于文靜，楊苗，賀春香，金怡杰，李澤，李平，鄧思思，成紹武，宋禎彥

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力減退為主的神經(jīng)退行性疾病，研究顯示，糖代謝紊亂與AD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是重要的危險(xiǎn)因素之一［1］。流行病學(xué)調(diào)查表明，80%的AD患者患有糖尿病或有糖耐量方面的損傷，而2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）使阿爾茨海默病發(fā)生的概率增加了1.5～2.5倍，后期并發(fā)認(rèn)知功能障礙的概率較非糖尿病患者更高，并逐漸發(fā)展為散發(fā)型AD［2-3］。目前已有研究表明，通過注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）構(gòu)建的T2DM大鼠模型的海馬和皮質(zhì)中有β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）表達(dá)的增加及認(rèn)知功能的障礙［4］，T2DM小鼠模型跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶能力有所下降，且腦內(nèi)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達(dá)明顯增加［5］。因此，AD合并有T2DM病理改變的模型在探究AD病理機(jī)制及T2DM病理改變的過程中更為貼近疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律，AD動(dòng)物模型和T2DM動(dòng)物模型都有成熟的構(gòu)建方式，而AD合并T2DM動(dòng)物模型的發(fā)展尚在探尋過程中。本項(xiàng)工作通過對SD大鼠進(jìn)行高脂食糜灌胃，STZ腹腔及側(cè)腦室注射，觀察不同模型的血糖血脂及胰島素的改變，焦慮抑郁和學(xué)習(xí)記憶能力的變化，腦內(nèi)海馬區(qū)病理變化和炎癥反應(yīng)，探究AD合并T2DM動(dòng)物模型的構(gòu)建過程及AD和T2DM發(fā)病之間的聯(lián)系，為AD的防治提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

40只SPF級(jí)雄性SD大鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量180～200 g，周齡6～8周，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXK（湘）2019-0004，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供SPF級(jí)屏障系統(tǒng)，溫度（25±2）℃，由標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和水進(jìn)行飼養(yǎng)，12 h光照黑暗周期，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均符合倫理學(xué)要求，倫理審批號(hào)：202105100001。

2 主要試劑及儀器

STZ（S0130）購自Sigma-Aldrich；血糖試紙（EA-11）購自三諾生物傳感股份有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG；A110-1-1）、總膽固醇（total cholesterol，TC；A111-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C；A112-1-1）及低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C；A113-1-1）檢測試劑盒購自南京建成有限公司；胰島素ELISA試劑盒（E-EL-R3034）購自伊萊瑞特公司；熒光II抗（A21206，A32849）和TRIzol Reagent（15596018）購 自Invitrogen；Iba1抗 體（011-27991）購自Wako；GFAP抗體（bs-0199R）購自北京博奧森生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（0521751）購自近岸蛋白科技股份有限公司；SYBR Green預(yù)混液（MQ00401）購自上海莫納生物科技有限公司；TNF-α、IL-6和IL-1β引物合成于上海生工生物工程有限公司，突觸素I（synapsin I）抗體（ab254349）和突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）抗 體（ab18258）購自Abcam；β-actin抗體（AF7018）購自Affinity Biosciences。

CytationTM3型多功能酶標(biāo)儀（BioTek）；Tissue-FAXS Plus全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)（TissueGnostics）；低溫高速離心機(jī)（Thermo Fisher）；CFX96 Touch熒光定量PCR儀和ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（Bio-Rad）；SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)（瑞沃德生命科技有限公司）。

3 主要方法

3.1 T2DM大鼠模型構(gòu)建［6］適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠7 d后，隨機(jī)選擇20只大鼠進(jìn)行高脂食糜灌胃（10 mL·kg-1·d-1），成分為20%豬油、20%吐溫80、20%丙二醇、10%膽固醇、2%膽酸鈉和0.2%丙基硫氧嘧啶［7］，灌胃后第14天進(jìn)行STZ（檸檬酸緩沖液配制1% STZ注射液；25 mg/kg［8］）腹腔注射，剩余20只灌胃等體積生理鹽水及腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，注射后7 d測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG），觀察造模是否成功，F(xiàn)PG≥16.7 mmol/L為造模成功，常規(guī)喂養(yǎng)1周。

3.2 AD大鼠模型構(gòu)建300μL檸檬酸緩沖液配21.6 mg STZ（72 g/L）注射液，STZ腹腔注射后隨機(jī)選擇10只T2DM模型大鼠和10只未造模大鼠，第14天進(jìn)行雙側(cè)側(cè)腦室腦立體定位注射STZ，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版），每只大鼠按照2.4 mg/kg［9］最高注射體積不超過10μL，剩余20只注射等體積檸檬酸緩沖液。AD大鼠模型參考文獻(xiàn)構(gòu)建［10］，具體操作步驟如下：大鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，將大鼠的頭固定于腦立體裝置上，以前囟為起點(diǎn)，由前向后0.8 mm，距顱骨正中線左右移動(dòng)1.5 mm，深度3.7 mm，注射速度為1μL/min，注射完畢后留針5 min，出針后用棉球按住止血，涂抹碘伏，縫合傷口將大鼠放回待其蘇醒，觀察行動(dòng)無異常后放回。AD+T2DM模型10只死亡2只，死亡率為20%，存活率為80%；AD模型死亡1只，死亡率為10%，存活率為90%；T2DM模型死亡1只，死亡率為10%，存活率為90%。

3.3 實(shí)驗(yàn)分組依據(jù)造模過程，將40只大鼠分為假手術(shù)（sham）組、T2DM組、AD組和AD+T2DM組，每組10只。sham組：生理鹽水灌胃，腹腔和側(cè)腦室注射相對藥劑等體積檸檬酸緩沖液；T2DM組：高脂食糜灌胃，腹腔注射STZ，側(cè)腦室注射等體積檸檬酸緩沖液；AD組：生理鹽水灌胃，腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，側(cè)腦室注射STZ；AD+T2DM組：高脂食糜灌胃，腹腔和側(cè)腦室注射STZ。

3.4 曠場實(shí)驗(yàn)選取1 m×1 m曠場箱，四周用圍簾遮住防止干擾，使用SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)對大鼠的行動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤，將曠場分為周圍區(qū)、中心區(qū)和中央?yún)^(qū)，將大鼠放入中央?yún)^(qū)后立即離開并記錄行動(dòng)軌跡，5 min后將大鼠撈出，噴灑酒精對曠場箱進(jìn)行氣味消除，放入下一只大鼠。記錄的數(shù)據(jù)包括5 min內(nèi)水平移動(dòng)距離，進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)，中心區(qū)和周圍區(qū)滯留時(shí)間，行動(dòng)軌跡圖，直立次數(shù)，修飾次數(shù)等。

3.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)選擇直徑為1.6 m的恒溫游泳池，四周用圍簾遮住，將大鼠提前一天放入水迷宮中自由游泳120 s提前適應(yīng)。將水迷宮分成四個(gè)象限，每個(gè)象限筒壁上貼好醒目標(biāo)志物，選擇直徑12 cm的平臺(tái)放置在第一象限中心位置，加水至平臺(tái)上1 cm，使用SMART 3.0小動(dòng)物行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)對大鼠的行動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前5 d，將大鼠分別從四個(gè)象限面朝筒壁放到水中，記錄1 min內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間和軌跡，1 min內(nèi)找到平臺(tái)，記錄潛伏時(shí)間，若沒有找到，則記錄為60 s，并將其引導(dǎo)至平臺(tái)上學(xué)習(xí)20 s。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤去平臺(tái)，將大鼠從平臺(tái)象限對側(cè)象限放入水中，記錄穿梭平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間。

3.6 取材及保存按照體重使用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠四肢固定，U字形剪開腹腔，采血針于腹主動(dòng)脈取血約3 mL每只，將預(yù)冷的50 mL生理鹽水于左心室注入，剪開右心耳，注射至內(nèi)臟發(fā)白代表心臟灌注成功，斷頭取腦，左腦固定于多聚甲醛中，右腦分為皮質(zhì)和海馬兩部分，液氮凍存后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱。血液1 500×g離心15 min，取上層血漿，使用試劑盒檢測胰島素（insulin，INS）、TC、TG、LDLC、HDL-C等指標(biāo)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）。HOMA-IR=FPG（mmol/L）×INS（mIU/L）/22.5。具體時(shí)間安排如圖1所示。

Figure 1.Schematic representation of the experimental design.圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

3.7 HE染色左半腦固定后石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切成3μm厚度的切片，脫蠟復(fù)水后蘇木精染色5 min，流水沖洗后0.5%鹽酸乙醇分化1 min，PBS浸泡反藍(lán)，伊紅染色1 min，梯度脫水晾干，滴中性樹膠進(jìn)行封片，常溫晾干。

3.8 尼氏染色石蠟切片，烘烤脫蠟后，1%甲苯胺藍(lán)37℃浸染25 min，95 %乙醇分化30 s，梯度脫水，中性樹膠封片，蓋蓋玻片。

3.9 免疫熒光染色檢測海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞石蠟切片，65℃烘箱中1 h，二甲苯和乙醇脫蠟后進(jìn)行3% H2O2滅活，PBS洗3次，5% BSA和0.3% Triton X-100封閉1 h，孵育Ⅰ抗Iba1（1∶50）和GFAP（1∶100）4℃濕盒過夜，PBS洗3次，熒光Ⅱ抗Alexa Fluor 647（1∶500）和488（1∶800）避光室溫1 h，PBS洗后甩干滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑，反應(yīng)3 min后蓋上蓋玻片，避光保存，全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)掃描。

3.1 0 qPCR法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β表達(dá)取大鼠右半腦的一半海馬，TRIzol法提取海馬組織RNA，測RNA濃度，按照1 000 ng每20μL逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR染料法進(jìn)行qPCR檢測TNFα、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA相對表達(dá)量，TNF-α、IL-6和IL-1β引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.1 1 Western blot法檢測synapsin I和PSD95蛋白表達(dá)取大鼠右半腦的另一半海馬，加入鋼珠和含蛋白酶抑制劑的裂解液于低溫組織破碎儀中破碎海馬組織，離心取上清，用BCA試劑盒測定海馬組織蛋白濃度，配上樣緩沖液，于-20℃保存。電泳條件：80 V，30 min，120 V，90 min。0.45μm PVDF膜濕轉(zhuǎn)200 mA，2 h；5%脫脂牛奶搖床封閉1 h，TBST沖洗凈牛奶后孵育Ⅰ抗［synapsin I抗體（1∶1 000）、PSD95抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶8 000）］4℃過夜，TBST洗3次10 min，37℃孵育Ⅱ抗（1∶10 000）1 h，TBST洗3次10 min，ECL顯影液于凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，ImageJ軟件分析圖像。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，制作統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad Prism 8.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AD合并T2DM大鼠模型血糖、血脂和胰島素水平變化

與sham組相比，T2DM造模后大鼠的血糖有顯著上升（P＜0.01）（圖2A）；取材后對血漿進(jìn)行檢測，與sham組相比，T2DM組和AD+T2DM組的TC（P＜0.05）、TG（P＜0.05）和HOMA-IR（P＜0.01）升 高，LDL-C雖然有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），HDL-C和胰島素減少（P＜0.05）；與AD組相比，AD+T2DM組TG和HOMA-IR升高（P＜0.01），HDL-C降低（P＜0.05），見圖2B～G。

2 AD合并T2DM大鼠模型學(xué)習(xí)與記憶能力改變

Morris水迷宮結(jié)果顯示（圖3），與sham組相比，AD組、T2DM組和AD+T2DM組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有所下降，在定位航行實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)第5天三組找到平臺(tái)的時(shí)間均有增加（P＜0.05）；在空間探索實(shí)驗(yàn)中，撤去平臺(tái)后，AD組和AD+T2DM組的穿梭平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)象限停留時(shí)間均顯著減少，T2DM組平臺(tái)穿梭次數(shù)減少（P＜0.01）。

曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），與sham組相比，AD+T2DM組水平移動(dòng)總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間、中央?yún)^(qū)/周圍區(qū)滯留時(shí)間均有減少（P＜0.05），AD組直立次數(shù)和修飾次數(shù)都有減少（P＜0.05），與AD組相比，AD+T2DM組水平移動(dòng)總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)減少（P＜0.05）。

3 AD合并T2DM大鼠模型海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理形態(tài)的變化

對各組大鼠海馬CA2區(qū)進(jìn)行HE染色和尼氏染色，結(jié)果如圖5所示。HE實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sham組CA2區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大圓且清晰，AD組和T2DM組的CA2區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列稍有紊亂，可見細(xì)胞的核深染、固縮，神經(jīng)元有一定程度的損傷，AD+T2DM組細(xì)胞CA2區(qū)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核深染、固縮程度加深，神經(jīng)元受損加重。

尼氏染色結(jié)果顯示，sham組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小和數(shù)量正常，排列整齊緊密，胞質(zhì)內(nèi)有均染的尼氏體；AD組和T2DM組神經(jīng)元排列不規(guī)則，數(shù)量減少，細(xì)胞腫脹或皺縮，胞內(nèi)尼氏體減少；AD+T2DM組神經(jīng)元排列疏松，細(xì)胞呈空泡樣改變或皺縮，數(shù)量減少明顯，尼氏體減少，著色變淺，有散在的核溶解。

Figure 2.Fasting plasma glucose，insulin，HOMA-IR，TC，TG，LDL-C and HDL-C levels.Mean±SD.n=8.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs AD group.圖2 各組大鼠空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平

Figure 3.Learning and memory ability in each group tested by Morris water maze test.A：rat trajectory in Morris water maze test；B：mean escape latency on day 5；C：platform crossover；D：time in target quadrant.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group.圖3 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化

Figure 4.Activity of the rats detected by open-field test.A：rat trajectory in open-field test；B：total distance travelled；C：line crossing；D：time spent in open area；E：time spent in open/border area；F：rearing；G：grooming.Mean±SD.n=8.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs AD group.圖4 各組大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)情況

Figure 5.Pathological changes in hippocampal CA2 region observed by HE staining and Nissl staining.The scale bar=100μm.圖5 HE染色和尼氏染色觀察各組大鼠腦組織海馬CA2區(qū)病理學(xué)變化

4 AD合并T2DM大鼠模型海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況

免疫熒光染色結(jié)果顯示（圖6A），GFAP陽性表達(dá)為綠色熒光標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞，Iba1陽性表達(dá)紅色標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞，sham組小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞少有活化，AD組、T2DM組、AD+T2DM組的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均有活化，較sham組活化數(shù)量均顯著增加（P＜0.05），且AD+T2DM組更為顯著（P＜0.01），見圖6B～C。

Figure 6.Activation of microglia and astrocytes in the hippocampus observed by immunofluorescence.A：immunofluorescence of GFAP（green，astrocytes）and Iba1（red，microglia）in each group（blue：DAPI positive singal；scale bar=20μm）；B and C：quantificaton of GFAP and Iba1 expression.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs AD group.圖6 免疫熒光染色觀察海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況

5 AD合并T2DM大鼠模型海馬區(qū)炎癥因子的表達(dá)

通過qPCR結(jié)果顯示（圖7），與sham組對比，AD組和AD+T2DM組炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)均有顯著升高（P＜0.05），T2DM組的炎癥因子IL-6的mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。與AD組相比，AD+T2DM組IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

6 AD合并T2DM大鼠模型海馬區(qū)突觸蛋白synap-sin I和PSD95的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各組海馬區(qū)突觸蛋白PSD95和synapsin I的表達(dá)，與sham組相比，AD組和AD+T2DM組的突觸蛋白PSD95（P＜0.01）和synapsin I（P＜0.05）表達(dá)水平降低，T2DM組PSD95表達(dá)水平降低（P＜0.01），synapsin I表達(dá)雖有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖8。

Figure 7.Relative mRNA levels of TNF-α，IL-1βand IL-6 in the hippocampus detected by qPCR.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group；*P＜0.05 vs AD group.圖7 各組大鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的相對mRNA水平

Figure 8.The protein levels of PSD95 and synapsin I in the hippocampus determined by Western blot.Mean±SD.n=6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs sham group.圖8 Western blot檢測各組大鼠海馬區(qū)突觸蛋白synapsin I和PSD95的表達(dá)

討 論

AD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病常伴有糖代謝紊亂，T2DM是導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙常見的危險(xiǎn)因素之一。隨著社會(huì)的發(fā)展，經(jīng)濟(jì)水平的提高，人們的飲食習(xí)慣發(fā)生了很大的改變，高飽和脂肪、糖、高動(dòng)物蛋白而低纖維的飲食習(xí)慣，又稱作西式飲食（WS飲食），正在成為流行［11-12］。這種飲食習(xí)慣不僅使糖尿病的發(fā)病人數(shù)不斷增加，且缺乏重要的多酚、抗氧化劑和與大腦成熟相關(guān)的omega-3脂肪酸等，導(dǎo)致與海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力的下降和認(rèn)知功能的減退［13］。STZ可破壞胰島β細(xì)胞，減少胰島素的生成，常用作糖尿病模型。研究表明，低劑量STZ側(cè)腦室注射可引起腦內(nèi)胰島素信號(hào)穩(wěn)態(tài)被破壞以及能量代謝障礙，使大腦出現(xiàn)中Aβ沉積、tau過度磷酸化［14］、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥［15］、突觸功能障礙、胰島素抵抗［16］等與散發(fā)型AD類似的病理學(xué)變化，出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能受損及認(rèn)知障礙［17］，因此側(cè)腦室注射STZ是一種研究散發(fā)型AD病理機(jī)制的常見模型。本研究構(gòu)建AD合并T2DM大鼠模型，有利于探究AD和T2DM之間的發(fā)病聯(lián)系，進(jìn)一步揭示AD的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

高血糖、胰島素抵抗伴分泌不足和高血脂是T2DM的重要特征。本研究顯示，通過高脂食糜灌胃和STZ腹腔注射能夠引起SD大鼠和AD模型大鼠的生化指標(biāo)發(fā)生改變，通過高脂食糜灌胃和STZ腹腔注射后對血糖的監(jiān)測，顯示造模后兩周的血糖高達(dá)（25.24±5.13）mmol/L，符合標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病可以發(fā)生糖脂代謝的紊亂，顯著的胰島素抵抗會(huì)引發(fā)脂質(zhì)代謝異常，如血脂四項(xiàng)的改變，這與胰島素在一定程度上可以促進(jìn)脂蛋白分解有關(guān)。因此本研究對四組大鼠進(jìn)行了血糖、胰島素和血脂四項(xiàng)的檢測，表明T2DM組和AD+T2DM組的空腹血糖升高，胰島素水平降低、胰島素抵抗指數(shù)升高及血脂水平的升高。

曠場實(shí)驗(yàn)是對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新環(huán)境中的自主行為、探究行為和緊張度進(jìn)行評價(jià)的一種方法，能夠反應(yīng)大鼠焦慮抑郁的情緒傾向。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD+T2DM組水平移動(dòng)總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間、中央?yún)^(qū)/周圍區(qū)滯留時(shí)間均有減少，AD組直立次數(shù)和修飾次數(shù)都有減少，說明AD模型大鼠有抑郁傾向。焦慮和抑郁在AD中都很常見，有研究表明，有認(rèn)知功能障礙的AD患者抑郁癥狀更嚴(yán)重，且與葡萄糖代謝的關(guān)系十分密切［18］，抑郁還可以介導(dǎo)糖尿病和認(rèn)知能力受損［19］，但是本次實(shí)驗(yàn)中并未體現(xiàn)這樣的結(jié)果。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)表明T2DM組和AD+T2DM組大鼠均有學(xué)習(xí)記憶能力的缺失，說明T2DM也能在一定程度上引起學(xué)習(xí)記憶能力減退，這可能與血糖水平升高和胰島素水平降低有關(guān)。糖代謝為生命活動(dòng)提供能量和物質(zhì)保障，血糖升高對神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的影響很大，如引起神經(jīng)元內(nèi)糖醇堆積，神經(jīng)元得不到充足的血氧供應(yīng)而營養(yǎng)不足；葡萄糖濃度過高與蛋白質(zhì)、脂肪及核酸的氨基發(fā)生非酶催化反應(yīng)形成晚期糖基化終末產(chǎn)物（advances glycation end products，AGEs），AGEs被認(rèn)為是誘發(fā)AD和糖尿病的重要危險(xiǎn)因素；高血糖會(huì)引起胰島素抵抗，加速大腦衰老，破壞血腦屏障，改變其通透性，導(dǎo)致腦血管功能損傷，導(dǎo)致突觸可塑性和認(rèn)知功能的缺陷［20］。研究表明，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，高劑量胰島素被用于改善空間學(xué)習(xí)和記憶能力，而低劑量的胰島素會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知能力下降［21］。

腦內(nèi)慢性神經(jīng)炎癥是AD等神經(jīng)退行性疾病的重要標(biāo)志，小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，與糖原、能量供應(yīng)、炎癥介質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子的釋放有關(guān)［22］，通過小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化產(chǎn)生炎癥因子及能量營養(yǎng)供應(yīng)減少使得神經(jīng)元突觸受損。研究表明，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型在早期就有星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多、胞體變大和突起分支變長增多［23-24］；高糖促進(jìn)產(chǎn)生AGEs，也可以和小膠質(zhì)細(xì)胞表面的其細(xì)胞表面受體結(jié)合，NF-κB誘導(dǎo)活性氧并觸發(fā)促炎因子釋放，導(dǎo)致天然免疫的持續(xù)激活，從而分泌IL-1β、TNF-α和IL-6［25］。本研究通過免疫熒光染色和qPCR實(shí)驗(yàn)表明，T2DM可以在一定程度上促進(jìn)AD大鼠的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增多，海馬區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)增加，加重腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。

神經(jīng)元是大腦發(fā)揮正常功能的重要細(xì)胞單元，突觸是神經(jīng)元之間聯(lián)系的部位，在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用。PSD95是突觸后致密區(qū)豐富的蛋白，可作為興奮性突觸的標(biāo)記物，與突觸后信號(hào)傳遞、損傷后的神經(jīng)修復(fù)及樹突棘形成有關(guān)［26-27］；synapsinI是表達(dá)在突觸前膜囊泡的一種突觸標(biāo)志物，參與囊泡融合及遞質(zhì)的釋放，與突觸可塑性、信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)系密切［28］。為探究腦內(nèi)炎癥反應(yīng)對于神經(jīng)元的具體影響，本項(xiàng)工作從腦內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)及突觸蛋白PSD95，synapsinI表達(dá)入手，證明T2DM可以促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)生形態(tài)改變，核深染、固縮，細(xì)胞內(nèi)尼氏體減少，伴有突觸蛋白的減少代表突觸功能受損，神經(jīng)元正常的生理功能受到損害，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能受損。

綜上，本研究采用高脂食糜灌胃加STZ腹腔注射聯(lián)合STZ側(cè)腦室注射的方法，構(gòu)建AD合并T2DM大鼠模型，同時(shí)也證明T2DM由于其糖脂代謝和胰島素代謝的紊亂，可能會(huì)加重AD的腦內(nèi)病變，從而在外部行為學(xué)上有所體現(xiàn)，為探究AD與T2DM發(fā)病之間的聯(lián)系提供了動(dòng)物模型的參考。然而，盡管動(dòng)物模型已經(jīng)盡可能參考前人經(jīng)驗(yàn)，但是其成模標(biāo)準(zhǔn)的評價(jià)是否完善，是否與真實(shí)的人體疾病病理過程相符合仍然有待商榷，并且因?yàn)锳D的病理機(jī)制復(fù)雜，很難構(gòu)建出能夠囊括AD全部特征的動(dòng)物模型。制作更加實(shí)用有效、經(jīng)濟(jì)方便、且更符合人類疾病發(fā)展的動(dòng)物模型，仍需進(jìn)一步探索。