李子恒， 陶正恒， 楊元喜， 汪宏章， 吳 威， 游秋云， 王 平*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065，2.湖北太子藥業(yè)有限公司，湖北 荊門 448000)

失眠癥在情境、復(fù)發(fā)或慢性等特點(diǎn)的基礎(chǔ)上影響大部分人口，并且是醫(yī)療實(shí)踐中最常見的主訴之一[1]。目前，用于緩解失眠癥狀的西藥主要是安定類藥物[2-3]，因易產(chǎn)生藥物殘留效應(yīng)、成癮性等影響而不適合長(zhǎng)期服用。而中藥治療失眠可以規(guī)避西藥帶來的負(fù)面影響，具有一定的優(yōu)越性。

腦寧糖漿主要由鮮松針、大棗、靈芝組成，具有補(bǔ)益氣血、養(yǎng)心安神的功效，是治療心神不寧所致的失眠、心煩、焦慮等癥狀的安全有效的中成藥。經(jīng)多年臨床治療證明[4]，其對(duì)睡眠障礙、焦慮、植物神經(jīng)功能紊亂等神經(jīng)官能癥有較好療效，且毒性較小，無耐受性和成癮性。本研究通過對(duì)腦寧糖漿的鎮(zhèn)靜催眠作用及其作用機(jī)制，以及治療失眠的特點(diǎn)進(jìn)行探索，以期為臨床治療失眠提供指導(dǎo)和思路，為腦寧糖漿的藥性理論和應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠260只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2020-0001。所有小鼠均飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(25±1)℃，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，觀察其一般狀況。本研究獲得湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HUCMS202110001)。

1.2 試劑與藥物 腦寧糖漿(批號(hào)20210301，湖北太子藥業(yè)有限公司)；舒樂安定購(gòu)自湖北中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院。三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(批號(hào)10006818、80109218、10009218，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，批號(hào)163629、161387，美國(guó)Fisher Scientific公司)；甲酸(分析純，批號(hào)FA-3116-0500，美國(guó)ACS恩科化學(xué)公司)。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)對(duì)照品(批號(hào)43811、H-093，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；戊巴比妥鈉(德國(guó)默克公司)；RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Master Mix(批號(hào)G3013、G3330、G3322，武漢賽維爾生物科技有限公司)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 儀器 自發(fā)活動(dòng)分析系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；TP-1200C型電子天平(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司)；AL204型電子精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；6420 Triple Quad LC/MS三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國(guó)Agilent Technologies公司)；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；KDC2046型低速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；CFX96型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Epoch酶標(biāo)檢測(cè)儀(美國(guó)BioTeK公司)。

2 方法

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 分組及給藥 將144只小鼠隨機(jī)分為4組，即正常組，舒樂安定組，腦寧糖漿低、高劑量組，每組36只。舒樂安定組小鼠灌胃給予0.26 mg/kg舒樂安定，腦寧糖漿低、高劑量組灌胃給予15.6、31.2 mL/kg腦寧糖漿(約人臨床等效劑量的2、4倍)，正常組灌胃給予等體積生理鹽水，給藥容量為0.2 mL/10 g，每天1次，連續(xù)14 d。對(duì)小鼠自主活動(dòng)、閾上劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間、閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.2 小鼠自主活動(dòng)檢測(cè) 隨機(jī)取各組小鼠12只，第14天給藥后30 min進(jìn)行小鼠自主活動(dòng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)前打開自主活動(dòng)分析系統(tǒng)，設(shè)置好程序，實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，讓其適應(yīng)2 min，隨后點(diǎn)擊分析系統(tǒng)，記錄3 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)時(shí)間及活動(dòng)路程。

2.1.3 閾上劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間檢測(cè) 隨機(jī)取各組小鼠12只，第14天給藥后30 min，戊巴比妥鈉按閾上劑量(預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得引起100%小鼠睡眠的最小劑量，為33 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射，記錄30 min內(nèi)小鼠睡眠潛伏期[腹腔注射至翻正反射消失(1 min以上)的時(shí)間]及睡眠持續(xù)時(shí)間(翻正反射消失至恢復(fù)的時(shí)間)。

2.1.4 閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠睡眠時(shí)間檢測(cè) 隨機(jī)取各組小鼠12只，第14天給藥后30 min，戊巴比妥鈉按閾上劑量(預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得引起90%～100%的小鼠翻正反射不消失的最大劑量，為28.5 mg/kg)進(jìn)行腹腔注射，以小鼠翻正反射消失1 min以上者為發(fā)生睡眠，統(tǒng)計(jì)30 min內(nèi)各組小鼠的入睡率，公式為入睡率=(各組入睡小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù))×100%。

2.2 腦寧糖漿對(duì)睡眠剝奪小鼠的作用

2.2.1 造模、分組及給藥 將75只小鼠隨機(jī)分為5組，即正常組，模型組，舒樂安定組及腦寧糖漿低、高劑量組，每組15只，按“2.1.1”項(xiàng)下方法給藥，模型組灌胃給予等體積生理鹽水。從第15天開始，使用改良的多平臺(tái)水環(huán)境法建立急性睡眠剝奪模型，除正常組外，其余各組小鼠連續(xù)睡眠剝奪72 h，其間持續(xù)給藥。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)取小鼠全腦，每組3只，置于福爾馬林溶液中固定，進(jìn)行免疫組化染色；其余分離出大腦皮層和下丘腦，用于各指標(biāo)檢測(cè)。

2.2.2 LC-MS法檢測(cè)大腦皮層中GABA、5-HT含量 精密稱取小鼠大腦皮層50 mg，采用LC-MS法檢測(cè)大腦皮層中GABA、5-HT含量。

2.2.3 ELISA法檢測(cè)下丘腦中orexin水平 取小鼠下丘腦適量，研碎后加入9倍量0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，迅速勻漿，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，計(jì)算orexin水平。

2.2.4 免疫組化法檢測(cè)大腦皮層中GABAAR表達(dá) 取經(jīng)過福爾馬林固定的小鼠全腦，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，烘烤、脫蠟后置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA室溫封閉30 min，加一抗(GABAAR，1∶300)4 ℃孵育過夜，滴加二抗室溫孵育50 min，滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照，采用Image-Pro Plus軟件分析平均光密度值，以其表示蛋白表達(dá)程度。

2.2.5 RT-qPCR法檢測(cè)大腦皮層中GABAAR、5-HT1AR和下丘腦orexinmRNA表達(dá) 取小鼠大腦皮層和下丘腦適量，研碎后提取mRNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA按照SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)，結(jié)果以2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 腦寧糖漿對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響 與正常組比較，各給藥組小鼠自主活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)路程、活動(dòng)速度減少(P<0.01)，見表2。

表2 腦寧糖漿對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

3.2 腦寧糖漿對(duì)閾上劑量戊巴比妥鈉的協(xié)同作用 與正常組比較，各給藥組小鼠睡眠潛伏期縮短(P<0.01)，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.01)，見表3。

表3 腦寧糖漿對(duì)閾上劑量戊巴比妥鈉的協(xié)同作用

3.3 腦寧糖漿對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率的影響 與正常組比較，各給藥組入睡率增加(P<0.01)，見表4。

表4 腦寧糖漿對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉所致小鼠入睡率的影響

3.4 腦寧糖漿對(duì)小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量升高(P<0.05，P<0.01)，見表5。

表5 腦寧糖漿對(duì)小鼠大腦皮層中GABA、5-HT含量的影響

3.5 腦寧糖漿對(duì)小鼠下丘腦orexin水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠下丘腦orexin水平升高(P<0.01)；與模型組比較, 各給藥組小鼠下丘腦orexin水平降低(P<0.01)，見表6。

表6 腦寧糖漿對(duì)小鼠下丘腦orexin水平的影響

3.6 腦寧糖漿對(duì)小鼠大腦皮層中GABAAR蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組GABAAR陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值降低(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組GABAAR陽(yáng)性表達(dá)平均光密度值升高(P<0.05，P<0.01)，見表7、圖1。

表7 腦寧糖漿對(duì)小鼠大腦皮層中GABAAR蛋白表達(dá)的影響

3.7 腦寧糖漿對(duì)小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1AR和下丘腦中orexinmRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1ARmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，下丘腦中orexinmRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1ARmRNA表達(dá)升高(P<0.05，P<0.01)，下丘腦中orexinmRNA表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見表8。

表8 腦寧糖漿對(duì)小鼠大腦皮層中GABAAR、5-HT1AR和下丘腦中orexin mRNA表達(dá)的影響

4 討論

GABA與5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)及其受體與睡眠關(guān)系密切[5]。GABA主要分布在大腦皮質(zhì)、下丘腦、腦干、海馬、基底神經(jīng)節(jié)等部位，被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中啟動(dòng)和維持睡眠的重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[6-7]，具有抵抗焦慮[8]、鎮(zhèn)定神經(jīng)以及治療癲癇等功能[9]。研究應(yīng)用睡眠剝奪箱、水平臺(tái)、限制行動(dòng)、腹腔注射對(duì)氯苯丙胺等方法復(fù)制失眠模型，并觀察下丘腦和皮層內(nèi)GABA水平[10-14]，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物腦內(nèi)不同部位的GABA水平均下降，GABAAR表達(dá)下調(diào)，經(jīng)過中藥干預(yù)后GABA水平上升，GABAAR表達(dá)回升，使失眠癥狀得到改善。5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦皮層以及神經(jīng)突觸內(nèi)含量很高[15]，破壞動(dòng)物的5-HT能神經(jīng)元或神經(jīng)末梢，會(huì)使腦內(nèi)5-HT減少，導(dǎo)致失眠。同時(shí)多項(xiàng)研究表明，睡眠剝奪模型大鼠5-HT1AR水平下降，給予干預(yù)手段后，睡眠剝奪模型大鼠5-HT1AR水平升高，睡眠得到改善[16-17]。有關(guān)抑郁癥研究提出的“單胺類神經(jīng)遞質(zhì)能假說”認(rèn)為，5-HT與其他中樞神經(jīng)遞質(zhì)一起參與行為活動(dòng)、情緒、食欲調(diào)節(jié)等，5-HT能神經(jīng)傳遞機(jī)能的減退不僅導(dǎo)致情緒障礙如抑郁與焦慮的形成，而且還可通過影響其它遞質(zhì)的活動(dòng)誘發(fā)抑郁癥[18]，因此，5-HT是抑郁癥與睡眠障礙在神經(jīng)遞質(zhì)上共性的體現(xiàn)所在。在抑郁癥的發(fā)病過程中，GABA功能缺陷也伴隨其中，并且與5-HT系統(tǒng)具有交互調(diào)節(jié)作用，GABA可以增強(qiáng)5-HT系統(tǒng)的功能，GABA受體拮抗劑可以影響5-HT系統(tǒng)表現(xiàn)出類似抑郁的癥狀[19]。

orexin是由下丘腦神經(jīng)元分泌的具有興奮性的神經(jīng)肽類物質(zhì)，其主要生理功能之一為調(diào)節(jié)睡眠和晝夜節(jié)律[20-21]，睡眠剝奪會(huì)引起其在腦中水平的改變[22-23]。失眠癥患者的orexin水平高于正常睡眠者，且與失眠的過程和嚴(yán)重程度有關(guān)[24]。另有研究指出[25-26]，在睡眠狀態(tài)下orexin神經(jīng)元處于相對(duì)靜息狀態(tài)，在清醒狀態(tài)下orexin神經(jīng)元激活即刻早期基因c-fos，放電頻率增加，并且腦脊液中orexin水平增多，因此，在睡眠開始時(shí)orexin水平會(huì)下降，睡眠剝奪后orexin-A分泌增加。各項(xiàng)研究指出，中醫(yī)藥治療失眠的機(jī)制之一可能是調(diào)節(jié)orexin及其受體。張強(qiáng)等[27]發(fā)現(xiàn)，和胃安神方可下調(diào)失眠模型大鼠下丘腦中orexin-A水平以改善睡眠；全世建等[28]對(duì)睡眠剝奪大鼠使用交泰丸方灌胃，發(fā)現(xiàn)其鎮(zhèn)靜催眠作用可能是抑制了大鼠下丘腦促覺醒神經(jīng)遞質(zhì)orexin-A水平。

綜上所述，腦寧糖漿既可減少小鼠自主活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)路程、活動(dòng)速度，也能縮短小鼠睡眠潛伏期并延長(zhǎng)睡眠時(shí)間，且呈劑量依賴性，表明腦寧糖漿在臨床建議劑量范圍內(nèi)具有良好的鎮(zhèn)靜安神作用，其機(jī)制可能是通過上調(diào)GABA、5-HT含量和GABAAR、5-HT1AR表達(dá)，下調(diào)orexin表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。