穆琦瑄 高勝美 朱美娟王毅 王躍飛楊靜?

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津301617； 2.浙江大學(xué)，浙江 杭州310058）

中藥注射劑作為一種特殊劑型，化學(xué)成分復(fù)雜。構(gòu)建符合中藥注射液臨床應(yīng)用特點(diǎn)的質(zhì)量控制方法，特別是控制中藥注射液批間一致性，一直是研究者普遍關(guān)注的問題［1?2］。中藥指紋圖譜方法是控制中藥注射液批間一致性的有效方法，能解決中藥多成分質(zhì)量控制問題［3?4］，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥多成分定性、半定量的表征［5］。雙黃連注射液是由金銀花、連翹、黃芩經(jīng)一系列提取純化工藝制備而成。目前，通過高效液相色譜法建立指紋圖譜并得到10 個(gè)特征峰［6］；并在此基礎(chǔ)上，探究黃芩苷、蘆丁、綠原酸的致敏性［7?8］。通過建立氣相色譜指紋圖譜測定揮發(fā)性成分并探究其化學(xué)成分相關(guān)性［9］。通過液質(zhì)聯(lián)用法探討雙黃連注射液與藥材之間化學(xué)成分的相關(guān)性［10］。

本研究基于HPLC 指紋圖譜分析，通過對(duì)照品比對(duì)鑒定得到11 個(gè)指紋峰和2 個(gè)非指紋峰。針對(duì)指紋圖譜中未知指紋峰，以金銀花連翹中間體為原料，純化目標(biāo)化合物并鑒定為連翹酯苷H，并開展雙黃連注射液中指紋峰的歸屬研究及雙黃連注射液、中間體、藥材化學(xué)成分的相關(guān)性分析，以期為研究化學(xué)成分的傳遞規(guī)律以及完善雙黃連注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ME204 型萬分之一天平、MS105DU 型十萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；Milli?Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；FW80 型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；HYC?940 型醫(yī)用冷藏箱（4 ℃）（青島海爾特種電器有限公司）；Centrifuge 5424R 型臺(tái)式離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Agilent 1200 制備液相色譜儀（美國Agilent 公司）；核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號(hào)110753?201817，純度＞96.80%）、咖啡酸（批號(hào)110885?201703，純度＞99.70%）、連翹酯苷A（批號(hào)111810?201707，純度＞97.20%）、黃芩苷（批號(hào)110715?201821，純度＞95.40%）、黃芩素（批號(hào)111595?201808，純度＞97.90%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)P27A10L87091）、隱綠原酸（批號(hào) P30A9L69104）、異連翹酯苷 A（批號(hào)Y14M6H1）、金絲桃苷（批號(hào)Y20J7X9353）、異綠原酸C（批號(hào)P25J9L66496）、千層紙素A?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷（批號(hào)Y19D5J1）、白楊素?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷（批號(hào)Y06S10H97162）對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。氘代二甲基亞砜（DMSO?d6），購自美國CIL 公司；D101 型大孔吸附樹脂，購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。色譜純甲醇、乙腈，購自美國Sigma?Aldrich 公司；分析純甲醇、乙腈，購自天津市康科德科技有限公司；色譜純冰乙酸，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

雙黃連注射液，金銀花連翹中間體、黃芩中間體，金銀花、連翹、黃芩均由河南福森藥業(yè)有限公司提供。金銀花、連翹、黃芩由河南福森藥業(yè)有限公司質(zhì)量控制部檢驗(yàn)人員楊先玉鑒定為正品，樣品保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。2018 年至2019 年生產(chǎn)的20 批雙黃連注射液編號(hào)為S1～S20，金銀花連翹中間體編號(hào)為Z1～Z10（Z1、Z2、Z6 為粉末，其他批次為浸膏）、黃芩中間體（粉末）編號(hào)為P1～P10，金銀花、連翹、黃芩編號(hào)分別為J1～J5、L1～L5、H1～H5。

2 方法

2.1 雙黃連注射液指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 YMC?Pack ODS?A 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）?0.25% 冰乙酸（B），梯度洗脫（0～15 min，15%～35% A；15～20 min，35% A；20～50 min，35%～100% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長350 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液制備

2.1.2.1 雙黃連注射液 精密吸取雙黃連注射液2 mL，置于10 mL 量瓶中，加入50%甲醇混勻、定容，即得。

2.1.2.2 中間體 精密稱取金銀花連翹中間體適量粉末0.25 g（浸膏約0.40 g），分別置于10 mL 量瓶中，加入50%甲醇至刻度，溶解，搖勻，12 000 r／min 離心10 min，精密吸取上清液1 mL，置于5 mL 量瓶中，加50%甲醇混勻、定容，即得。

精密稱取黃芩中間體粉末0.1 g，置于10 mL 量瓶中，加入 2 mL DMSO 助溶，再加入甲醇混 勻、定容，12 000 r／min離心10 min，精密吸取上清液1 mL，置于5 mL量瓶中，加入50%甲醇混勻、定容，即得。

2.1.2.3 藥材 精密稱取金銀花、連翹、黃芩藥材粉末各0.2 g，分別置于100 mL 圓底燒瓶中，加入50 mL 超純水浸漬30 min，加熱回流提取2次，每次1 h，放冷，濾過，合并濾液，搖勻，12 000 r／min 離心10 min，精密吸取各1 mL上清液，加入50%甲醇1 mL，搖勻，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸C 對(duì)照品采用10%甲醇溶解；異連翹酯苷A 對(duì)照品采用30%甲醇溶解；連翹酯苷A、金絲桃苷對(duì)照品采用50% 甲醇溶解；白楊素?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷、千層紙素A?7?O?β?D?葡萄糖醛酸、黃芩素、黃芩苷對(duì)照品采用甲醇溶解，制成含新綠原酸32.77 μg／mL、綠原酸43.00 μg／mL、隱綠原酸37.73 μg／mL、咖啡酸6.050 μg／mL、異連翹酯苷A 74.66 μg／mL、連翹酯苷A 77.40 μg／mL、金絲桃苷1.659 μg／mL、異綠原酸C 16.83 μg／mL、白楊素?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷22.04 μg／mL、千層紙素A?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷56.00 μg／mL、黃芩素10.12 μg／mL、黃芩苷120.0 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.4 雙黃連注射液指紋圖譜生成 采用雙黃連注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（WS3?B?2014?96）中指紋圖譜研究方法，開展雙黃連注射液的指紋峰歸屬及注射液?中間體?原料藥材的相關(guān)性研究。

2.2 指紋峰的富集和鑒定

2.2.1 大孔樹脂富集條件 取金銀花連翹中間體浸膏80 g，加水溶解得到溶液，上樣于處理好的D101 型大孔吸附樹脂柱（2 kg），依次用水、5%乙醇、7%乙醇、10%乙醇、13% 乙醇、15% 乙醇、20% 乙醇、乙醇洗脫，并采用HPLC 示蹤分析未知指紋峰化合物，收集13%、15%乙醇洗脫液，減壓濃縮，得濃縮液100 mL。

2.2.2 制備液相色譜條件 一次制備條件為ZORBAX SB?C18色譜 柱（21.2 mm× 250 mm，7 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）?水（B），梯度洗脫（0～30 min，30%～70% A）；體積流量10 mL／min；進(jìn)樣量0.6 mL（13%、15% 乙醇洗脫濃縮液用甲醇1∶1 稀釋）。二次制備條件為ZORBAX SB?C18色譜柱（21.2 mm×250 mm，7 μm）；流動(dòng)相甲醇?水（38∶62）；體積流量10 mL／min；進(jìn)樣量1 mL（一次制備目標(biāo)流分的濃縮液）。

3 結(jié)果

3.1 雙黃連注射液指紋圖譜色譜峰的歸屬 按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備雙黃連注射液、中間體、藥材供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，發(fā)現(xiàn)在40 min 內(nèi)色譜峰基本洗脫完全，色譜圖見圖1。

圖1 雙黃連注射液HPLC 色譜圖

結(jié)合化合物的保留時(shí)間和光譜數(shù)據(jù)，通過對(duì)照品比對(duì)開展雙黃連注射液指紋峰的歸屬研究，共鑒定得到12 個(gè)化合物。在雙黃連注射液、金銀花連翹中間體、金銀花供試品溶液中均檢測到新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C，歸屬于金銀花；在雙黃連注射液、金銀花連翹中間體、連翹供試品溶液均檢測到異連翹酯苷A、6 號(hào)峰（未鑒定）、連翹酯苷A，歸屬于連翹；在雙黃連注射液，金銀花連翹中間體，金銀花、連翹供試品溶液均檢測到咖啡酸、金絲桃苷，歸屬于金銀花、連翹；在雙黃連注射液、黃芩中間體、黃芩藥材中均檢測到黃芩苷、千層紙素A?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷、白楊素?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷、黃芩素，為黃芩的特征化合物，歸屬于黃芩。

3.2 雙黃連注射液、中間體、藥材中化合物的相關(guān)性分析 通過檢測10 批雙黃連注射液，10 批金銀花連翹中間體，10 批黃芩中間體，各5 批金銀花、連翹、黃芩藥材HPLC 色譜圖發(fā)現(xiàn)，雙黃連注射液、中間體、藥材指紋峰的相關(guān)性良好，藥材中主要成分均在中間體及雙黃連注射液中體現(xiàn)，中間體與雙黃連注射液的指紋峰在藥材中也可追溯，見圖2。

圖2 雙黃連注射液、中間體、藥材HPLC 色譜圖

3.3 未知指紋峰的結(jié)構(gòu)解析 按“2.2.1”項(xiàng)下方法富集包含未知指紋峰化合物的目標(biāo)流分，按“2.2.2”項(xiàng)下方法純化目標(biāo)化合物，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下確認(rèn)目標(biāo)化合物，見圖3。

圖3 6 號(hào)峰化合物色譜圖及其結(jié)構(gòu)

黃綠色粉末（二甲基亞砜），ESI?MSm／z：647 ［M＋Na］＋。1H?NMR（DMSO?d6，600 MHz）δ：6.54（1H，brs，H?2），6.40（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6），2.56（1H，m，H?7），3.75（1H，m，H?8），4.49（1H，d，J＝7.8 Hz，H?1′），3.84（1H，d，J＝10.8 Hz，H?6′），4.60（1H，brs，H?1″），7.06（1H，brs，H?2?），6.76（1H，d，J＝8.4 Hz，H?5?），7.01（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6?），7.48（1H，d，J＝16.2 Hz，H?7?），6.27（1H，d，J＝16.2 Hz，H?8?）；13C?NMR（DMSO，150 MHz）δ：129.1（C?1），115.4（C?2），144.9（C?3），143.5（C?4），116.2（C?5），119.6（C?6），35.1（C?7），69.8（C?8），100.2（C?1′），73.4（C?2′），74.1（C?3′），70.7（C?4′），75.5（C?5′），66.6（C?6′），100.7（C?1″），70.5（C?2″），70.3（C?3″），72.0（C?4″），68.4（C?5″），18.0（C?6″），125.5（C?1?），114.8（C?2?），145.6（C?3?），148.5（C?4?），115.8（C?5?），121.3（C?6?），145.2（C?7?），114.2（C?8?），165.7（C?9?）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11?12］ 報(bào)道基本一致，故鑒定為連翹酯苷H。

4 討論

4.1 雙黃連注射液中化學(xué)成分的歸屬研究 由圖4 可知，通過對(duì)雙黃連注射液指紋峰歸屬研究表明，第Ⅰ部分是以有機(jī)酸類成分為主的金銀花特征區(qū)，主要成分為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸，其中綠原酸的相對(duì)含量較高，以綠原酸為參照，新綠原酸、隱綠原酸在金銀花藥材、金銀花連翹中間體、雙黃連注射液中的相對(duì)比值依次降低；第Ⅱ部分主要為苯乙醇苷類成分為主的連翹特征區(qū)，包括異連翹酯苷A、連翹酯苷A、連翹酯苷H；第Ⅲ部分主要為黃芩中的黃酮類化合物，包括黃芩苷、千層紙素A?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷、白楊素?7?O?β?D?葡萄糖醛酸苷、黃芩素。

圖4 雙黃連注射液指紋圖譜

4.2 連翹酯苷H 制備液相色譜條件優(yōu)化 聚焦金銀花連翹中間體中連翹酯苷H 的分離制備，以HPLC 法為示蹤分析方法，采用大孔樹脂優(yōu)化篩選洗脫溶劑，富集目標(biāo)化合物，系統(tǒng)考察制備液相的流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)（甲醇?水、乙腈?水、甲醇?0.1%甲酸、乙腈?0.1% 甲酸），綜合考慮分離效果以及濃縮過程中可能發(fā)生的酸水解等問題，最終確定選用甲醇?水為流動(dòng)相洗脫系統(tǒng)，通過流動(dòng)相洗脫條件進(jìn)一步優(yōu)化分離得到連翹酯苷H。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)藥材、中間體、雙黃連注射液指紋圖譜進(jìn)行系統(tǒng)研究，闡明雙黃連注射液中化學(xué)成分的歸屬并鑒定得到11 個(gè)指紋峰以及2 個(gè)非指紋峰，雙黃連注射液指紋圖譜在不同批次注射液中具有良好的批間一致性，證明制劑?中間體?藥材化學(xué)成分具有良好的相關(guān)性和質(zhì)量傳遞性，為雙黃連注射液的質(zhì)量控制以及化學(xué)成分溯源提供依據(jù)。