趙富生，陳君，楊國宏，符禹玄，張可心，李媛媛，武庚

（牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000）

腦卒中又稱中風(fēng)，是一種常見的急性腦血管疾病。在我國每年約150萬～200萬病人死于腦血管疾病，死亡率為149.49/10萬人，其中大約80%為缺血性腦卒中［1］。腦缺血/再灌注損傷是缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其病理機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎癥和興奮性毒性等因素有關(guān)［2］。少突膠質(zhì)細(xì)胞是腦白質(zhì)的重要組成細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)元具有支持、營養(yǎng)、保護(hù)和形成髓鞘等多種功能，對(duì)低灌注非常敏感，極易發(fā)生缺血缺氧損傷［3］。因此，探尋有效的干預(yù)措施阻止或改善缺血/再灌注導(dǎo)致的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有重大意義。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有取材方便，易于擴(kuò)增，分泌包括外泌體在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，并能穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，因而被用于修復(fù)缺血性損傷和組織缺損［4-5］。在腦卒中大鼠模型中，通過尾靜脈注射BMSCs可減輕血腦屏障滲漏，促進(jìn)血管形成，減小腦梗死面積，改善大鼠神經(jīng)功能［6］。經(jīng)腹主動(dòng)脈移植BMSCs可通過增加損傷部位血管內(nèi)皮生長因子含量，進(jìn)而介導(dǎo)其下游磷脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信號(hào)通路促進(jìn)脊髓缺血再灌注損傷大鼠后肢功能恢復(fù)［7］。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［8］。有研究報(bào)道，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，NRG1）通過激活PI3K/AKT通路減輕膿毒癥引起的大鼠膈肌萎縮［9］。體外研究顯示，NRG1通過激活PI3K/AKT通路促進(jìn)耳蝸核神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，抑制細(xì)胞凋亡［10］。NRG1是一種含表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，參與神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育、髓鞘形成、突觸塑型以及神經(jīng)受體表達(dá)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［11］。研究表明，NRG1通過與其受體ErbB2、ErbB3和ErbB4結(jié)合，形成同源或異二聚體，激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，參與調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖和分化［12］。有研究報(bào)道，鞘內(nèi)注射NRG1蛋白能夠減輕炎癥反應(yīng)，減少硫酸軟骨素聚糖蛋白生成，抑制膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)［13］。將NRG1基因過表達(dá)的脂肪基質(zhì)干細(xì)胞注射到大鼠紋狀體，可通過NRG1-ErbB4通路促進(jìn)MAPK磷酸化，減小腦梗死面積，改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能［14］。我們的前期研究表明，NRG1基因過表達(dá)施萬細(xì)胞通過上調(diào)ErbB2和ErbB4表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元存活，改善脊髓損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能［15］。然而，上調(diào)BMSCs中NRG1的表達(dá)，能否提升BMSCs對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）所致少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，目前尚未見報(bào)道。因此，本研究擬構(gòu)建少突膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R模型，體外觀察NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制，旨在為腦卒中治療提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物1月齡SPF級(jí)SD大鼠6只，雌雄各半，體重90～100 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（黑）2019-003。

1.2 細(xì)胞大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞系CG4購自上海淳麥生物科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器pcDNA3.1（+）-NRG1-IRES/eGFP質(zhì)粒（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；Transwell（Corning）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）、calcein/PI染色試劑盒、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；ELISA試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆?；Fu-Gene6轉(zhuǎn)染試劑（Promega）；抗p21、p53、PI3K和AKT抗體（Proteintech）；抗p-PI3K和p-AKT抗體（Abcam）。ELx800酶標(biāo)儀（BioTek）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon）；MIC-101細(xì)胞缺氧氣室（Billups-rothenberg）。

2 方法

2.1 BMSCs分離培養(yǎng)頸椎脫臼處死大鼠，在無菌條件下分離股骨和脛骨，用10 mL DMEM沖洗骨髓腔，經(jīng)200目無菌篩網(wǎng)過濾沖洗液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)72 h后更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)［16］。

2.2 NRG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs取第3代BMSCs按1×108/L、每孔2 mL接種于6孔板中，分為對(duì)照（BMSCs）組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs（empty vector-BMSCs）組和NRG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs（NRG1-BMSCs）組。按照Fu-Gene6轉(zhuǎn)染試劑說明書用NRG1質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BMSCs，具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行［13］。轉(zhuǎn)染24 h和72 h，收集各組BMSCs，按照ELISA試劑盒說明測定各組細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)液中NRG1蛋白含量。

2.3 OGD/R模型建立和實(shí)驗(yàn)分組取CG4細(xì)胞更換無糖DMEM培養(yǎng)液，置于缺氧培養(yǎng)氣室中，通入混合氣體（95%N2和5%CO2）37℃培養(yǎng)2 h，更換完全培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)22 h，建立OGD/R細(xì)胞模型［17］。BMSCs（1.5×108/L）或NRG1-BMSCs（1.5×108/L，轉(zhuǎn)染72 h）與OGD/R處理CG4細(xì)胞（1.5×108/L）在Transwell中共培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照（control）組，CG4細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h；OGD/R組，OGD/R處理CG4細(xì)胞后，常規(guī)培養(yǎng)24 h；BMSCs組，OGD/R處理CG4細(xì)胞后，與BMSCs常規(guī)共培養(yǎng)24 h；NRG1-BMSCs組，OGD/R處理CG4細(xì)胞后，與NRG1-BMSCs常規(guī)共培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用倒置相差顯微鏡觀察CG4細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)取各組CG4細(xì)胞，以3×107/L接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，培養(yǎng)24 h，加MTT工作液（每孔10μL），孵育4 h后棄培養(yǎng)液，加100μL DMSO，酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定吸光度（A）。細(xì)胞活力（%）=（樣品平均A值-空白孔平均A值）/（對(duì)照組平均A值-空白孔平均A值）×100%。

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)取各組CG4細(xì)胞，以5×108/L接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，用20μL吸頭垂直于培養(yǎng)皿底部水平劃痕（0 h），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞分布并采集圖像。采用ImageJ軟件測量劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

2.6 氧化應(yīng)激檢測取各組CG4細(xì)胞，應(yīng)用DHE熒光探針檢測各組CG4細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，采用硫代巴比妥酸法測定CG4細(xì)胞裂解液中MDA含量，通過比色法檢測CG4細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）水平，實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.7 細(xì)胞衰老檢測取各組CG4細(xì)胞，室溫固定，加1 500μL SA-β-Gal染色工作液，光鏡下觀察拍照。各組隨機(jī)選取6個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞率并求均值。陽性細(xì)胞率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.8 細(xì)胞死亡率檢測參照文獻(xiàn)［18］，采用calcein/PI雙染法檢測細(xì)胞存活情況。紅色熒光代表PI染色細(xì)胞，為死亡細(xì)胞，綠色熒光代表calcein染色細(xì)胞，為存活細(xì)胞。取各組CG4細(xì)胞，接種于鋪有玻片6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，加calcein/PI染色工作液，37℃避光孵育30 min，收集CG4細(xì)胞玻片，激光共聚焦顯微鏡采集圖像。采用ImageJ分析細(xì)胞死亡率。細(xì)胞死亡率（%）=PI陽性細(xì)胞數(shù)/（calcein陽性細(xì)胞數(shù)+PI陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.9 LDH漏出率檢測參照文獻(xiàn)［19］操作。取各組CG4細(xì)胞，接種于96孔板中，對(duì)照組選取6孔加20μL LDH，作為樣品細(xì)胞最大酶活性對(duì)照孔，其它各組每孔加20μL細(xì)胞培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)1 h。收集各組CG4細(xì)胞培養(yǎng)液離心，取120μL上清液加入到新的96孔板中，各孔加60μL LDH工作液，室溫孵育30 min，酶標(biāo)儀在490 nm處測定A值。LDH漏出率（%）=（處理樣品A值-空白孔平均A值）/（細(xì)胞最大酶活性A值-空白孔平均A值）×100%。

2.1 0 Western blot檢測蛋白表達(dá)收集各組CG4細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，變性后每孔加等量蛋白（30μg），進(jìn)行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。然后將PVDF膜置于5% BSA中封閉2 h，加入β-actin、衰老相關(guān)蛋白（p21和p53）和PI3K/AKT通路蛋白（p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT）抗體（均以1∶1 000的比例稀釋），4℃孵育過夜。次日加相應(yīng)Ⅱ抗，37℃孵育2 h，加ECL發(fā)光試劑顯影成像，用ImageJ軟件參照β-actin分析目的蛋白條帶相對(duì)灰度值，計(jì)算目的蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs培養(yǎng)及NRG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs

細(xì)胞培養(yǎng)第1天，倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs呈球形、漂浮未貼壁，分布均勻；培養(yǎng)第3～5天，BMSCs呈多角形或長梭形，貼壁生長，形成多個(gè)散在細(xì)胞集落；傳代培養(yǎng)后，BMSCs排列緊密，呈束狀生長（圖1A～C）。BMSCs轉(zhuǎn)染NRG1質(zhì)粒后呈現(xiàn)明亮綠色熒光（圖1D～F）。ELISA結(jié)果顯示，與BMSCs組相比，NRG1-BMSCs組培養(yǎng)液上清和細(xì)胞裂解液中NRG1蛋白含量在轉(zhuǎn)染72 h均顯著升高（P＜0.05），見圖1G、H。

Figure 1.Rat BMSCs culture and NRG1 plasmid transfection in BMSCs.A and B：morphological changes of primary BMSCs on the 1st and 3rd days observed under inverted microscope；C：morphological changes of BMSCs in the 3rd generation observed under light microscope；D and E：BMSCs transfected with pcDNA3.1（+）-NRG1-IRES/eGFP plasmid were observed under inverted and fluorescence microscope，respectively；F：overlay of light microscope image and fluorescence image（green）of NRG1-BMSCs；G and H：comparison of NRG1 protein content in culture medium and cell lysate of the BMSCs，empty vector-BMSCs and NRG1-BMSCs groups.Scale bar=200μm in A，B and C；scale bar=100μm in D，E and F.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs BMSCs group；#P＜0.05 vs empty vector-BMSCs group.圖1 大鼠BMSCs培養(yǎng)及NRG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs

2 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R引起的CG4細(xì)胞形態(tài)變化及活力的影響

建立CG4細(xì)胞OGD/R模型，實(shí)驗(yàn)分組見圖2A。各組CG4細(xì)胞形態(tài)變化如圖2B所示，control組CG4細(xì)胞胞體透亮，呈梭形或三角形，突起細(xì)長；OGD/R組CG4細(xì)胞腫脹，胞體變暗，胞突減少；與NRG1-BMSCs共培養(yǎng)后，CG4細(xì)胞腫脹明顯減輕，漂浮細(xì)胞減少，細(xì)胞突起增多。MTT結(jié)果如圖2C所示，與control組相比，OGD/R組CG4細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組CG4細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.01），但未恢復(fù)到control組水平（P＜0.01）；BMSCs組與OGD/R組相比，細(xì)胞活力有所升高，但未見顯著差異（P＞0.05）。

Figure 2.Effects of NRG1-BMSCs on the morphological changes and viability of CG4 cells induced by OGD/R.A：schematic diagram of experimental grouping；B：the morphological changes of CG4 cells observed under light microscope（scale bar=100μm）；C：comparison of CG4 cell viability in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖2 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R引起的CG4細(xì)胞形態(tài)變化及活力的影響

3 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R導(dǎo)致的CG4細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，與control組相比，OGD/R組CG4細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組劃痕兩側(cè)細(xì)胞密度增大，空白面積明顯減少，劃痕愈合率顯著增加（P＜0.01），但仍低于對(duì)照組（P＜0.01）；BMSCs組與OGD/R組相比，劃痕愈合率增加，但未見顯著性差異（P＞0.05）。

Figure 3.Effects of NRG1-BMSCs on the migration of CG4 cells induced by OGD/R.Wound healing assay was performed，and the healing rate of the CG4 cells at 24 h in each group was determined.Scale bar=200μm.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖3 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R導(dǎo)致的CG4細(xì)胞遷移能力變化的影響

4 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

細(xì)胞氧化應(yīng)激檢測如圖4所示，與control組相比，OGD/R組CG4細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量顯著升高（P＜0.01），而T-AOC水平顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組CG4細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量顯著降低（P＜0.01），T-AOC水平顯著升高（P＜0.05），但未恢復(fù)到control組水平（P＜0.05）；BMSCs組與OGD/R組相比ROS、MDA和T-AOC水平均未見顯著性差異（P＞0.05）。

Figure 4.Effects of NRG1-BMSCs on oxidative stress in CG4 cells induced by OGD/R.A：representative DHE fluorescence staining images of CG4 cells in each group（red represented ROS，and blue represented nuclei stained with DAPI；scale bar=100μm）；B：quantitative analysis of DHE fluorescence intensity in each group；C and D：quantitative analysis of MDA content and T-AOC level in CG4 cells of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.圖4 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

5 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞衰老的影響

細(xì)胞衰老檢測如圖5所示，與control組相比，ODG/R組CG4細(xì)胞衰老陽性率及衰老相關(guān)蛋白p21和p53水平均顯著升高（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組衰老細(xì)胞陽性率及p21和p53蛋白水平顯著降低（P＜0.01），但未恢復(fù)到control組水平（P＜0.05）；BMSCs組與OGD/R組相比，CG4細(xì)胞衰老陽性率及p21和p53蛋白水平有所降低，但未見顯著差異（P＞0.05）。

6 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞死亡的影響

細(xì)胞死亡檢測如圖6A、B所示，與control組相比，OGD/R組PI陽性細(xì)胞顯著增多（P＜0.01）；與OGD/R組比，NRG1-BMSCs組PI陽性細(xì)胞顯著減少（P＜0.01），但未恢復(fù)到control組水平（P＜0.01）。LDH漏出率檢測如圖6C所示，與control組相比，ODG/R組CG4細(xì)胞LDH漏出率顯著增加（P＜0.01）；與OGD/R組相比，NRG1-BMSCs組CG4細(xì)胞LDH漏出率顯著降低（P＜0.01），但未恢復(fù)到control組水平（P＜0.01）。

Figure 5.Effects of NRG1-BMSCs on CG4 cell senescence induced by OGD/R.A：representative SA-β-Gal staining images of CG4 cells in each group（scale bar=100μm）；B：quantitative analysis of SA-β-Gal positive rate of CG4 cells in each group；C and D：the protein expression levels of p21 and p53 in CG4 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖5 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞衰老的影響

7 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘 導(dǎo) 的CG4細(xì) 胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與control組 相 比，OGD/R組CG4細(xì) 胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比 值 顯 著 降 低（P＜0.01）；與OGD/R組比，NRG1-BMSCs組CG4細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值顯著升高（P＜0.01），但仍未恢復(fù)到control組水平（P＜0.01）；BMSCs組與OGD/R組相比，CG4細(xì)胞p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值略有升高，但未見顯著性差異（P＞0.05），見圖7。

討 論

OGD/R細(xì)胞模型模擬了腦卒中的部分病理變化過程，是構(gòu)建腦缺血/再灌注體外模型的常用方法［20］。本研究采用CG4細(xì)胞建立OGD/R模型模擬腦卒中后少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷，體外探討NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對(duì)OGD/R導(dǎo)致的少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示NRG1-BMSCs能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞衰老以及死亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。據(jù)我們所知，這項(xiàng)研究首次明確了NRG1基因修飾的大鼠BMSCs對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R損傷的保護(hù)作用并提出了可能的保護(hù)機(jī)制。

NRG1在神經(jīng)元遷移、膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育以及神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系過程中發(fā)揮重要作用［21］。本研究通過全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，熒光顯微鏡觀察可見NRG1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染BMSCs。在NRG1-BMSCs培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中，NRG1蛋白水平顯著升高且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增加。該結(jié)果提示，將NRG1-BMSCs移植到腦缺血區(qū)可能增加局部NRG1含量，一定程度上改善損傷局部微環(huán)境，促進(jìn)受損神經(jīng)修復(fù)。

有研究報(bào)道，BMSCs培養(yǎng)液通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路減輕OGD/R導(dǎo)致的離體皮層神經(jīng)元損傷，抑制caspase-3蛋白表達(dá)，提高神經(jīng)元存活率，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［22］。本研究將NRG1-BMSCs與OGD/R處理后的CG4細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明NRG1-BMSCs能夠顯著提高CG4細(xì)胞的活力和遷移能力，提示NRG1能夠提升BMSCs對(duì)CG4細(xì)胞OGD/R損傷的保護(hù)作用。有研究報(bào)道，缺氧預(yù)處理的BMSCs可通過NRG1/PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及血管生成［23］。研究表明，將BMSCs與髓核細(xì)胞三維共培養(yǎng)可提高髓核細(xì)胞增殖活性，抑制β-半乳糖苷酶以及基質(zhì)金屬蛋白酶9表達(dá)，減輕TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞衰老［24］。本研究結(jié)果顯示，OGD/R引起CG4細(xì)胞衰老，也可破壞CG4細(xì)胞膜導(dǎo)致LDH外漏，誘發(fā)CG4細(xì)胞死亡。然而，NRG1-BMSCs能夠減輕OGD/R引起的細(xì)胞膜破壞，抑制CG4細(xì)胞死亡。此外，NRG1-BMSCs能夠抑制OGD/R介導(dǎo)的衰老相關(guān)蛋白p21和p53表達(dá)，延緩OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞衰老和死亡。我們推測，NRG1-BMSCs神經(jīng)保護(hù)作用可能與減輕OGD/R誘發(fā)的CG4細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。

Figure 6.Effects of NRG1-BMSCs on the death of CG4 cells induced by OGD/R.A：representative calcein/PI fluorescence staining images of CG4 cells in each group（red represented dead cells stained with PI，and green represented live cells stained with calcein；scale bar=100μm）；B：quantitative analysis of PI positive CG4 cells in each group；C：LDH leakage rate of CG4 cells in each group.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖6 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞死亡的影響

研究表明，腦缺血再灌注過程中產(chǎn)生大量氧自由基，誘發(fā)一系列細(xì)胞反應(yīng)，如線粒體損傷、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞衰老和凋亡［25］。因此，如何有效抑制氧化應(yīng)激被認(rèn)為是防治OGD/R誘發(fā)腦損傷潛在的靶點(diǎn)。有研究報(bào)道，小檗堿預(yù)處理的BMSCs分泌液能抑制過氧化叔丁醇誘導(dǎo)的ROS生成，減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的離體神經(jīng)元凋亡［26］。在本研究中，我們檢測了CG4細(xì)胞內(nèi)ROS水平和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，結(jié)果顯示OGD/R導(dǎo)致CG4細(xì)胞中ROS和MDA含量顯著增加，NRG1-BMSCs能夠減少OGD/R引起的ROS過量產(chǎn)生和MDA積累。該結(jié)果提示，NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷具有一定的抑制作用。此外，本研究表明，NRG1-BMSCs能夠恢復(fù)OGD/R處理后CG4細(xì)胞內(nèi)T-AOC含量。這些研究結(jié)果提示，NRG1-BMSCs能夠減輕OGD/R導(dǎo)致的CG4細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制ROS引起的CG4細(xì)胞衰老和死亡。PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，激活后與AKT蛋白結(jié)合，通過調(diào)節(jié)下游蛋白，參與細(xì)胞存活、生長及凋亡［27］。有研究報(bào)道，NRG1通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路減輕膿毒癥引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善大鼠膈肌功能［28］。本研究結(jié)果顯示，OGD/R抑制CG4細(xì)胞內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)。我們認(rèn)為OGD/R引起的氧化應(yīng)激可能抑制細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT通路磷酸化。然而，NRG1-BMSCs能夠提高OGD/R處理后CG4細(xì)胞內(nèi)PI3K和AKT磷酸化水平。因此，本研究認(rèn)為PI3K/AKT信號(hào)通路參與調(diào)控OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞衰老及死亡，NRG1-BMSCs對(duì)CG4細(xì)胞的保護(hù)作用可能與PI3K/AKT信號(hào)通相關(guān)。

Figure 7.Effects of NRG1-BMSCs on the expression of PI3K/AKT signaling pathway-related proteins in CG4 cells induced by OGD/R.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.圖7 NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，NRG1-BMSCs能夠抑制OGD/R誘導(dǎo)的CG4細(xì)胞衰老和死亡，其保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究為腦卒中治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但目前研究結(jié)果均為體外研究，下一步將采用動(dòng)物模型深入探究NRG1-BMSCs對(duì)OGD/R損傷的修復(fù)機(jī)制。