李曉峰，許文劍，衛(wèi) 星，張志強(qiáng)

轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白基因（transformation-related protein 53 gene，tp53）是常見的抑癌基因之一，可轉(zhuǎn)錄激活靶基因以響應(yīng)氧化應(yīng)激或DNA 損傷等細(xì)胞應(yīng)激[7]，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)過程[8]，但胰腺癌患者的tp53 基因圖譜尚不清楚。 因此，筆者分析胰腺癌患者血液ctDNA 與腫瘤組織中tp53 基因突變特征及一致性，并結(jié)合患者臨床病理特征分析影響一致性的相關(guān)因素， 以期為胰腺癌患者ctDNA 檢測(cè)的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

選擇2018 年2 月至2021 年12 月于內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤醫(yī)院就診的胰腺癌患者168 例， 其中男性99例，女性69 例；年齡34 ～78 歲，平均年齡56.63 歲（標(biāo)準(zhǔn)差5.85 歲）；頭頸部胰腺癌89 例，體位部胰腺癌79 例； 腫瘤直徑≤5 cm 者67 例，＞5 cm 者101例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～Ⅳ期123 例；依據(jù)分化程度：高分化81 例，中分化59 例，低分化28 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者127 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41 例。筆者研究經(jīng)所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：NH20171129）；納入患者均知情并簽署基于《赫爾辛基宣言》擬定的知情同意書。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 歲；②組織病理診斷為胰腺癌；③接受ctDNA 檢測(cè)；④臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并感染或凝血系統(tǒng)疾??； ③組織學(xué)標(biāo)本與ctDNA 標(biāo)本間隔時(shí)間超過2 周；④合并遺傳性疾病。

1.2 方法

1.2.1 樣本提取

采用Streck 采血管 （Streck Inc, San Francisco，CA，美國）收集空腹外周血10 mL，于4 ℃、1 600×g條件下離心10 min 后，吸取離心血漿，再于4 ℃、16 000×g 條件下離心10 min， 去除殘留細(xì)胞碎片，將分離的血漿冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

采集患者手術(shù)病灶組織樣本，病灶組織樣本腫瘤細(xì)胞比例應(yīng)＞10%，石蠟包埋，3 ～5 μm 切片，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 臨床資料收集

對(duì)貴鉛樣品進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)貴鉛樣品中主要共存雜質(zhì)元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別如下所示：鉛，15.2%～75.5%；銻，1.6%～38.9%；鉍，0.4%～19.5%；鐵，0.2%～12.4%；銅，1.8%～6.3%；砷，1.9%～4.2%；碲，0.3%～1.8%。

通過查閱電子病歷收集患者臨床資料， 包括性別、年齡、腫瘤大小、臨床分期、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移器官數(shù)等。

1.2.3 DNA 定量和提取

采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kits（Qiagen，Hilden， 德國） 分離血漿ctDNA， 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Hilden，德國）提取外周血DNA 作為對(duì)照， 采用black PREP FFPE DNA Kit（Analytik Jena AG，Jena，德國）提取樣本組織DNA，- 80 ℃條件下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 DNA 的文庫構(gòu)建、捕獲與上機(jī)測(cè)序

使用Qubit 熒光儀 （Invitrogen，Carlsbad，CA，美國） 和Qubit dsDNA High-sensitivity （HS） Assay Kit（Invitrogen，美國）測(cè)定DNA 濃度。 使用Agilent 2100 Bioanalyzer （Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國）和DNA HS kit（Agilent Technologies，美國）分析ctDNA 的大小分布。 采用Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0 文庫構(gòu)建試劑盒，對(duì)DNA 進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）建庫，采用Ion Library TaqManTMQuantification Kit 試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行文庫定量， 并采用Illumina Hiseq3000 對(duì)文庫進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

剔除低質(zhì)量的讀數(shù)和末端接頭序列， 采用Burrows Wheeler Aligner（Version 0.7.12-r1039）校對(duì)原始測(cè)序堿基序列， 并使用Genome Analysis Toolkit（GATK，版本3.4-46-gbc02625）對(duì)比reads 序列，采用Varscan 2（v2.4.2）對(duì)樣本進(jìn)行突變檢測(cè)，用GATK識(shí)別人群多態(tài)性位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)， 計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)。 采用Kappa 值符合率評(píng)價(jià)ctDNA 與組織DNA 檢測(cè)tp53基因突變的一致性，多因素分析采用Logistic 回歸模型進(jìn)行。 P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與血漿tp53 基因突變情況

129 例患者進(jìn)行了組織tp53 基因檢測(cè)，168 例患者均接受血漿ctDNA 檢測(cè)。 組織標(biāo)本中tp53 突變率為30.23 %（39/129），ctDNA 中tp53 的 突 變 率 為54.76%（92/168）。

2.2 tp53 基因突變特征

基于目標(biāo)序列的二代測(cè)序結(jié)果顯示，92 例患者（54.76 %）ctDNA 中檢出至少1 個(gè)突變，25 例患者（14.88%）檢出至少2 個(gè)突變，突變頻率最高的類型分別為p.R213*（4.17%）、p.R248Q（3.57%）、p.R273H（2.98 %）、p.Y220C（2.38 %）和p.R175H（1.79 %）（表1）。突變類型分別為錯(cuò)義突變（92/168，54.76%）、移碼突變（29/168，17.26%）和無義突變（25/168，14.88%）。突變分布不均，75%（126/168） 的突變聚集在外顯子5 ～8 中，大部分分布在編碼DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列內(nèi)。 外顯子4（17/168，10.12%）、9（4/168，2.38%）和10（10/168，5.95%）也有突變，其余突變位于外顯子3及其間隔序列中。

39 例患者（30.23%）組織中檢出至少1 個(gè)突變，15 例（11.63%）患者檢出至少2 個(gè)突變，突變頻率最高的類型分別為p.R213*（8.53%）、p.R248Q（6.98%）、p.R273H（4.65%）、p.Y220C（3.10%）（表1）。 錯(cuò)義突變、 移碼突變和無義突變占比分別為62.02 %（80/129）、23.26%（30/129）和16.28%（21/129），突變分布主要集中在外顯子5 ～8 中（81.40%，105/129）。

表1 tp53 基因突變類型與頻率 例（%）Tab.1 Type and frequency of tp53 gene mutationcases（%）

2.3 胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變的一致性分析

129 例患者胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變的一致性為79.84 %（103/129）（Kappa = 0.325，P ＜0.001），靈敏度為79.59%（39/49），特異度為80.00%（64/80）。 見表2。

表2 胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 的一致性分析例（%）Tab. 2 Correspondence analysis between tissue and ctDNA detection of tp53 in pancreatic cancer cases（%）

2.4 影響胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的相關(guān)因素

由于胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變存在一定的不一致性，因此進(jìn)行了單因素分析。 結(jié)果顯示，年齡、腫瘤最大直徑、分化程度及臨床分期是胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的影響因素（P ＜0.05）。 見表3。

表3 影響胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的單因素分析Tab. 3 Univariate factor analysis on consistency of tp53 gene mutation between pancreatic cancer tissue and ctDNA detection

2.5 胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的多因素回歸分析

以胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變結(jié)果是否一致為因變量（是=0，否=1），以表3 中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素為自變量，進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析。 結(jié)果顯示：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化為胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P ＜0.05）。 見表4。

表4 胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的多因素回歸分析Tab.4 Multivariate factor analysis on consistency of tp53 gene mutation between pancreatic cancer tissue and ctDNA detection

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)能覆蓋較多的基因位點(diǎn)，并且具有較高的靈敏度和特異度，在臨床腫瘤診斷中顯現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[9]。 胰腺癌解剖部位特殊，腫瘤組織不易獲取，采用傳統(tǒng)活檢進(jìn)行病理診斷具有一定的挑戰(zhàn)。 而ctDNA 僅來源于腫瘤細(xì)胞，可在患者血液、尿液或唾液中獲得[10]，取樣操作簡單并可多次重復(fù)取樣，在臨床檢測(cè)早期疾病、監(jiān)測(cè)腫瘤基因圖譜等方面發(fā)揮重要作用。 然而ctDNA 由于其片段化特征、檢測(cè)技術(shù)的限制及時(shí)空異質(zhì)性，易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[11]，因此探討胰腺癌患者癌組織與ctDNA 基因突變的一致性，對(duì)于確定ctDNA 檢測(cè)在胰腺癌臨床診療中的作用具有重要意義。

Li H 等[12]通過分析胰腺癌患者血液樣本ctDNA序列探討了ctDNA 在胰腺癌中的應(yīng)用價(jià)值， 結(jié)果顯示68.2 %患者從ctDNA 序列中檢測(cè)出一種基因突變， 其與組織樣本中基因突變頻率具有較高的一致性，發(fā)生突變最多的基因分別為鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）和tp53。 筆者研究結(jié)果顯示， 胰腺癌組織標(biāo)本中tp53 突變率為30.23%，ctDNA 中tp53 的突變率為54.76%，提示胰腺癌患者ctDNA 中tp53 的突變率更高， 分析可能與腫瘤的發(fā)展導(dǎo)致腫瘤組織局部供血不足、腫瘤細(xì)胞被巨噬細(xì)胞吞噬后ctDNA 含量顯著增加有關(guān)[13]。 此外，筆者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)突變發(fā)生在基因編碼DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，大部分為錯(cuò)義突變，tp53 突變位于編碼tp53 的DNA 結(jié)合區(qū)域， 突變類型以p.R248Q （3.57 %）、p.R273H（2.98%）、p.Y220C（2.38%）為主。 胰腺癌患者癌組織與ctDNA 基因突變的一致性為79.84%，提示二者具有一定的不一致性。 導(dǎo)致組織與ctDNA 檢測(cè)不一致的因素較多，ctDNA 為小片段DNA，其在血液中的濃度較低[14]；此外，腫瘤的異質(zhì)性也可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響[15]。

通過分析檢測(cè)結(jié)果一致和不一致胰腺癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，不一致組患者年齡更大、腫瘤最大直徑＞5 cm 的比例更低、 臨床分期Ⅰ～Ⅱ期和高分化比例更高。 既往研究結(jié)果顯示[16]，腫瘤負(fù)荷增大將侵犯周圍組織和血管，導(dǎo)致癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增加外周血中凋亡癌細(xì)胞數(shù)量， 從而提高與組織檢測(cè)的一致性。 進(jìn)一步通過多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化為組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變一致性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素， 提示胰腺癌組織與ctDNA 檢測(cè)tp53 基因突變的一致性與腫瘤情況密切相關(guān)，分化程度越低、臨床分期越高的腫瘤，其更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而增加血液中腫瘤ctDNA 分布[17]，提高檢出的一致性。

綜上所述， 胰腺癌患者ctDNA 與癌組織檢測(cè)tp53 基因突變情況存在一定的差異性，臨床分期和分化程度是影響一致性的重要因素。但筆者研究仍存在一定的局限性，首先，研究對(duì)象的選擇來源于單個(gè)中心，且病例數(shù)較少；其次，缺乏隨訪調(diào)查，未進(jìn)行隨訪調(diào)查，缺乏對(duì)檢出一致性結(jié)果不同患者臨床療效及預(yù)后情況的追蹤，因此仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行前瞻性、 多中心的研究探討ctDNA 檢測(cè)在胰腺癌中的應(yīng)用價(jià)值。