王 鵬， 陳 慧， 代喆穎， 江 鈴， 彭 紅， 周 輝

(湖北省武漢市第三醫(yī)院口腔科， 湖北 武漢 430060)

牙齒缺失的治療是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的工作，種植體修復(fù)體已被廣泛用于替換缺失的牙齒[1]。然而，種植體假體存在多個(gè)缺點(diǎn)，如缺乏生理本體感覺和牙周韌帶(periodontal ligament，PDL)對(duì)咀嚼的感覺反應(yīng)缺失[2]。最近的研究顯示，牙齒自體移植，可以將非功能性牙齒(通常是第三磨牙)轉(zhuǎn)移到功能性位置，具有較高的成功率[3,4]。白蘆藜醇(Resveratrol，RSV)是一種天然存在的植物抗生素，可從多種植物如葡萄等物質(zhì)中獲取。由于其生物學(xué)效應(yīng)，被認(rèn)為是治療各種慢性疾病的潛在候選藥物[5]。據(jù)報(bào)道，RSV可通過減少破骨細(xì)胞的形成和促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成來影響骨代謝[6]。故而，推測RSV可能通過影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞來改變牙移植后牙周組織愈合。此外，RSV在多項(xiàng)研究中被用作Sirt1信號(hào)通路的激活劑發(fā)揮作用[7]，且Nrf2已被證實(shí)是Sirt1的下游靶基因[8]。因此，推測RSV對(duì)牙移植后牙周組織愈合的影響可能與Sirt1/Nrf2信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：48只SPF級(jí)雄性Lewis大鼠，8周齡，體重(180±15)g購自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所[許可證號(hào)SCXK(京)2021-0012]；飼養(yǎng)條件為標(biāo)準(zhǔn)的12h明暗循環(huán)，恒溫約25℃，自由飲食和水。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)武漢市第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2藥物與試劑：RSV粉劑購自美國Sigma Aldrich公司(批號(hào)：R5010，純度≥99%)；羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose，CMC)溶液購自北京YITA公司(批號(hào)：SY0248)；HE染色液購自北京Leagene公司(批號(hào)：DH0006)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色試劑盒購自美國Sigma公司(批號(hào)：387-1KT)；小鼠源一抗核因子κB受體激活劑配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL，批號(hào)：ab239607)、Sirt1(批號(hào)：ab110304)、β-actin(批號(hào)：ab8226)和兔源一抗骨保護(hù)素(Osteoprotegerin，OPG，批號(hào)：ab73400)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2，批號(hào)：ab236639)、骨鈣素(Osteocalcin，OCN，批號(hào)：ab93876)、Nrf2(批號(hào)：ab92946)均購自英國Abcam公司。

1.3主要儀器：BX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；SU8010型掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)；OmegaLum C型凝膠成像系統(tǒng)(美國Aplegen公司)。

1.4方 法

1.4.1大鼠牙移植模型構(gòu)建及處理：將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組(每組12只)：依次為對(duì)照(Control)組、模型(Model)組、低劑量RSV(L-RSV)組和高劑量RSV(H-RSV)組。Control組不作處理，其余組均將大鼠右上頜第一磨牙植入大鼠右上頜第一磨牙牙槽窩[9]。14d后，Control組和Model組大鼠每天早上8點(diǎn)整灌胃等量CMC，L-RSV組和H-RSV組大鼠分別給予5mg·kg-1·d-1RSV或10mg·kg-1·d-1RSV(溶于CMC)灌胃[10]，每天一次。大鼠牙移植后28d，所有大鼠均以過量麻醉藥物處死。每組分為2個(gè)亞組，其中一個(gè)亞組分別用HE染色、TRAP染色和免疫組化染色觀察牙周組織病理學(xué)和成骨分化相關(guān)因子的變化。第二個(gè)亞組通過掃描電子顯微鏡分析牙根吸收面積的比例和Sirt1/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平。

1.4.2標(biāo)本制備和染色：大鼠上頜骨在4℃下于4%多聚甲醛中固定24h，在10% EDTA中脫鈣至少2個(gè)月。將脫水的樣本包埋在石蠟中，切成5 μm厚的切片。行常規(guī)HE染色，觀察牙周組織病理學(xué)變化。使用TRAP染色試劑盒鑒定破骨細(xì)胞[11]，計(jì)算TRAP陽性細(xì)胞數(shù)。對(duì)于免疫組化染色，先用消化酶回收抗原，而后將載玻片在4℃下與一抗孵育90min，分別以1∶300(RANKL和OCN)、1∶400(RUNX2)和1∶50(OPG)的濃度稀釋抗體，相應(yīng)的二抗孵育后，光學(xué)顯微鏡下觀察RANKL、OCN、RUNX2和OPG的陽性表達(dá)。

1.4.3掃描電子顯微鏡觀察牙根吸收情況：將上頜骨浸泡在10%次氯酸鈉溶液中數(shù)小時(shí)。首先仔細(xì)拔除磨牙，輕輕去除牙齒周圍的牙周膜，然后去掉除2個(gè)遠(yuǎn)中根外的其他3個(gè)牙根。掃描電子顯微鏡觀察遠(yuǎn)中根的近側(cè)，用Image J軟件計(jì)算牙根吸收面積與總表面積比(即牙根吸收率)。

1.4.4Western blot檢測牙周組織中Sirt1、Nrf2蛋白水平：將1.4.3中取出的牙周組織通過RIPA法提取總蛋白，并通過電泳分離。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉后，在4℃下與一抗過夜孵育，均以1∶1000(Sirt1、Nrf2、β-actin)的比例稀釋抗體。相應(yīng)的二抗室溫孵育2h后，使用ECL試劑盒結(jié)合OmegaLum C型凝膠成像系統(tǒng)檢測，并通過Image J軟件量化。

2 結(jié) 果

2.1RSV對(duì)大鼠牙移植后牙周組織病理學(xué)的影響：Control組牙周組織形態(tài)正常，Model組牙周組織破壞最明顯，牙槽骨表面可見大量破骨細(xì)胞，炎癥細(xì)胞大量浸潤；且牙根表面多見局部牙根吸收，牙根吸收陷窩最大、最深。L-RSV組和H-RSV組牙周組織損傷程度和牙根吸收面積均小于Model組；且L-RSV組牙周損傷程度和牙根吸收面積大于H-RSV組。見圖1。

圖1 各組大鼠牙移植后牙周組織病理情況(HE染色，×200)

圖2 各組大鼠牙移植后牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)量(TRAP染色，×200)

2.2RSV對(duì)大鼠牙移植后破骨細(xì)胞的影響：與Control組比較，Model組大鼠牙周組織中TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組大鼠牙周組織中TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量均降低(P<0.05)；與L-RSV組比較，H-RSV組大鼠牙周組織中TRAP陽性破骨細(xì)胞數(shù)量均降低(P<0.05)。見圖2、表1。

2.3RSV對(duì)大鼠牙移植后牙周組織中RANKL、OPG、RUNX2和OCN表達(dá)的影響：與Control組比較，Model組RANKL水平升高，OPG、RUNX2和OCN水平降低(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組RANKL水平降低，OPG、RUNX2和OCN水平升高(P<0.05)；與L-RSV組比較，、H-RSV組RANKL水平降低，OPG、RUNX2和OCN水平升高(P<0.05)。見圖3、表2。

表1 RSV對(duì)大鼠牙移植后破骨細(xì)胞的影響

表2 RSV對(duì)大鼠牙移植后牙周組織中RANKL OPG RUNX2和OCN表達(dá)的影響

圖3 免疫組化檢測各組大鼠牙周組織中RANKL、OPG、RUNX2和OCN表達(dá)情況

2.4 RSV對(duì)大鼠牙移植后牙根吸收的影響：與Control組比較，Model組大鼠牙周組織中牙根吸收率升高(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組大鼠牙周組織中牙根吸收率均降低(P<0.05)；與L-RSV組比較，H-RSV組大鼠牙周組織中牙根吸收率均降低(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 RSV對(duì)大鼠牙移植后破骨細(xì)胞的影響

2.5RSV對(duì)大鼠牙移植后牙周組織中Sirt1/Nrf2信號(hào)通路的影響：與Control組比較，Model組Sirt1、Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；與Model組比較，L-RSV組、H-RSV組Sirt1、Nrf2蛋白水平升高(P<0.05)；與L-RSV組比較，H-RSV組Sirt1、Nrf2蛋白水平升高(P<0.05)。見圖5、表4。

圖5 Western blot檢測Sirt1、Nrf2蛋白水平

表4 RSV對(duì)大鼠牙移植后Sirt1 Nrf2蛋白水平的影響

3 討 論

RSV是一種天然合成的植物化學(xué)物質(zhì)，即使在高濃度下也不會(huì)產(chǎn)生有害作用，因此可以作為膳食補(bǔ)充劑。據(jù)報(bào)道，RSV對(duì)破骨細(xì)胞的骨吸收有抑制作用，也有對(duì)成骨細(xì)胞骨形成的促進(jìn)作用[6]，這與牙移植過程中牙周組織愈合過程密切相關(guān)。然而，到目前為止，關(guān)于RSV與牙移植后牙周組織愈合的相關(guān)數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)中很少見。

TRAP為破骨細(xì)胞和骨吸收的關(guān)鍵標(biāo)志物。本研究使用TRAP染色來檢查牙移植后牙周組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示，RSV處理根部和牙槽骨周圍TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于Model組，表明RSV在抑制破骨細(xì)胞形成中具有重要作用。據(jù)報(bào)道，成骨細(xì)胞表達(dá)的RANKL是破骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。而OPG可阻止RANKL與其細(xì)胞表面受體RANK結(jié)合進(jìn)而對(duì)破骨細(xì)胞分化具有抑制作用[12]。本研究結(jié)果顯示，Model組牙周組織中RANKL上調(diào)，OPG下調(diào)，而用RSV處理后這種表達(dá)得到逆轉(zhuǎn)。表明RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)很有可能是RSV在大鼠牙移植后牙周組織愈合的直接機(jī)制。RUNX2是骨形成的關(guān)鍵激活劑和早期成骨分化的標(biāo)志物，OCN是成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志。在本研究中，RUNX2和OCN在大鼠牙移植模型中的表達(dá)降低，而RSV可明顯上調(diào)二者表達(dá)。此外，本研究還證實(shí)了RSV可改善大鼠牙移植后牙周組織的損傷程度，同時(shí)還可明顯抑制牙根吸收率。以上數(shù)據(jù)證實(shí)，RSV可能通過抗破骨細(xì)胞形成、促成骨形成以及抑制牙根吸收等方面在牙移植后牙周組織的愈合過程中發(fā)揮重要保護(hù)作用。

RSV已被證實(shí)是Sirt1強(qiáng)效激活劑[7]，Nrf2是Sirt1的下游靶基因[8]。據(jù)報(bào)道，RSV通過激活Sirt1/Nrf2信號(hào)通路抑制活性氧產(chǎn)生和成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖進(jìn)而改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[13]。近期研究顯示，RSV通過Sirt1/Nrf2通路減少氧化應(yīng)激增強(qiáng)人牙髓基質(zhì)細(xì)胞成骨潛能[14]。本研究結(jié)果證實(shí)，牙移植后牙周組織中Sirt1、Nrf2蛋白水平均明顯降低，而RSV干預(yù)可明顯上調(diào)Sirt1、Nrf2蛋白水平。結(jié)合以往研究得出，RSV可能通過激活Sirt1/Nrf2通路介導(dǎo)大鼠牙移植后牙周組織愈合。

綜上所述，RSV可改善牙移植后牙周組織損傷，可能與激活Sirt1/Nrf2通路，調(diào)控破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的形成有關(guān)。有研究表明，RSV在正常大鼠體內(nèi)應(yīng)用不會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)生明顯變化[15]，但由于RSV濃度不同、實(shí)驗(yàn)時(shí)期不同、大鼠病情不同，不能否認(rèn)全身應(yīng)用RSV可能會(huì)產(chǎn)生影響。