姚 靜， 楊曉寧*， 朱 平， 張 超， 王玉龍， 孫欣光*

(1.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100085；2.山西振東道地藥材開(kāi)發(fā)有限公司，山西 長(zhǎng)治 047100)

中藥所含成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣，具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[1-3]。中藥指紋圖譜通過(guò)對(duì)中藥化學(xué)成分輪廓進(jìn)行描述，可整體、宏觀地進(jìn)行質(zhì)量控制，能較全面地反映其種類(lèi)及數(shù)量，是具有系統(tǒng)性、特征性的一種方法[4-7]。

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，為豆科黃芪屬植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.ongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫等功效[8]，主要含有皂苷、黃酮、多糖等成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗心腦損傷等藥理活性[9-11]，藥用歷史悠久，臨床應(yīng)用廣泛，市場(chǎng)需求大，種植廣泛,并且不同產(chǎn)地黃芪中黃酮、皂苷等6種成分含量具有一定差異[12]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃芪指紋圖譜已有較多報(bào)道[13-18]，大多采用高效液相串聯(lián)紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)[15]、高效液相串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)[17,19]，少數(shù)采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)[16]，但皂苷采用HPLC-UV分析時(shí)很難達(dá)到理想的響應(yīng)和檢測(cè)，而HPLC-ELSD靈敏度較低，都不能全面表征該藥材所含成分的整體性。電霧式檢測(cè)器(CAD)作為通用型檢測(cè)器，其響應(yīng)不依賴于化合物的分子結(jié)構(gòu)，靈敏度比HPLC-ELSD更高，尤其適于紫外吸收較弱的皂苷等成分[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立黃芪HPLC-CAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，分析不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量差異，以期其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

U3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛公司，配置LPG-3400SD泵、WPS-3000TRS自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3200柱溫箱、Corona Veo RS電霧式檢測(cè)器)；Agilent 385-ELSD型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、Agilent 1260 VWD紫外檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司)；XSE205DU電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)111920-201606，純度97.6%)、黃芪甲苷(批號(hào)110781-201717，純度96.9%)、芒柄花素(批號(hào)3523，純度98.2%)、黃芪皂苷Ⅰ(批號(hào)6107，純度99.0%)、黃芪皂苷Ⅱ(批號(hào)3258，純度100.0%)對(duì)照品(上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司)；7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷(批號(hào)Y31D10H107318，純度98%)、美的紫檀苷(批號(hào)P21N9F75533，純度98%)、黃芪異黃烷苷(批號(hào)P31D10F107320，純度98%)對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司)；芒柄花苷(批號(hào)PS000671，純度98%)、異黃芪皂苷Ⅰ(批號(hào)PS020461，純度98%)對(duì)照品(成都普斯生物科技有限公司)。甲酸為色譜純(批號(hào)190284，美國(guó)賽默飛公司)；乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)；其他試劑均為分析純。

25批黃芪(編號(hào)S1～S25)具體信息見(jiàn)表1，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)高建平教授鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、芒柄花素、黃芪皂苷I、黃芪皂苷Ⅱ、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷、美的紫檀苷、黃芪異黃烷苷、芒柄花苷、異黃芪皂苷Ⅰ對(duì)照品適量，80%甲醇制成每1 mL含上述成分各約0.1 mg的溶液，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取藥材粉末2 g(過(guò)4號(hào)篩)，置于100 mL圓底燒瓶中，加入80%甲醇50 mL，加熱回流2 h，濾過(guò)，濾渣以20 mL甲醇洗滌，回收甲醇，蒸干，殘?jiān)? mL純水復(fù)溶，加入已處理好的SP825柱上，用純水、甲醇各60 mL洗脫，分別收集洗脫液，蒸干，甲醇洗脫部位用80%甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～3 min，15%A；3～5 min，15%～17%A；5～8 min，17%～20%A；8～25 min，20%～43%A；25～35 min，43%～60% A；35～45 min，60%～98% A；45～55 min，98% A)；體積流量1.5 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度70 ℃，載氣體積流量1.5 L/min；Corona Ultra電霧式檢測(cè)器，霧化器氮?dú)?，霧化室溫度50 ℃。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別為0.02%～0.96%、1.43%～4.97%，說(shuō)明各主要色譜峰保留時(shí)間與峰面積基本一致，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別為0.02%～0.23%、1.81%～4.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、4、8、12、24、36 h在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD分別為0.02%～0.57%、1.28%～3.95%，表明溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC-CAD指紋圖譜建立 將25批樣品色譜圖導(dǎo)入2012年《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》軟件，以S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正匹配生成共有模式，見(jiàn)圖1，發(fā)現(xiàn)有20個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)后鑒定出10個(gè)，其中14號(hào)峰(黃芪皂苷Ⅰ)峰形良好，峰面積穩(wěn)定，分離度理想，而且為主要藥理活性成分，故選擇其作為參照峰(S)。再測(cè)定相似度，結(jié)果見(jiàn)表2，可知均大于0.83，表明藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，不同產(chǎn)地之間一致性較好。

表2 25批樣品相似度

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

2.5.1 聚類(lèi)分析 將20個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2～3。由此可知，各批樣品可聚為3類(lèi)，第1類(lèi)為內(nèi)蒙古產(chǎn)的7批(S19～S25)，相似度0.931～0.979；第2類(lèi)為山西產(chǎn)的8批(S11～S18)，相似度0.833～0.942；第3類(lèi)為甘肅產(chǎn)的10批(S1～S10)，相似度0.914～0.977，表明HPLC-CAD指紋圖譜與產(chǎn)地具有較好的相關(guān)性，而且不同產(chǎn)地可被有效地區(qū)分開(kāi)[14,16]。

2.5.2 主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)將20個(gè)共有峰峰面導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)軟件Ezinfo，得到PCA、PLS-DA得分分布圖，見(jiàn)圖4。

由此可知，25批樣品可分為3類(lèi)，第1類(lèi)為內(nèi)蒙古產(chǎn)的7批(S19～S25)，第2類(lèi)為山西產(chǎn)的8批，第3類(lèi)為甘肅產(chǎn)的10批(S1～S10)；甘肅、內(nèi)蒙產(chǎn)樣品分布比較靠近，而山西產(chǎn)樣品分布比較分散，可能是由于種植方式不同所致[20-21]；變量重要性投影值(VIP值)大于1的共有峰有10個(gè)，分別為1(毛蕊異黃酮葡萄糖苷)、17、18、13(黃芪皂苷Ⅱ)、4(美的紫檀苷)、11(芒柄花素)、9、3(芒柄花苷)、5(黃芪異黃烷苷)、2號(hào)色譜峰，其相對(duì)峰面積見(jiàn)圖5，可作為差異標(biāo)志物。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了黃芪HPLC-CAD指紋圖譜，與HPLC-ELSD、HPLC-UV相比具有更高的靈敏度和重復(fù)性，能表征出更多的色譜峰信息，更適用于該藥材中無(wú)紫外吸收化合物的檢測(cè)，并且HPLC-CAD檢測(cè)器中色譜峰峰面積與含量呈正比，可反映各成分含量占比[22]。通過(guò)與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，共指認(rèn)出10種成分，包括6種黃酮、4種皂苷，均為黃芪入血成分[23-24]，前者具有抗炎、抗氧化、抗菌等功效[25-27]，后者具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)等活性[28-30]。

結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地黃芪化學(xué)成分存在差異[16]，山西產(chǎn)樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量顯著高于甘肅、內(nèi)蒙產(chǎn)樣品中，而黃芪皂苷含量與甘肅產(chǎn)樣品中相近，顯著高于內(nèi)蒙產(chǎn)樣品中[12]；25批樣品中成分種類(lèi)基本一致，但其相對(duì)含量存在差異；黃芪HPLC-CAD指紋圖譜與產(chǎn)地具有較好的相關(guān)性；10種成分可作為區(qū)分不同產(chǎn)地黃芪的差異標(biāo)志物。

綜上所述，HPLC-CAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)操作簡(jiǎn)便，專(zhuān)屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，能有效分析不同產(chǎn)地黃芪質(zhì)量的差異性，可為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及臨床使用提供參考。