石志堅， 魯文濤， 張軍鵬， 鄭 軼

(鄭州市中醫(yī)院，河南 鄭州 450007)

心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段，是心臟結構或功能的異常[1]。在過去的十年中，心血管疾病是全球主要的死亡原因之一，嚴重威脅著人類的生命和健康[2]。目前全世界約有2 600萬人患有心力衰竭，美國和歐洲的心力衰竭年發(fā)病率超過100萬[3]。中國有超過450萬名心力衰竭患者，35～74歲成年人的患病率為0.9%[4]。由于衰老、高血壓、糖尿病等多種心力衰竭危險因素和人口老齡化不斷增加，心血管疾病死亡率占中國全因死亡人數(shù)的40%以上，并且這一數(shù)字正在迅速增加[5-6]。近20年來，心力衰竭藥物治療的概念發(fā)生了很大變化，從改善血流動力學的角度到生物學調(diào)整，各種新的治療方法和優(yōu)化的心力衰竭管理方法不斷被提出。盡管取得了不少進展，但目前心力衰竭的患病率和死亡率仍然很高。

補陽還五湯主要由赤芍、桃仁、黃芪、紅花、當歸、川芎和地龍組成，具有活血化瘀、補氣通絡的功效。薈萃分析顯示，相對于單純西藥治療，補陽還五湯能夠有效改善患者癥狀，提高心臟射血分數(shù)[7]。但中藥方劑成分復雜的因素限制其具體起效機制及起效成分的揭示。因此，本研究借助轉(zhuǎn)錄組學與網(wǎng)絡藥理學，對補陽還五湯干預心力衰竭的網(wǎng)絡化機制進行分析，并設計動物實驗對其進行驗證，為后續(xù)研究提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 根據(jù)關鍵詞“heart failure”在GEO數(shù)據(jù)庫進行搜索，選擇物種為“Musmusculus”，結果選取GSE5500數(shù)據(jù)集，從中選取假手術組大鼠心臟樣本5例，以及主動脈縮窄環(huán)植入(TAC)手術造模的心衰大鼠心臟樣本6例。使用R語言“l(fā)imma”程序包[8]對芯片信息進行矯正并注釋，按照logFC≥1，Pvalue<0.05標準進行二次差異分析以獲取明顯差異基因，“clusterProfiler”程序包對明顯差異基因進行基因本體(GO)富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析，“ggplot”程序包對差異分析結果進行可視化操作。

1.2 核心藥物有效成分及靶點獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取補陽還五湯藥物的有效成分及靶點，根據(jù)ADME原則以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標準進行篩選。由于TCMSP網(wǎng)站未收錄“地龍”，故采用文獻檢索法獲取其有效成分及靶點。將靶點全稱輸入到Uniprot網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/)，轉(zhuǎn)化為相應基因簡稱。

1.3 疾病-藥物交集靶基因與PPI網(wǎng)絡構建 將上述心力衰竭差異基因與補陽還五湯靶基因進導入到Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中繪制韋恩圖，得到疾病-藥物交集靶基因。將交集靶基因?qū)氲絊TRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)進行蛋白質(zhì)互作(Protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡分析，并利用Cytoscape軟件中的cytohub插件獲取度值前10的靶點。

1.4 GO/KEGG富集分析與藥理網(wǎng)絡構建 將上述交集基因?qū)氲紻avid數(shù)據(jù)庫中進行GO/KEGG富集分析，根據(jù)富集結果利用R語言進行可視化操作，將其與上述轉(zhuǎn)錄組差異基因富集結果進行比對，結合前期文獻研究結果，選取apoptosis(細胞凋亡)信號通路進行驗證。將上述信息進行匯總，導入到Cytoscape軟件構建補陽還五湯治療心力衰竭的藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖。

1.5 動物實驗

1.5.1 試劑與藥物 黃芪、當歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁購自河南省中醫(yī)院中藥飲片室，經(jīng)鄭州市中醫(yī)院主管中藥師李玉芬鑒定為正品，將上述藥材等比例合并后在100 ℃下煎煮0.5 h，取過濾液，配制成每1 mL含2 g生藥的濃縮液。血清肌酸激酶同工酶CKMB(批號BS-0649R)、肌鈣蛋白I(cTnI，批號WO118)、肌紅蛋白(Myo，批號K12868)、B型腦鈉肽(BNP，批號D3462)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司；caspase-8(批號2020N2BC1034)、caspase-3(批號2020N2AW1260)、PARP(批號2020A1HN1367)蛋白抗體均購自上海中韜生物科技有限公司。

1.5.2 分組與給藥 SPF級雄性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2020-0011，適應性飼養(yǎng)7 d后隨機分為假手術組、模型組、補陽還五湯組，每組10只，給予清潔自來水和標準飼料，自由進食飲水，飼養(yǎng)條件為溫度22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h/12 h明暗交替。手術前禁食，模型組和補陽還五湯組大鼠按照TAC法進行主動脈縮窄環(huán)置入，術后24 h死亡7只，3組分別存活8、7、8只，其中補陽還五湯組灌胃給予補陽還五湯藥液，按人體表面積計算給藥量為10 mL/kg，干預28 d。本研究方案已通過河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核并批準(編號DWLL202103067)，并在實驗過程中嚴格遵守動物倫理學3R原則。

1.5.3 心功能指標檢測 大鼠末次灌胃給藥12 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，檢測左室射血分數(shù)(LVEF)、短軸縮短率(LVFS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)。

1.5.4 血清生化指標檢測 大鼠內(nèi)眥靜脈叢取血并分離心臟，3 000 r/min離心10 min后取上清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用全自動化儀檢測血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平。

1.5.5 HE染色 甲醛固定大鼠心臟組織，進行脫水、包埋、切片、脫蠟等操作，HE染色觀察其病理變化。

1.5.6 Western Blot法檢測相關蛋白表達 取適量冷凍的大鼠心臟組織于冰上剪碎，加蛋白裂解液進行裂解，離心取上清，采用BCA法測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，乙酸纖維素轉(zhuǎn)膜，加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入HRP標記的二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加ECL顯示劑顯色，暗室膠片曝光。采用Image J軟件對蛋白條帶進行量化處理，目標蛋白表達量通過β-actin校正。

2 結果

2.1 基因芯片差異基因 芯片批次矯正結果見圖1A，中線在同一水平，符合差異分析要求。共獲得心力衰竭差異基因20 700個，其中明顯差異基因共401個，包括上調(diào)基因319個，下調(diào)基因82個，見圖1B，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，黑色為其他差異基因。圖1C縱坐標為前50個差異基因，橫坐標代表不同樣本。

2.2 明顯差異基因GO/KEGG富集分析 GO富集分析顯示，心力衰竭病理機制主要涉及regulation of cell development(細胞發(fā)育的調(diào)控)、proteasomal protein catabolic process(蛋白酶體蛋白質(zhì)分解代謝過程)等生物過程；cell-cell junction(細胞-細胞連接)、neuronal cell body(神經(jīng)元細胞體)、presynapse(突觸前)等細胞組分；與GTPase regulator activity(GTP酶調(diào)節(jié)活性)、ATPase activity(ATP酶活性)、transcription coregulator activity(轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)活性)等分子功能，見圖2。KEGG分析主要富集到MAPK、Ras、PI3K-Akt、神經(jīng)變性疾病等信號通路，見圖3。

2.3 補陽還五湯與心力衰竭交集靶基因 中藥有效成分分別為赤芍28種，桃仁2種，黃芪20種，紅花22種，當歸2種，川芎7種，地龍18種，主要包括ellagic acid(鞣花酸)、paeoniflorin(芍藥苷)、isorhamnetin(異鼠李素)、formononetin(芒柄花素)、calycosin(花萼素)、quercetin(槲皮素)、baicalin(黃芩苷)、luteolin(木犀草素)，靶基因去重后共192個，交集靶基因共177個，見圖4。

2.4 PPI網(wǎng)絡與GO/KEGG分析 靶基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡見圖5，越靠近中心的度值越高，顏色也越偏紅色，其中度值排名前10的為ALB、IL6、caspase-3、MAPK8、MYC、JUN、VEGFA、EGFR、HSP90AA1、ESR1，度值分別為77、74、72、72、68、67、66、66、64、61，見圖6。GO富集分析主要涉及response to steroid hormone(對類固醇激素的反應)、response to oxidative stress(對氧化應激的反應)、response to drug(對藥物的反應)等生物過程；transcription regulator complex(轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物)、membrane microdomain(膜微區(qū))、membrane raft(膜筏)等細胞組分；ubiquitin-like protein ligase binding(泛素-類蛋白連接酶結合)、RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding(RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結合轉(zhuǎn)錄因子結合)、DNA-binding transcription factor binding(脫氧核糖核酸-結合轉(zhuǎn)錄因子結合)等分子功能，見圖7。KEGG分析主要涉及l(fā)ipid and atherosclerosis(脂質(zhì)與動脈粥樣硬化)、fluid shear stress and atherosclerosis(流體剪切應力與動脈粥樣硬化)、apoptosis(細胞凋亡)、TNF signaling pathway(腫瘤壞死因子信號通路)等信號通路，見圖8。

2.5 細胞凋亡信號通路與待驗證靶點 細胞凋亡信號通路見圖9，紅色節(jié)點為所富集到的靶點，其中caspase-8可上調(diào)caspase-3表達，進而抑制PARP的保護作用來激活細胞凋亡進程；在KEGG富集結果中，與心力衰竭發(fā)生較為相關并具有前期文獻支撐的為細胞凋亡信號通路，同時在HUB基因中caspase-3的度值較高，故本研究選取這3個主要靶點用于后續(xù)動物實驗驗證。

2.6 補陽還五湯干預心力衰竭的網(wǎng)絡機制 網(wǎng)絡機制圖見圖10，相互聯(lián)系的節(jié)點以線連接，其中褐色橢四邊形代表方劑，綠色六邊形代表中藥，黃色六邊形代表有效成分，藍色圓形代表靶基因，紅色V形代表信號通路，紫色四邊形代表疾病，可知補陽還五湯從多成分、多靶點、多通路干預心力衰竭。

2.7 動物實驗

2.7.1 補陽還五湯對大鼠心功能指標的影響 3組大鼠基礎體質(zhì)量、體長等參數(shù)基本一致，造模完成后，模型組、補陽還五湯組大鼠行動遲緩，不喜活動。末次給藥24 h后，與假手術組比較，模型組大鼠LVIDs、LVIDd升高(P<0.05)，LVEF、LVFS降低(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組大鼠LVIDs、LVIDd降低(P<0.05)，LVEF、LVFS升高(P<0.05)，見表1。

表1 補陽還五湯對大鼠心功能指標的影響

2.7.2 補陽還五湯對大鼠血清生化指標的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平升高(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組大鼠血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平降低(P<0.05)，見表2。

表2 補陽還五湯對大鼠血清生化指標的影響

2.7.3 補陽還五湯對大鼠心肌組織病理形態(tài)的影響 假手術組大鼠可見心肌細胞排列緊密整齊，結構正常，無炎性浸潤和壞死，無間質(zhì)水腫；模型組大鼠可見心肌纖維排列紊亂、呈條索狀改變，心肌細胞變性、水腫，橫紋消失，部分細胞核溶解，心肌間質(zhì)明顯水腫、疏松，出現(xiàn)明顯炎性浸潤和壞死灶；補陽還五湯組大鼠心肌細胞排列較為整齊，結構大致正常，心肌細胞變性、水腫明顯減輕，橫紋有所恢復，細胞核完整且大致處于細胞中央，間質(zhì)水腫明顯減輕，可見部分新生細胞，見圖11。

2.7.4 補陽還五湯對大鼠心臟組織caspase-8、caspase-3、PARP蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠心臟組織caspase-8、caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，PARP蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組大鼠心臟組織caspase-8、caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，PARP蛋白表達升高(P<0.05)，見圖12。

3 討論

補陽還五湯是中醫(yī)經(jīng)典方劑，臨床上主要用于中風之氣虛血瘀證，而其在心血管疾病方面的治療作用被大大低估。心力衰竭歸屬于中醫(yī)藥學“心悸、水腫、喘證、痰飲”等范疇[9]?，F(xiàn)代研究表明心力衰竭的發(fā)生除了與冠脈供血不足有關外，微循環(huán)障礙也是導致心肌重構的重要原因[10]。補陽還五湯中黃芪為君藥以補氣利水，伍之赤芍、桃仁、紅花、川芎等藥活血化瘀，另有地龍一藥具備通絡之功，符合中西醫(yī)心力衰竭發(fā)病之機。芍藥苷預處理對大鼠心肌缺血后再灌注損傷具有保護作用，減輕心梗后心力衰竭癥狀，其機制與抑制細胞凋亡相關信號通路的表達進而減少氧化應激和細胞凋亡有關[11]；槲皮素作為一種植物成分，體內(nèi)外和臨床研究均表明其具有心臟保護作用[12-13]；黃芩苷可改善慢性炎癥、免疫失衡、脂質(zhì)代謝紊亂、細胞凋亡和氧化應激[14]。

中藥起效成分與作用機制復雜，網(wǎng)絡藥理學作為傳統(tǒng)“還原主義”藥物研究策略的補充與完善，對揭示中藥方劑多成分、多靶點、多通路的多層次作用具有重要意義[15]。通過對疾病與藥物的交集靶基因進行GO/KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能夠從多個細胞組分、分子功能、生物過程干預心力衰竭，涉及到多個信號通路。氧化應激下，細胞膜和脂蛋白中含有多不飽和脂肪酸(PUFA)的磷脂和膽固醇酯很容易通過自由基誘導脂質(zhì)過氧化(LPO)，形成復雜的氧化產(chǎn)物，進而導致冠脈狹窄及心肌供血供氧不足加劇[16]。TNF、IL6、IL17等促炎細胞因子合成和分泌的增加是心力衰竭發(fā)展的主要標志[17]。腫瘤壞死因子(TNF)-α或Fas配體(FasL)等與其受體結合以激活caspase-8，可導致線粒體釋放細胞色素C，從而激活caspase-9，兩者可共同調(diào)節(jié)一系列下游靶點，包括caspase-3、PARP等[18]。同時，在HUB基因中caspase-3的度值較高，因此，本研究通過動物實驗對這caspase-8、caspase-3和PARP這3個靶點進行驗證。

由于在預實驗中采用傳統(tǒng)用藥比例并未取得預期療效，而“分子配伍”或者“分子處方”這一概念早已有之，即在分子水平，通常從入血成分上去研究中藥有效成分，建立組效關系，優(yōu)化有效分子配伍處方比例[19-21]，故而初步采用等比例配伍進行實驗。研究發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能升高大鼠心臟LVIDd、LVIDs，降低LVEF、LVFS，并改善血清CKMB、cTnI、Myo、BNP水平，表明其對大鼠心功能改善作用明顯，并能增加心肌供血供氧。通過觀察大鼠心臟組織病理學，發(fā)現(xiàn)補陽還五湯組心肌細胞排列較為整齊，結構大致正常，心肌細胞變性、水腫明顯減輕，橫紋有所恢復，表明其對心肌重構的改善效果明顯。Western Blot檢測結果顯示，補陽還五湯能夠增加caspase-8、caspase-3蛋白表達，并降低PARP蛋白表達，表明可能對細胞凋亡具有抑制作用。

綜上所述，本研究通過轉(zhuǎn)錄組學和網(wǎng)絡藥理學分析，發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡等信號通路，從而發(fā)揮干預心力衰竭的作用。通過動物實驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)補陽還五湯可以有效改善大鼠心功能，并調(diào)節(jié)細胞凋亡信號通路上的多個靶蛋白表達。