王燕鴿，趙昕，張蕾，古心雨，雷嬋豪，李瑞芳

（河南科技大學基礎醫(yī)學院藥學系，河南 洛陽 471023）

血管煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶（NADPH oxidase，NOX）激活引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多在心肌肥大的發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用［1］，但是在心肌肥大發(fā)病中何種NOX亞型是有害的因素，何種NOX亞型是保護的因素尚不明確，NOX調控的下游信號通路還有待進一步研究［2］。前期研究顯示腎性高血壓大鼠心臟中NOX4的表達隨著心肌肥大程度增加呈上升趨勢，并且隨著心肌肥大的發(fā)展組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）的表達也發(fā)生了變化，提示NOX4與HDAC均參與了高血壓左心室肥大的發(fā)病過程［3-4］。探討NOX4在心肌肥大中的調節(jié)模式，進一步揭示NOX4對肥大信號的融合節(jié)點HDAC4和心肌肥大負性調控因子糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的調控機制，對研發(fā)心血管疾病的新靶點藥物具有重要價值。

材料和方法

1 動物

SPF級健康雌性SD大鼠，由河南科技大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（豫）2019-0002。實驗使用2～3日齡新生SD乳大鼠，分離培養(yǎng)原代心肌細胞。

2 主要試劑

內皮素1（endothelin-1，ET-1）購自Sigma；NOX4抑制劑GKT137831購自Selleck；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce；RNase抑制劑購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol核酸提取試劑購自Invitrogen；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）購自上海碧云天技術有限公司；抗NOX4抗體、抗p-Akt抗體、抗p-GSK-3β抗體和抗p-HDAC4抗體（Abcam）；抗p47phox抗體和抗α-tubulin抗體（Proteintech）。實驗引物由上海工生物工程股份有限公司設計合成。

3 方法

3.1 原代心肌細胞的分離與培養(yǎng)取2～3日齡的SD乳鼠進行原代心肌細胞分離培養(yǎng)。按照本實驗室建立改良的心肌細胞分離培養(yǎng)的方法進行［5］，乳鼠心肌組織用0.05 g/L DNase I和0.1%胰蛋白酶消化成單細胞懸液。差速貼壁分離后，加入含10%胎牛血清和0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，進行后續(xù)實驗。

3.2 實驗分組將心肌細胞以每孔1×108/L的濃度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清和0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養(yǎng)液，細胞于24 h貼壁后，用無菌PBS沖洗2～3遍清洗死細胞，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液24 h，不同試劑對其進行處理，并分為以下4組：（1）空白對照（control）組：以含10%血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；（2）GKT137831干預組：20μmol/L GKT137831處理24 h［6］；（3）ET-1造模組：0.1μmol/L ET-1處理24 h［5］；（4）GKT137831+ET-1干預組：20μmol/L GKT137831加0.1μmol/L ET-1處理24 h。

3.3 ROS檢測將1.5 h差速貼壁后的原代心肌細胞接種于6孔板中，37℃、5%CO2下的潮濕細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細胞貼壁。心肌細胞24 h貼壁后分組處理，再于37℃、5% CO2下的潮濕細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。用無菌PBS沖洗2～3遍，然后加入DHE染色試劑，使終濃度為5μmol/L，并在37℃、5% CO2下遠離光線的環(huán)境中一起孵育30 min。然后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細胞3次，熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

3.4 Western blot采用RIPA裂解液提取心肌細胞總蛋白。使用BCA蛋白質檢測試劑盒檢測蛋白質濃度，并將上樣量調整至50μg。通過10% SDS-PAGE分離蛋白，然后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Ⅰ抗于4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶（HRP）標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。ECL化學發(fā)光顯色法檢測蛋白條帶。用ImageJ軟件分析蛋白質條帶的灰度值。

3.5 RT-qPCR采用Trizol提取各組細胞的總RNA，用RNA純度分析儀檢測RNA濃度。參照逆轉錄試劑盒操作說明進行逆轉錄，總反應體積20μL：2×RT Mix 10μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，Oligo（dT）23VN（50μmol/L）1μL，random hexamers（50 mg/L）1μL，RNA 1μg。反應條件為：25℃5 min，50℃15 min，85℃2 min。參照RT-qPCR試劑盒操作說明進行RT-qPCR，總反應體積20μL：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0μL，0.4μL 50×ROX Reference Dye 2，1μL DNA，0.4μL引物。擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃1 min，95℃15 s，40個循環(huán)；60℃1 min，95℃15 s。然后，通過RT-qPCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線分析數(shù)據(jù)，分析所測基因的Ct值和特異性，以18S為內參照，分析ET-1誘導的心肌細胞中肥大標志物心房鈉尿因子（atrial natriuretic factor，ANF）和β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的mRNA表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

4 統(tǒng)計學處理

實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，應用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 7進行柱狀圖繪制。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 抑制NOX4對ET-1誘導的心肌細胞表面積及ANF和β-MHC mRNA表達的影響

心肌肥大的特征性表型變化包括心肌細胞表面積的增大，以及肥大標志物ANF和β-MHC的表達。因此，我們觀察了GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞表面積的影響。結果顯示，與空白對照組相比，ET-1刺激使心肌細胞表面積顯著增大；GKT137831處理可顯著減輕由ET-1引起的心肌細胞表面積的增加（P＜0.01），見圖1A。RT-qPCR檢測GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞肥大標志物ANF和β-MHC表達的影響，結果顯示，與空白對照組相比，ET-1刺激顯著提高了心肌細胞中ANF和β-MHC的mRNA表達水平，而GKT137831處理則顯著抑制了ET-1誘導的心肌細胞中ANF和β-MHC的mRNA表達（P＜0.01），見圖1B。

2 抑制NOX4對ET-1誘導的心肌細胞中ROS生成的影響

采用DHE染色法檢測GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞中ROS生成的影響。結果顯示，與對照組相比，ET-1刺激心肌細胞肥大后，顯著增加了心肌細胞中ROS的生成（P＜0.05），而GKT137831顯著減少了ET-1誘導的肥大心肌細胞中ROS的產(chǎn)生（P＜0.01），見圖2。

3 抑制NOX4對ET-1誘導的心肌細胞中NOX表達的影響

采用Western blot法 檢測GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞中NOX表達的影響。結果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)過ET-1誘導后使肥大心肌細胞中NOX催化亞基NOX4和調節(jié)亞基p47phox的蛋白表達顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），而GKT137831顯著抑制了ET-1誘導的肥大心肌細胞中NOX4和p47phox的蛋白表達（P＜0.01），見圖3。

4 抑制NOX4對ET-1誘導的心肌細胞中Akt/GSK-3β通路的影響

為了研究抑制NOX4對ET-1誘導的心肌肥大的潛在機制以及ET-1和GKT137831對Akt/GSK-3β通路的影響，我們采用Western blot法檢測GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞中磷酸化Akt/GSK-3β蛋白水平的影響。結果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)過ET-1刺激后肥大心肌細胞中Akt和GSK-3β的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；而GKT137831處理顯著抑制了ET-1誘導的Akt和GSK-3β的磷酸化（P＜0.01），見圖4。

5 抑制NOX4對ET-1誘導的心肌細胞中HDAC4磷酸化的影響

采用Western blot法 檢測GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞中HDAC4磷酸化水平的影響，結果顯示，與空白對照組相比，由ET-1刺激的肥大心肌細胞經(jīng)過GKT137831處理后，GKT137831顯著降低了ET-1誘導的心肌細胞中HDAC4的磷酸化水平（P＜0.01），見圖5。

討 論

心力衰竭是多種心臟疾病的終末階段，是全球住院和死亡的主要原因之一，長期存在的心肌肥大可以導致心功能障礙和心力衰竭［7］。ET-1是一種血管收縮劑，可以刺激內皮素系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，促進心臟收縮，誘導心肌肥大［8］。在本研究中，通過在體外使用ET-1誘導的心肌肥大模型，我們檢測到NOX4是心肌肥大的正向調節(jié)因子，抑制NOX4可以防止ET-1誘導的心肌細胞中Akt/GSK-3β-HDAC4信號通路的激活，進而防止和逆轉心肌肥大。

Figure 1.Effects of GKT137831 on the surface area（A）and the ANF andβ-MHC mRNA levels（B）in ET-1-induced cardiomyocytes.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖1 GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞表面積及肥大標志物ANF和β-MHC mRNA表達的影響

Figure 2.Effects of GKT137831 on ROS generation in ET-1-induced cardiomyocytes.The scale bar=100μm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖2 GKT137831對ET-1誘導的心肌細胞ROS生成的影響

Figure 3.Effects of GKT137831 on the protein expression of NOX4 and p47phox in ET-1-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖3 GKT137831對ET-1刺激心肌細胞中NOX4和p47phox表達的影響

NOX的催化亞基在心血管細胞中包含多個亞型，它們在不同病理刺激因素作用下介導不同的病理過程，其作用機制尚不明確［9］。NOX4基因敲除可以顯著減輕動脈縮窄誘導的小鼠心肌肥大，改善心臟功能，減少ROS生成［10］；但是，也有不同的報道顯示NOX4基因敲除小鼠在慢性壓力負荷誘導下可以出現(xiàn)嚴重的擴張性心肌肥大和心臟收縮功能失調，而NOX4轉基因小鼠則受到保護［11］。研究者認為這種矛盾的產(chǎn)生主要是由于基因敲除的程度和手術的方法不同，但這種解釋沒有足夠的說服力，關于NOX各亞型在不同病理發(fā)展過程中的作用尚需大量的實驗來確證。因此，在本研究采用NOX4抑制劑GKT137831抑制肥大心肌細胞中NOX4的表達，結果觀察到其可以降低ET-1誘導的NOX4和p47phox的蛋白表達和ROS的生成，對ET-1刺激造成的氧化應激和病理性心肌肥大有一定的治療作用，進一步證明NOX4參與心肌肥大。

在小鼠心臟特異性過表達構成性激活的GSK-3β，可以抑制動脈縮窄或異丙腎上腺素刺激誘導的心肌肥大，也可以部分防止激活的鈣調磷酸酶引起的心肌肥大反應。ET-1和壓力超負荷都可能通過PI3K-Akt通路抑制GSK-3β，導致心肌肥大發(fā)生。這些研究表明GSK-3β在調節(jié)心肌肥大中起了至關重要的作用。GSK-3β可以磷酸化一系列的轉錄因子（NFAT、GATA4、c-Jun、c-Myc和cyclin D1），從而發(fā)揮抗心肌肥大作用［12］。在心肌肥大中NOX4是否通過調控GSK-3β，進而影響與肥大相關的轉錄因子的表達，是研究中要解決的另一個問題。因此，本研究抑制肥大心肌細胞中NOX4的表達，結果顯示GKT137831減弱了ET-1誘導的心肌細胞表面積增加、肥大標志物ANF和β-MHC的mRNA表達以及Akt和GSK-3β的磷酸化，表明抑制NOX4減輕了ET-1誘導的心肌細胞肥大，該作用與其抑制肥大信號通路Akt/GSK-3β的激活有關。

在心肌肥大十分復雜的信號網(wǎng)絡中，HDAC是一個重要的下游融合節(jié)點，調節(jié)許多與肥大相關的轉錄因子表達，可能是治療心肌肥大的一個很有意義和前景的作用靶標［13］。目前，國外關于HDAC的研究主要集中在抗腫瘤領域，已經(jīng)有一部分HDAC抑制劑開始用于臨床惡性腫瘤的治療［14］；而在心肌肥大發(fā)病中的研究，主要是通過基因敲除小鼠來闡明不同HDAC亞型的功能［15］。迄今為止，HDAC在高血壓心肌肥大中的作用及以其為靶標的藥物治療，國內外還未見報道。在本研究中，我們檢測了由ET-1誘導的肥大心肌細胞中HDAC4蛋白的磷酸化水平，顯示GKT137831可以顯著降低HDAC4蛋白的磷酸化。因此，GKT137831抑制ET-1誘導的心肌肥大反應，該作用與HDAC4有關。NOX4可以影響ET-1誘導的心肌細胞中HDAC4的磷酸化水平。

Figure 4.Effects of GKT137831 on the phosphorylation of Akt and GSK-3βin ET-1-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖4 GKT137831對ET-1刺激心肌細胞中Akt和GSK-3β磷酸化的影響

Figure 5.Effect of GKT137831 on the phosphorylaton of HDAC4 in ET-1-stimulated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs ET-1 group.圖5 GKT137831對ET-1刺激心肌細胞中HDAC4磷酸化的影響

綜上所述，本研究表明抑制NOX4顯著減輕了ET-1誘導的心肌細胞肥大，減少了NOX的表達和ROS的生成，防止了Akt/GSK-3β-HDAC4信號通路的激活，部分逆轉心肌肥大。該研究為NOX4在心肌肥大發(fā)病中的調節(jié)機制提供實驗依據(jù)。