重指數(shù)(body mass index，BMI)、妊娠天數(shù)、孕次、產(chǎn)次、胎兒性別以及E3-16-G/17-OHP比值。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦一般資料比較

本研究共納入117份孕婦血漿進行檢測，其中TNL組57份，占比48.72%；TL組40份，占比34.18%；PNL組10份，占比8.55%；PL組10份，占比8.55%。足月組孕婦妊娠天數(shù)均值約275 d(39+2周)，早產(chǎn)組孕婦妊娠天數(shù)均值約248 d(35+3周)。除TNL組與TL組妊娠天數(shù)的差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.01)外，年齡、BMI、孕次、產(chǎn)次及胎兒性別在TNL組與TL組、PNL組與PL組比較中，差異均無統(tǒng)計學意義(表1、表2)。

表1 足月未臨產(chǎn)(TNL)組與足月臨產(chǎn)(TL)組孕婦一般資料比較[例(%)]Table 1 Comparison of general information of pregnant women in term non-labor(TNL)group and term labor(TL)group [n(%)]

表2 早產(chǎn)未臨產(chǎn)(PNL)組與早產(chǎn)臨產(chǎn)(PL)組孕婦一般資料比較[例(%)]Table 2 Comparison of general information of pregnant women in preterm non-labor(PNL)group and preterm labor(PL)group [n(%)]

2.2 妊娠晚期未臨產(chǎn)與臨產(chǎn)孕婦血漿E3-16-G、17-OHP水平情況

本研究共納入孕婦117例，血漿E3-16-G的中位數(shù)濃度為52.59 ng/mL，17-OHP的中位數(shù)濃度為8.35 ng/mL。其中，NL組共有67名孕婦，其血漿E3-16-G的中位數(shù)濃度為47.22 ng/mL，17-OHP中位數(shù)濃度為8.42 ng/mL。L組共有50例孕婦，其血漿E3-16-G的中位數(shù)濃度為76.86 ng/mL，17-OHP中位數(shù)濃度為8.09 ng/mL(表3)。

表3 妊娠晚期未臨產(chǎn)(NL)與臨產(chǎn)(L)孕婦血漿中E3-16-G、17-OHP水平(ng/mL)Table 3 Plasma E3-16-G and 17-OHP levels of pregnant women in non-labor(NL) group and labor(L) group in the third trimester (ng/mL)

2.3 妊娠晚期未臨產(chǎn)與臨產(chǎn)孕婦血漿中E3-16-G、17-OHP濃度的比較

利用PSM匹配對TNL組與TL組中孕婦個體進行異體配對，配對比例1∶1，匹配的變量有：年齡、BMI、妊娠天數(shù)、孕次、產(chǎn)次及胎兒性別。匹配容差為0.02。TNL組和TL組經(jīng)PSM匹配后有24對(48例)符合要求。配對后的兩組在年齡、BMI、妊娠天數(shù)、孕次、產(chǎn)次及胎兒性別上差異均無統(tǒng)計學意義。

2.3.1 PSM匹配前未臨產(chǎn)與臨產(chǎn)孕婦血漿中E3-16-G、17-OHP水平的比較 如圖1所示，PSM匹配前L組E3-16-G平均水平高于NL組[(76.86vs.47.22)ng/mL]，TL組E3-16-G平均水平高于TNL組[(82.06vs.44.00)ng/mL]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NL組與L組[(8.42vs.8.09)ng/mL]、TNL組與TL組[(8.42vs.7.91)ng/mL]的17-OHP平均水平差異均無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。E3-16-G/17-OHP比值，L組高于NL組(10.24vs.5.40)，TL組高于TNL組(10.97vs.5.25)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3.2 PSM匹配后未臨產(chǎn)與臨產(chǎn)孕婦血漿中E3-16-G、17-OHP水平的比較 PSM匹配后L組與NL組、TNL組與TL組、PNL組與PL組，血漿E3-16-G、17-OHP濃度差異均無統(tǒng)計學意義(均P> 0.05)。L組E3-16-G/17-OHP比值仍高于NL組(9.61vs.6.45)，TL組E3-16-G/17-OHP比值高于TNL組(10.71vs.5.92)，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖1)。

A、B：各組E3-16-G水平的比較情況；C、D：各組17-OHP水平的比較情況；E、F：各組E3-16-G/17-OHP比值的比較情況；PNL：早產(chǎn)未臨產(chǎn)組；PL：早產(chǎn)臨產(chǎn)組；TNL：足月未臨產(chǎn)組；TL：足月臨產(chǎn)組；NL：未臨產(chǎn)組(PNL+TNL)：L：臨產(chǎn)組(PL+TL)；TNL-PSM：傾向評分配對后的足月未臨產(chǎn)組；TL-PSM：傾向評分配對后的足月臨產(chǎn)組；NL-PSM：傾向評分配對后的未臨產(chǎn)組；L-PSM：傾向評分配對后的臨產(chǎn)組圖1 妊娠晚期未臨產(chǎn)(NL)與臨產(chǎn)(L)孕婦血漿中E3-16-G、17-OHP水平的比較Fig.1 Comparison of plasma E3-16-G and 17-OHP levels in pregnant women in non-labor(NL) group and labor(L) group in the third trimester

2.4 妊娠晚期血漿E3-16-G、17-OHP水平的相關(guān)性分析

對孕婦年齡、BMI、妊娠天數(shù)與代謝物E3-16-G、17-OHP濃度進行相關(guān)性分析，結(jié)果示血漿中E3-16-G與17-OHP水平為弱正相關(guān)關(guān)系(r=0.225，P<0.05)，17-OHP水平與妊娠天數(shù)為弱負相關(guān)關(guān)系(r=-0.219，P<0.05)(圖2)。

0：未臨產(chǎn)組(NL，PNL+TNL)；1：臨產(chǎn)組(L,LPL+TL)；PD：妊娠天數(shù)；Corr：相關(guān)系數(shù)；*P<0.05，**P<0.01圖2 妊娠晚期臨產(chǎn)前后血漿中E3-16-G、17-OHP水平的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of plasma E3-16-G and 17-OHP levels before and after labor onset during the third trimester of pregnancy

2.5 血漿E3-16-G、17-OHP水平與足月分娩啟動的關(guān)聯(lián)性研究

單因素Logistic回歸分析結(jié)果示，E3-16-G/17-OHP比值是足月分娩啟動的獨立影響因素。在其他因素不變的情況下，E3-16-G/17-OHP比值每增加1，分娩啟動風險增加0.15倍(表4)。

表4 母嬰特征、代謝物水平與足月分娩啟動的單因素Logistic回歸分析[例(%)]Table 4 Univariate logistic regression analysis of maternal and infant characteristics，metabolite levels，and full-term labor onset [n(%)]

2.6 E3-16-G/17-OHP比值預測分娩啟動的ROC曲線分析

為探究血漿E3-16-G/17-OHP比值預測分娩啟動的可行性，本研究對E3-16-G/17-OHP比值進行ROC曲線分析。結(jié)果顯示，E3-16-G/17-OHP比值的AUC為0.69，P=0.02，95%CI：0.54～0.84，具有統(tǒng)計學意義。當E3-16-G/17-OHP比值為8.68時，正確指數(shù)最大，此時敏感度為62.50%，特異度為79.17%。

圖3 E3-16-G/17-OHP比值預測分娩啟動的ROC曲線分析Fig.3 ROC curve analysis of E3-16-G/17-OHP ratio for predicting labor onset

3 討論

早產(chǎn)是新生兒及5歲以下兒童死亡的主要原因[1]，是現(xiàn)代產(chǎn)科面臨且亟待解決的臨床問題之一。早產(chǎn)定義為妊娠37周前的活產(chǎn)[2]，由分娩啟動過早發(fā)生所致。因此，研究及預測分娩啟動有助于預防早產(chǎn)。分娩啟動是子宮肌層由安靜狀態(tài)轉(zhuǎn)向活躍狀態(tài)的過程，此過程受多種內(nèi)分泌激素調(diào)控[12]。其中孕激素功能性撤退或雌激素激活可引起分娩的開始，與妊娠維持和分娩啟動有關(guān)[13-14]。近年來，孕婦血液代謝組學研究發(fā)現(xiàn)，E3-16-G或17-OHP參與構(gòu)建的代謝物模型可以用來預測孕婦的分娩啟動[5]，但目前關(guān)于E3-16-G的研究較少。對E3-16-G的前體物質(zhì)雌三醇的研究發(fā)現(xiàn)，足月分娩及自發(fā)早產(chǎn)與孕期雌三醇的快速增長時間有關(guān)[15]，提示雌三醇與分娩啟動存在聯(lián)系。17-OHP與己酸結(jié)合形成的17-OHPC是一種合成孕激素，臨床常用于保胎及預防早產(chǎn)[16]。因此，E3-16-G、17-OHP或許與分娩啟動或早產(chǎn)有關(guān)，但尚缺乏系統(tǒng)的觀察數(shù)據(jù)。本研究應用前期建立的LC-MS/MS法對孕婦臨產(chǎn)前后血漿中E3-16-G、17-OHP水平同時進行定量檢測，并探索二者與分娩啟動的關(guān)系及其對分娩啟動的預測價值。

Numazawa等[17]應用RIA測定妊娠晚期孕婦血漿E3-16-G的均值濃度為58 ng/mL。Mathur等[10]應用RIA測得足月孕婦臨產(chǎn)前17-OHP的相對濃度均值為4.6 ng/mL，足月臨產(chǎn)后為5.08 ng/mL。Kadivnik等[18]應用LC-MS/MS法測得足月孕婦臨產(chǎn)后血漿中17-OHP的中位數(shù)濃度為6.05 ng/mL。本研究測定妊娠晚期孕婦血漿中E3-16-G的中位數(shù)濃度為52.59 ng/mL，足月未臨產(chǎn)者血漿17-OHP中位數(shù)濃度為8.42 ng/mL，足月臨產(chǎn)者血漿17-OHP中位數(shù)濃度為7.91 ng/mL，與Numazawa等人檢測結(jié)果相近。

本研究比較了妊娠晚期未臨產(chǎn)與臨產(chǎn)孕婦血漿中E3-16-G、17-OHP的測定結(jié)果，提示E3-16-G/17-OHP比值增加可能主要與足月分娩啟動有關(guān)。對妊娠晚期未臨產(chǎn)與臨產(chǎn)孕婦血漿中單個指標E3-16-G、17-OHP含量進行比較，均無顯著差異。17-OHP的研究結(jié)果與Mathur等[10，19]研究結(jié)果相符。上述結(jié)果表明，分娩啟動是多因素影響的過程，單一指標對分娩啟動的影響及預測價值有限。本研究還發(fā)現(xiàn)PL組17-OHP水平高于TL組，差異具有統(tǒng)計學意義，提示足月臨產(chǎn)后17-OHP低水平環(huán)境可能更有利于分娩啟動的發(fā)生或產(chǎn)程進展。既往研究發(fā)現(xiàn)17-OHP可抑制腫瘤壞死因子或凝血酶導致的胎膜彈性減弱[20]，間接支持這一觀點。足月臨產(chǎn)后，血漿17-OHP低水平環(huán)境對腫瘤壞死因子或凝血酶的抑制作用減弱，腫瘤壞死因子或凝血酶減弱胎膜彈性的作用增強，胎膜破裂風險增加，促進產(chǎn)程進展。

本研究對妊娠晚期臨產(chǎn)前后血漿E3-16-G、17-OHP濃度與孕婦基本臨床特征(年齡、BMI、妊娠天數(shù))進行相關(guān)性分析，結(jié)果示E3-16-G、17-OHP之間存在弱正相關(guān)關(guān)系；17-OHP與妊娠天數(shù)存在弱負相關(guān)關(guān)系。胎盤類固醇激素合成過程或許能解釋E3-16-G、17-OHP之間的弱正相關(guān)性結(jié)果。妊娠期間，E3-16-G主要來自胎兒腎上腺、胎兒肝臟聯(lián)合胎盤產(chǎn)生的雌三醇分解代謝。孕酮或孕烯醇酮是雌激素合成的底物，兩者可以互相轉(zhuǎn)化[21]。孕烯醇酮在酶的催化下產(chǎn)生17-孕烯醇酮參與雄烯二酮、雌激素的合成，孕酮則主要轉(zhuǎn)化為17-OHP參與皮質(zhì)醇的合成。17-孕烯醇酮與17-OHP在特定條件下可以相互轉(zhuǎn)化。E3-16-G、17-OHP這種弱正相關(guān)性或許與17-孕烯醇酮和17-OHP間的相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。17-OHP與妊娠天數(shù)存在弱負相關(guān)性，這種負相關(guān)關(guān)系主要發(fā)現(xiàn)于妊娠晚期臨產(chǎn)后孕婦血漿中，可能提示足月臨產(chǎn)者對17-OHP的低水平環(huán)境需求高于早產(chǎn)臨產(chǎn)者，此觀點還有待進一步研究證實。

本研究探索了母嬰基線特征、血漿代謝物與足月分娩啟動的關(guān)系。單因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，血漿中E3-16-G或17-OHP的單個指標變化不提示分娩啟動的風險增加，E3-16-G/17-OHP是足月分娩啟動的獨立影響因素。血漿中E3-16-G/17-OHP比值增加可提示分娩啟動風險增加。Coats等[11]對10名孕婦產(chǎn)檢時采集的血樣進行放射免疫分析測定，結(jié)果示孕婦血漿17-OHP濃度自妊娠32周開始顯著增加；對1名孕婦妊娠晚期每周一次采集并測定其血漿中17-OHP水平，發(fā)現(xiàn)該名孕婦最后一次采樣后5天進入自然分娩，自發(fā)分娩啟動前4周內(nèi)17-OHP呈現(xiàn)下降趨勢。然而，不同的研究者對17-OHP與分娩啟動的關(guān)系研究的結(jié)果不完全一致。Stelzer等[9]收集63名孕婦分娩前100 d內(nèi)的連續(xù)血液標本(共177個)進行多組學分析，利用血標本采集時間的個體差異來描述采樣日與分娩日的差異，結(jié)果示在分娩前30天內(nèi)，孕婦血漿中17-OHP水平顯著增加，呈上升趨勢。

本研究還繪制了ROC曲線用于評估E3-16-G/17-OHP比值對足月分娩啟動的預測價值。結(jié)果提示，E3-16-G/17-OHP比值對足月分娩啟動具有一定臨床預測價值。然而，本研究尚存在以下不足之處：首先，早產(chǎn)組樣本量較少，仍需要進一步納入更多的早產(chǎn)樣本以探究E3-16-G/17-OHP比值與早產(chǎn)分娩啟動的關(guān)聯(lián)性；其次，本研究為病例對照研究，研究結(jié)果尚需要前瞻性研究進行驗證；此外，血漿樣品中E3-16-G、17-OHP在-80℃儲存條件下的長期穩(wěn)定性也需要進一步實驗進行探究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明E3-16-G/17-OHP比值增加可能與足月分娩啟動有關(guān)。E3-16-G/17-OHP比值對足月分娩啟動具有臨床診斷價值，或可作為預測足月分娩啟動的生物標記物。