朱盼盼， 蔣 健， 陳君灝， 喬 昀， 元唯安， 梁群梅， 賀 敏

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

尿路感染是病原體入侵泌尿系統(tǒng)引起的感染性疾病，尿道致病性大腸桿菌是導(dǎo)致尿路感染發(fā)生的主要病原體[1-3]。膀胱上皮細(xì)胞通過(guò)連接復(fù)合體將相鄰的上皮細(xì)胞緊密相連，共同構(gòu)成膀胱上皮屏障，其在防御病原體中發(fā)揮著重要作用，上皮屏障受損是尿路感染的主要病理特征之一[3-7]。上皮屏障的結(jié)構(gòu)和功能與連接復(fù)合體中的關(guān)鍵連接蛋白閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白(Occludin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)關(guān)系密切，尿路感染時(shí)，上皮細(xì)胞ZO-1、Occludin、E-cadherin表達(dá)下調(diào)，上皮屏障受損[4,7]。

尿感方(授權(quán)專利號(hào)ZL200910201845.6)由馬齒莧、蒲公英組成，具有抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[8-12]，是治療尿路感染的有效方劑[13]。膀胱上皮細(xì)胞與致病菌共存于尿液環(huán)境中，尿液中藥物的作用對(duì)于尿路感染的研究更為直接，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，尿感方含藥尿液具有免疫調(diào)節(jié)的作用[14-16]，但其對(duì)膀胱上皮屏障的影響尚不清楚。因此，本研究利用Transwell小室建立單層膀胱上皮細(xì)胞尿道致病性大腸桿菌感染模型，通過(guò)菌落檢出數(shù)量化穿過(guò)單層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)和酚紅透過(guò)率的方法，觀察尿感方對(duì)膀胱上皮屏障完整性和通透性的影響，并從對(duì)關(guān)鍵連接蛋白表達(dá)影響的角度探討其作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株 SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人膀胱癌HTB-9細(xì)胞，目錄號(hào)TCHu1，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物 馬齒莧(配方顆粒，批號(hào)20020481，每袋1.5 g，相當(dāng)于飲片15 g)、蒲公英(配方顆粒，批號(hào)20041181，每袋2 g，相當(dāng)于飲片15 g)，均由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 菌株 尿道致病性大腸桿菌J96(編號(hào)ATCC700336)購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，接種于盧里亞-貝爾塔尼培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后用PBS配制成細(xì)菌懸液備用，實(shí)驗(yàn)前通過(guò)細(xì)菌比濁儀估算細(xì)菌濃度。

1.4 試劑 盧里亞-貝爾塔尼瓊脂平板，購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；胎牛血清、0.25%胰酶，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PBS、酚紅、慶大霉素，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；CCK-8細(xì)胞活性計(jì)數(shù)試劑盒，購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司；ZO-1兔抗IgG、Occludin兔抗IgG、E-cadherin兔抗IgG、β-actin鼠抗IgG、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA裂解液(強(qiáng))、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、顯影定影試劑，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；PVDF膜，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.5 儀器 細(xì)菌比濁儀(法國(guó)BioMerieux公司)；SpectraMaxi3x多功能酶標(biāo)(美國(guó)Molecular Devices公司)；普通倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Western Blot電泳系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)。

2 方法

2.1 含藥尿液制備 尿感方飲片劑量(馬齒莧70 g、蒲公英55 g)換算為配方顆粒劑量，按課題組前期的方法[14-16]制備大鼠空白尿液和含藥尿液，大鼠(生藥25.0 g/kg)按“3D-2T-1H”法給藥，即每天灌胃給藥2次，連續(xù)3 d，次日早晨再灌胃給藥1次，收集末次給藥后3 h內(nèi)尿液，4 000 r/min離心15 min，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過(guò)濾，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 藥物毒性實(shí)驗(yàn) 含藥尿液及空白尿液的安全范圍采用CCK-8法確定，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng) HTB-9細(xì)胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化后傳代或種板。

2.4 細(xì)胞分組及給藥 HTB-9細(xì)胞分為正常組，模型組，10%、5%大鼠含藥尿液組及10%、5%大鼠空白尿液組。各尿液組用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋尿液至終體積分?jǐn)?shù)為5%、10%，然后與細(xì)胞共同培養(yǎng)；模型組和正常組用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基與細(xì)胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h。

2.5 造模 HTB-9細(xì)胞接種在Transwell小室上室中，隔天按“2.4”項(xiàng)下方法分組和給藥，培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌3次，下室加入培養(yǎng)基，上室除正常組外，均加入細(xì)菌/細(xì)胞比例(MOI)為100的尿道致病性大腸桿菌J96，培養(yǎng)造模2 h[17]。

2.6 酚紅透過(guò)率實(shí)驗(yàn) 按“2.5”項(xiàng)下方法造模結(jié)束后，采用慶大霉素保護(hù)法清除胞外細(xì)菌，用PBS洗滌后，棄去洗液并吸干殘液，上室加入含酚紅(15 mg/L)的培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)，下室加入PBS，37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，分別取上、下室溶液，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度(OD)值[18-19]。相對(duì)酚紅透過(guò)率=[(OD實(shí)驗(yàn)組下室溶液/OD實(shí)驗(yàn)組上室溶液)/(OD正常組下室溶液/OD正常組上室溶液)]×100%。

2.7 測(cè)定穿過(guò)單層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù) 采用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)以量化穿過(guò)單層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)，以模型組細(xì)菌數(shù)的均值歸一化計(jì)算各組的相對(duì)菌落計(jì)數(shù)。參考文獻(xiàn)[17]方法，按照“2.5”項(xiàng)下造模結(jié)束后，用移液器從下室取出100 μL培養(yǎng)液，倍比稀釋并涂于盧里亞-貝爾塔尼瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后計(jì)數(shù)。

2.8 Western blot法檢測(cè)ZO-1、Occludin、E-cadherin蛋白表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，按“2.4”項(xiàng)下方法分組和給藥，培養(yǎng)結(jié)束后，用PBS洗滌3次，除正常組外加入MOI為100的尿道致病性大腸桿菌J96，正常組加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)造模2 h。采用慶大霉素保護(hù)法清除胞外細(xì)菌后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣本電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1 h，加入一抗工作液4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入二抗工作液室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL法發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶，用AlphaEase FC軟件分析灰度值，計(jì)算目標(biāo)蛋白與β-actin(內(nèi)參)的灰度值比例。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 藥物毒性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)10%大鼠含藥尿液或10%大鼠空白尿液預(yù)處理24 h的細(xì)胞存活率均大于90%，提示10%及以下濃度的含藥尿液和空白尿液對(duì)HTB-9細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

3.2 尿感方對(duì)細(xì)胞間通透性的影響 如圖1所示，與正常組比較，模型組酚紅透過(guò)率增加(P<0.01)，提示尿道致病性大腸桿菌損傷了細(xì)胞屏障，使細(xì)胞之間的間隙增大；與模型組比較，5%、10%大鼠空白尿液組酚紅透過(guò)率均無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示大鼠空白尿液對(duì)尿道致病性大腸桿菌所損傷的細(xì)胞間隙沒(méi)有明顯影響；與5%、10%大鼠空白尿液組比較，5%、10%大鼠含藥尿液組酚紅透過(guò)率均降低(P<0.05)，提示尿感方含藥尿液對(duì)尿道致病性大腸桿菌所損傷的細(xì)胞間隙具有一定的修復(fù)作用。

3.3 尿感方對(duì)穿過(guò)單層細(xì)胞細(xì)菌數(shù)的影響 如圖2所示，模型組有大量細(xì)菌穿過(guò)單層細(xì)胞；與模型組比較，5%、10%大鼠空白尿液組穿過(guò)單層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示大鼠空白尿液對(duì)尿道致病性大腸桿菌所損傷的細(xì)胞屏障沒(méi)有明顯影響；與10%大鼠空白尿液組比較，10%大鼠含藥尿液組穿過(guò)單層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)減少(P<0.05)，提示尿感方含藥尿液對(duì)尿道致病性大腸桿菌所損傷的細(xì)胞屏障具有一定的修復(fù)作用。

3.4 尿感方對(duì)尿道致病性大腸桿菌感染膀胱上皮細(xì)胞關(guān)鍵連接蛋白表達(dá)的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組上皮細(xì)胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)，提示尿道致病性大腸桿菌影響了HTB-9細(xì)胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)；與模型組比較，5%、10%大鼠空白尿液組ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，提示空白尿液對(duì)尿道致病性大腸桿菌所致的HTB-9細(xì)胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)無(wú)明顯影響；與10%大鼠空白尿液組比較，10%大鼠含藥尿液組 ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與5%大鼠空白尿液組比較，5%大鼠含藥尿液組 ZO-1和E-cadherin蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，提示尿感方含藥尿液能夠逆轉(zhuǎn)尿道致病性大腸桿菌所致的HTB-9細(xì)胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。

4 討論

膀胱上皮屏障是抵御病原體入侵的重要防線，膀胱上皮細(xì)胞之間互相接觸，通過(guò)連接復(fù)合體特化加固上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞連接方式構(gòu)成了膀胱上皮屏障[3-5]。連接復(fù)合體參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞之間的粘附和細(xì)胞旁路運(yùn)輸，其對(duì)上皮屏障功能的正常發(fā)揮起著重要作用。正常生理情況下，膀胱上皮屏障只允許小分子物質(zhì)通過(guò)屏障；當(dāng)尿道致病性大腸桿菌感染時(shí)，尿道致病性大腸桿菌可通過(guò)直接和間接的方式作用于連接復(fù)合體，影響連接復(fù)合體中連接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)受損、屏障功能異常，進(jìn)而膀胱腔內(nèi)的病原體、有害物質(zhì)等從上皮屏障侵入深層組織，引起一系列病理生理的改變(疾病發(fā)生或加重)[4-6]。因此，保護(hù)膀胱上皮屏障為臨床防治尿路感染提供了新的思路[7]。

通過(guò)測(cè)定酚紅從Transwell小室上室滲透至下室的量，可以評(píng)價(jià)細(xì)胞間隙的通透性和單細(xì)胞層的完整性[18-19]；另外，測(cè)定病原體從上室穿過(guò)單細(xì)胞層至下室的數(shù)量也是評(píng)價(jià)單細(xì)胞層完整性的良好方法[17]。本研究結(jié)果顯示，尿感方含藥尿液中的藥物能修復(fù)尿道致病性大腸桿菌所損傷的細(xì)胞間隙，降低細(xì)胞間的通透性，使從細(xì)胞間隙透出的酚紅量減少，穿過(guò)單層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量減少。

ZO-1、Occludin和E-cadherin是膀胱上皮屏障連接復(fù)合體中的關(guān)鍵連接蛋白，其對(duì)屏障結(jié)構(gòu)和功能的維持有重要作用。ZO-1位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜，是連接復(fù)合體中最重要的緊密連接蛋白，它是細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的支架，將跨膜蛋白與骨架蛋白相連，并通過(guò)跨膜信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞屏障的功能[20-21]。ZO-1表達(dá)的下降會(huì)影響細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和屏障功能的發(fā)揮，它是評(píng)價(jià)細(xì)胞緊密連接屏障完整性的主要指標(biāo)[20-23]。Occludin是連接復(fù)合體中重要的跨膜蛋白，它通過(guò)自身的4個(gè)跨膜區(qū)將相鄰細(xì)胞以拉鏈方式相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞旁封閉[24]。Occludin的羧基端通過(guò)ZO-1與骨架蛋白相連，與ZO-1共同調(diào)節(jié)緊密連接結(jié)構(gòu)的變化[24-25]。Occludin表達(dá)或活性降低，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間隙通透性的增加[24-25]。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，也是連接復(fù)合體中最重要的跨膜粘附連接蛋白之一，它位于細(xì)胞緊密連接處，主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附反應(yīng)，直接影響著緊密連接結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。E-cadherin能跨越細(xì)胞間隔，粘附連接對(duì)側(cè)的相鄰細(xì)胞，在細(xì)胞之間形成粘附帶[26-27]。E-cadherin表達(dá)的下調(diào)會(huì)影響上皮細(xì)胞間的粘附水平和緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致屏障受損[26-28]。

本研究結(jié)果顯示，模型組ZO-1、Occludin和E-cadherin的蛋白表達(dá)較正常組顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究結(jié)果還顯示，大鼠空白尿液對(duì)尿道致病性大腸桿菌所致的ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)沒(méi)有明顯影響，但尿感方含藥尿液中的藥物能逆轉(zhuǎn)尿道致病性大腸桿菌所致的ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，尿感方對(duì)尿道致病性大腸桿菌所致的膀胱上皮屏障損傷有一定的修復(fù)作用，其作用機(jī)制與關(guān)鍵連接蛋白表達(dá)有關(guān)。