褚 煜， 陳 海， 呂宏陽(yáng)， 陳 艷， 王 建*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；3.西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

糖尿病是以胰島β細(xì)胞受損以及胰島素抵抗為主要病理特征的慢性代謝性疾病，主要分為1型糖尿病、2型糖尿病以及特殊類型糖尿病，臨床上以2型糖尿病患者居多[1]。2型糖尿病患者需要長(zhǎng)期甚至終身用藥治療，但長(zhǎng)期口服降糖藥物對(duì)肝腎損害較大，且隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)藥物繼發(fā)性失效等問(wèn)題[2]。

藥食兩用中藥具有“多成分”“多靶點(diǎn)”“多通路”等特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，且毒副作用小、不良反應(yīng)少，適合預(yù)防與治療2型糖尿病[3]。課題組前期基于輔助降血糖保健產(chǎn)品藥食兩用中藥原料統(tǒng)計(jì)[4]以及2020年版《中國(guó)藥典》中降糖處方的數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果，優(yōu)選出4味防治2型糖尿病的藥食兩用中藥，分別為黃芪、山藥、葛根、人參，但其防治2型糖尿病的機(jī)制不明，故本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的分析優(yōu)勢(shì)聯(lián)合分子對(duì)接結(jié)果，對(duì)其治療2型糖尿病的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料

藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugfuture.com/standard/)；藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)；比較毒物基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step)；化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www1.rcsb.org/)。Spass Modeler、Cytoscape3.6.1、Autodock Vina、Pymol等軟件。

2 方法

2.1 數(shù)據(jù)挖掘 以“消渴”“消渴病”“降糖”“糖尿病”“2型糖尿病”為檢索詞，檢索2020年版《中國(guó)藥典》和藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取降糖處方數(shù)據(jù)。Spass Modeler進(jìn)行頻次、鏈接強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析，導(dǎo)入Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖，再結(jié)合糖尿病保健食品中排序前10的藥食兩用中藥[4]，取交集后優(yōu)選出4味。

2.2 藥物及疾病靶點(diǎn)篩選 從藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)中檢索獲取黃芪、山藥、葛根、人參主要成分及作用靶點(diǎn)，檢索條件為生物利用度(OB)>30%，類藥性(DL)>0.18，并在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Uniprot)中對(duì)成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換。人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)與比較毒物基因數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD)中檢索與2型糖尿病相關(guān)的所有疾病靶點(diǎn)，中位數(shù)篩選保留相關(guān)性較強(qiáng)的疾病靶點(diǎn)后合并去重，將藥物成分作用靶點(diǎn)與2型糖尿病相關(guān)疾病靶點(diǎn)取交集處理后，得到兩者共同靶點(diǎn)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中將共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析，選定物種為“人”，得到靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯磀egree值分布排列。繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果篩選核心靶點(diǎn)，結(jié)合TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，Excel統(tǒng)計(jì)核心靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)成分，篩選得到核心成分。

2.4 功能與通路富集 基于DAVID、Metascape富集分析工具，選定物種為“人”，進(jìn)行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。

2.5 中藥-成分-靶點(diǎn)-通路構(gòu)建 將黃芪、山藥、葛根、人參成分進(jìn)行編號(hào)，成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)通路，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)文件屬性文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 分子對(duì)接 在化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(PubChem)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(RCSB-Pdb)中檢索核心成分靶點(diǎn)與配體文件，采用Autodock Vina軟件對(duì)核心成分-靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。

3 結(jié)果

3.1 數(shù)據(jù)挖掘 在2020年版《中國(guó)藥典》和藥品標(biāo)準(zhǔn)查詢數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到相關(guān)處方43首、中藥111味，統(tǒng)計(jì)使用頻數(shù)前20的中藥，繪制高頻中藥鏈接關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，鏈接強(qiáng)度為1～17，中藥的顏色越紅，表明其出現(xiàn)在處方中次數(shù)越多；不同中藥間的連線越粗，表明兩藥配伍相關(guān)性越強(qiáng)。由此可知，黃芪使用頻次最高，其次為天花粉、地黃、麥冬、山藥、枸杞子、五味子、知母、葛根、人參，排名前10的配伍藥對(duì)依次為黃芪-天花粉、黃芪-地黃、黃芪-山藥、黃芪-枸杞子、黃芪-葛根、黃芪-麥冬、黃芪-五味子、黃芪-黃精、黃芪-黃連、黃芪-人參。與糖尿病保健食品中排名前十的藥食兩用中藥[4]取交集后，優(yōu)選出黃芪、山藥、葛根、人參。

3.2 作用靶點(diǎn) 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得黃芪、山藥、葛根、人參活性成分共48個(gè)，作用靶點(diǎn)92個(gè)；在CTD、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)共988個(gè)，取交集后得到共同靶點(diǎn)56個(gè)，成分-疾病靶點(diǎn)見(jiàn)圖2。

3.3 PPI蛋白互作圖 在Cytoscape 3.6.1中繪制PPI圖，并按照重要性排列，按照節(jié)點(diǎn)度值(Degree)排序，篩選得到核心靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)顏色越紅、越大，表明度值越高，結(jié)果見(jiàn)圖3。刪除與疾病無(wú)相關(guān)性靶點(diǎn)，得到11個(gè)藥物-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為AKT1、PTGS2、MAPK8、IL1B、JUN、CASP3、RELA、ICAM1、STAT1、AHR、NFKBIA，核心成分為槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2，具體見(jiàn)表1。

表1 4味藥食兩中藥核心成分

3.4 GO功能富集 統(tǒng)計(jì)生物過(guò)程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)，篩選出排名前10者，并繪制GO功能富集分析組圖，結(jié)果見(jiàn)圖4、表2。由此可知，生物過(guò)程主要涉及生物過(guò)程為對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等；分子功能主要涉及核基因編碼、蛋白質(zhì)功能等分子功能；細(xì)胞成分主要參與胞漿、核周區(qū)、膜區(qū)等定位。

表2 GO功能富集分析結(jié)果

3.5 KEGG通路富集 主要涉及通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，通路氣泡富集圖見(jiàn)圖5，氣泡大小代表通路上富集的基因數(shù)量，氣泡越大，表明富集的基因數(shù)目越多；氣泡顏色代表-logP值，其值由大到小從紅色到藍(lán)色變化。

3.6 成分-靶點(diǎn)-通路構(gòu)建 通過(guò) Cytoscape 3.6.1軟件繪制中藥-成分-靶點(diǎn)-通路圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。

3.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 將核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2與AKT1、PTGS2、MAPK8等核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，當(dāng)結(jié)合鍵能<-5 kcal/mol時(shí)，表明兩者對(duì)接結(jié)果良好，采用R語(yǔ)言繪制結(jié)合鍵能熱圖，見(jiàn)圖7，并用Pymol繪制分子對(duì)接模型圖，見(jiàn)圖8～9。

4 討論

2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要為胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷[5]。常見(jiàn)降糖藥物作用途徑單一，并伴有不同程度的副作用，如導(dǎo)致低血糖、乳酸性酸中毒等問(wèn)題[6]。藥食兩用中藥使用安全，降血糖作用溫和持久，兼具降脂、降壓、消炎、增強(qiáng)免疫等多種優(yōu)勢(shì)[7]，具有治療2型糖尿病的重大潛能。目前2型糖尿病與低度炎癥相關(guān)性研究逐漸增多[8]，且腸道菌群失調(diào)可能成為重要誘導(dǎo)2型糖尿病發(fā)生的因素。

本研究結(jié)果表明，黃芪、山藥、葛根、人參4味藥治療2型糖尿病的核心靶點(diǎn)為AKT1、PTGS2、MAPK8等。其中，蛋白激酶(AKT)在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起關(guān)鍵作用，AKT1與胰島β細(xì)胞損傷修復(fù)密切相關(guān)[9]；前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶(PTGS)參與誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)堆積，能負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素分泌，并與胰島素敏感性降低相關(guān)[10]；絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)作為JNK信號(hào)通路重要調(diào)控基因[11]，與胰島素抵抗密切相關(guān)。分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚與PTGS2結(jié)合最穩(wěn)定，β-谷甾醇、人參皂苷Rh2則與MAPK8結(jié)合最穩(wěn)定，表明4味藥核心成分通過(guò)作用核心靶點(diǎn)，可能減輕炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗來(lái)治療2型糖尿病。

KEGG通路富集分析主要涉及AGE-RAGE、TNF等通路。AGE-RAGE信號(hào)通路能夠引發(fā)一系列炎癥，導(dǎo)致胰島細(xì)胞受損和胰島素抵抗，與2型糖尿病發(fā)生密切相關(guān)[12]。TNF通路中主要效應(yīng)分子為腫瘤壞死因子α(TNF-α)，其與腫瘤壞死因子受體(TNFR)結(jié)合，可產(chǎn)生C-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB(NF-κB)等，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[13]引發(fā)胰島素抵抗。

GO功能富集生物過(guò)程涉及脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌來(lái)源分子反應(yīng)、細(xì)胞外刺激的反應(yīng)，提示糖尿病的防治可能涉及細(xì)菌來(lái)源的分子反應(yīng)，而這與腸道菌群關(guān)系密切[14]。研究表明，2型糖尿病可能與腸道菌群變化及其代謝紊亂引起的低度炎癥有關(guān)[15]。機(jī)體正常情況下，以雙歧桿菌、乳桿菌為主的益生菌占優(yōu)，形成菌膜結(jié)構(gòu)，來(lái)抵抗病原菌對(duì)機(jī)體的侵襲[16]。而在2型糖尿病患者腸內(nèi)，會(huì)出現(xiàn)厚壁菌門、變形菌門增多，擬桿菌門、放線菌門減少[17]，以及雙歧桿菌和乳酸桿菌減少，腸球菌和大腸桿菌增多[18]等變化。研究表明雙歧桿菌能改善高脂飲食小鼠糖耐量，降低TNF-α，IL-6等促炎細(xì)胞因子分泌，減輕炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗程度[19]，也可抑制腸道中常見(jiàn)致病菌如擬桿菌等的生長(zhǎng)和增殖[20]，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)定及抗炎的作用。腸道菌群也能通過(guò)微生物代謝物，交叉影響宿主的代謝穩(wěn)態(tài)，從而與2型糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)[21]。脂多糖(LPS)主要來(lái)源于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者腸道內(nèi)革蘭氏陰性菌的比例增加，LPS分泌增多[22]，激活NF-κB通路，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等表達(dá)[23]，以及促進(jìn)JNK的激活，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。而且已有報(bào)道這2種途徑均與胰島素抵抗以及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[24]。此外，2型糖尿病患者腸道內(nèi)，SCFAS產(chǎn)生菌尤其是丁酸產(chǎn)生菌會(huì)減少[25]，而雙歧桿菌作為丁酸鹽產(chǎn)生最重要的腸道細(xì)菌之一[26]，對(duì)促進(jìn)SCFAS產(chǎn)生、減輕炎癥以及降低胰島素抵抗有積極作用[27]。

多項(xiàng)研究也表明槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2均可抑制NF-κB過(guò)度活化，減少LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用，從而改善胰島素抵抗與胰島細(xì)胞損傷[28-31]。

綜上所述，核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2，通過(guò)作用AKT1、PTGS2、MAPK8等多靶點(diǎn)，參與調(diào)控AGE-RAGE、TNF等信號(hào)通路表達(dá)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，改善LPS、SCFAs等代謝途徑，共同發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)、降低胰島素抵抗以及減少胰島β細(xì)胞損傷等作用，從而對(duì)2型糖尿病起到一定的治療作用。

5 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的分析結(jié)果，探討了成分-腸道菌群-炎癥反應(yīng)-2型糖尿病的關(guān)系，提示4味藥食兩用中藥可能通過(guò)腸道菌群對(duì)2型糖尿病起到一定的治療作用。本研究基于大數(shù)據(jù)，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的方法初步闡明治療2型糖尿病機(jī)制，其結(jié)果仍有待于后續(xù)藥理實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，并且針對(duì)2型糖尿病的不同證型，在中醫(yī)辨證施治的指導(dǎo)下如何正確使用藥食兩用藥亦是進(jìn)一步研究的方向。