余榮蘭 楊建冬 袁秀澤 鄧杰華 黃招光 周云峰?

（1.淳安縣第一人民醫(yī)院， 浙江 杭州311700； 2.宜春市食品藥品檢驗(yàn)所， 江西 宜春336000）

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根［1］，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便等功效［2?4］。當(dāng)歸屬于食藥同源藥材，需求量大［5］，近年來(lái)，隨著野生資源日益枯竭，當(dāng)歸市場(chǎng)價(jià)格水漲船高，出現(xiàn)了各種混淆品和偽品［6?8］，其中在當(dāng)歸中摻入價(jià)格較為低廉的獨(dú)活栽培品較為常見(jiàn)。獨(dú)活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescensMaxim.F.biserrata Shan et Yuan 的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、通痹止痛的功效，其與當(dāng)歸同屬傘形科，外觀性狀差異小，但臨床功效有較大區(qū)別，不可混用。

龍膽瀉肝丸（片）是由多種藥味組成的復(fù)方制劑［9?10］，具有清肝膽、利濕熱的功效，方中含有當(dāng)歸。鑒于市場(chǎng)上有獨(dú)活混淆品出現(xiàn)，其有可能會(huì)帶入以當(dāng)歸為藥味的中藥復(fù)方制劑中，有必要開展龍膽瀉肝制劑中獨(dú)活篩查的探索性研究。當(dāng)歸主要含藁本內(nèi)酯、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I等［11］，獨(dú)活含有蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、二氫歐山芹醇等成分［12］。蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯是獨(dú)活的定量特征成分，基于此，本研究建立可測(cè)定蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC?MS／MS），篩查龍膽瀉肝丸（片）中當(dāng)歸原料是否摻雜獨(dú)活，為龍膽瀉肝制劑整體質(zhì)量的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

H?class／xevo 超高效液相色譜?三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；PL?S60 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。蛇床子素（批號(hào)110822?201710，含量99.5%）、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品（批號(hào)111583?201605，含 量98.6%）。當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)120927?201617）、獨(dú)活對(duì)照藥材（批號(hào)120940?201612）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；柴胡（江西臻藥堂藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)200504，產(chǎn)地山西）、龍膽（江西藥都堂中藥飲片有限公司，批號(hào)20190301，產(chǎn)地云南）、黃芩（江西康齊樂(lè)中藥材有限公司，批號(hào)20210401，產(chǎn)地山西）、梔子（江西康齊樂(lè)中藥材有限公司，批號(hào)20210201，產(chǎn)地江西）、鹽澤瀉（江西寶芝堂中藥飲片有限公司，批號(hào)201001，產(chǎn)地四川）、木通（湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，批號(hào)201101，產(chǎn)地湖北）、車前子（樟樹市慶仁中藥飲片有限公司，批號(hào)201905353，產(chǎn)地江西）、當(dāng)歸（安徽百歲堂中藥飲片有限公司，批號(hào)210501，產(chǎn)地甘肅定西）、地黃（鄭州瑞龍制藥股份有限公司，批號(hào)21050405，產(chǎn)地河南）、炙甘草（江西康齊樂(lè)中藥材有限公司，批號(hào)20201101，產(chǎn)地甘肅），由宜春市食品藥品檢驗(yàn)所楊建冬主任中藥師鑒定為正品；龍膽瀉肝丸（片）共49批，均來(lái)源于零售和連鎖藥店，生產(chǎn)企業(yè)涉及26 家。實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他試劑均為質(zhì)譜級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 質(zhì)譜和色譜條件 電噴霧離子源；碰撞氣氬氣；脫溶劑氣體流量1 000 L／h；錐孔氣流量50 L／h；ESI 溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度600 ℃；毛細(xì)管電壓0.5 V；采用多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）模式，正離子掃描，其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。Waters ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸?乙腈，梯度洗脫（0～2 min，25% A；2～5 min，25%～75% A；5～8 min，75%A；8～8.5 min，75%～25% A；8.5～11 min，25% A）；體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 溶液制備 蛇床子素對(duì)照品溶液：稱取蛇床子素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含蛇床子素164.0 ng 的溶液，精密量取2、5、10、20、25 mL 分別置50 mL 量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品溶液：稱取二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL 含二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯99.59 ng 的溶液，再精密量取2、5、10、20、25 mL 分別置50 mL 量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液：取本品適量，片劑、水丸和濃縮丸研細(xì)，大蜜丸加等量硅藻土混勻研細(xì)，取2 g，置100 mL 量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。自制樣品溶液：稱處方比例（龍膽120 g、柴胡120 g、黃芩60 g、梔子60 g、澤瀉120 g、木通60 g、車前子60 g、當(dāng)歸60 g、地黃120 g 和炙甘草60 g）自制原粉混合樣品約2 g，制備樣品溶液。陰性樣品溶液：稱取不含當(dāng)歸的原粉混合樣品約2 g，制備陰性樣品溶液。當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液：稱取當(dāng)歸對(duì)照藥材約2 g，制備當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液。獨(dú)活對(duì)照藥材溶液：稱取獨(dú)活對(duì)照藥材約2 g，置100 mL 量瓶中，加入甲醇約80 mL，超聲處理30 min，放冷，精密吸取續(xù)濾液0.1 mL 置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 取蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比為3∶1 時(shí)的對(duì)照品質(zhì)量濃度作為儀器檢測(cè)限。

表2 各成分線性關(guān)系

2.4 專屬性試驗(yàn) 對(duì)陰性樣品、對(duì)照藥材、自制樣品、供試品、混合對(duì)照品溶液依次測(cè)定，見(jiàn)圖1。蛇床子素對(duì)照品保留時(shí)間約為6.85 min，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品保留時(shí)間約為7.05 min，陰性樣品、對(duì)照藥材和正常樣品均無(wú)色譜峰，說(shuō)明樣品中各藥味對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好。

圖1 各成分色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，蛇床子素峰面積RSD 為2.07%，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯峰面積RSD 為1.64%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，每份約2 g，測(cè)定含量。蛇床子素含量RSD 為2.34%，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量RSD 為2.75%，重復(fù)性結(jié)果符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，在0、1、2、4、8、16 h測(cè)定峰面積。蛇床子素含量RSD 為3.16%，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量RSD 為3.74%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取樣品6份，各約1 g，置于100 mL量瓶中，精密加入混合對(duì)照品溶液（蛇床子素573.9 ng／mL、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯149.4 ng／mL）5 mL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，見(jiàn)表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 含量測(cè)定 49 批龍膽瀉肝丸（片）有3 批樣品檢出獨(dú)活特征性成分，其中片劑2 批、丸劑1批，檢出率約為6%。檢出蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的有3 批樣品，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4，每批樣品平行測(cè)定2 次。蛇床子素含量范圍為0.005 615～2.601 μg／g，二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯含量范圍為0.038 43～0.823 2 μg／g。

表4 含量測(cè)定結(jié)果（μg／g）

3 討論

通過(guò)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)蛇床子素的主要碎片離子為245、189、159、131、103、77；二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的碎片離子為329、311、251、229、187、83，有3 批樣品檢出與各對(duì)照品相應(yīng)的碎片離子。通過(guò)離子豐度比可知，樣品與蛇床子素對(duì)照品的離子豐度比基本一致，而與二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品的有一定差別，但獨(dú)活對(duì)照藥材與樣品基本相同，分析原因可能是二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯對(duì)照品屬于純度較高的化合物，其他雜質(zhì)對(duì)其無(wú)干擾，而樣品中的二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯來(lái)自獨(dú)活，可能存在二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的立體異構(gòu)體的干擾［13］，因?yàn)樵衔锱c立體異構(gòu)體的離子豐度比會(huì)有差異［14］。蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯屬于香豆素類化合物［15］，在水煎液中的轉(zhuǎn)移率為2.3%～10.1%和2.3%～12.2%［16］。根據(jù)藥典中獨(dú)活含有蛇床子素的下限值和片劑的生產(chǎn)工藝可知，該樣品中當(dāng)歸原料可能混有的獨(dú)活量最高可達(dá)19%，超過(guò)雜質(zhì)最大值（3%），說(shuō)明該企業(yè)的當(dāng)歸原料可能存在問(wèn)題，采用混有較多獨(dú)活的當(dāng)歸進(jìn)行投料生產(chǎn)。

本研究采用的HPLC?MS／MS 法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、分析速度快、樣品需要量少、樣品前處理簡(jiǎn)單，能夠有效檢出龍膽瀉肝丸（片）中蛇床子素和二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯的含量情況，篩查當(dāng)歸原料是否摻雜獨(dú)活，為龍膽瀉肝制劑整體質(zhì)量的控制提供借鑒。