黃晨鳳，李淼

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒呼吸內(nèi)科，沈陽 110004）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種異質(zhì)性氣道慢性炎癥疾病，影響全球約3.34億人，我國則有2 000余萬人患有哮喘［1-2］。根據(jù)痰液炎癥細(xì)胞的不同，哮喘可分為嗜酸性粒細(xì)胞哮喘、中性粒細(xì)胞哮喘（neutrophilic asthma，NA）、寡粒細(xì)胞哮喘和混合性粒細(xì)胞哮喘［3］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是哮喘中常見的炎性細(xì)胞因子，而黏蛋白5AC（mucin 5 subtype AC，MUC5AC）過度表達(dá)被認(rèn)為是哮喘氣道黏液高分泌的標(biāo)志，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threo-nine protein kinase，AKT）參與以上三者的形成過程。魚腥草為食藥同源中藥，魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH）是魚腥草素的化合物，具有抗炎作用［4］。既往研究［5］表明，SH能抑制哮喘氣道高反應(yīng)（airway hyperresponsiveness，AHR）及氣道炎癥。本研究擬探討SH是否通過抑制AKT磷酸化減少炎性細(xì)胞因子及黏蛋白表達(dá)，從而緩解NA癥狀。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級Balb/c小鼠40只（購自北京華阜康生物科技股份有限公司），6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g。

1.1.2 主要試劑和儀器：卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自美國 Sigma公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、SH購自大連美侖生物公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；兔抗TNF-α、GAPDH、AKT抗體、鼠抗p-AKT抗體購自美國Proteintech公司，鼠抗IL-1β抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，鼠抗MUC5AC抗體購自美國ThermoFisher Scientific公司。壓縮空氣式霧化器（403M，中國魚躍醫(yī)療股份有限公司），qRT-PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型建立：將小鼠隨機分為正常對照（NC）組、NA組、SH組、地塞米松（dexamethasone，DXM）組、聯(lián)合干預(yù)（SH+DXM）組，每組8只。建立小鼠NA模型［6］，NC組小鼠鼻腔滴入20 μL生理鹽水，其余組小鼠在實驗第1、7、14天分別鼻腔滴入等量50 μg OVA+15 μg LPS的混合致敏液。實驗第21～27天，對SH（10 mg/kg）組、DXM（2 mg/kg）組、SH+DXM（10 mg/kg+2 mg/kg）組小鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的藥物，NA、NC組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，1 h后將除NC組以外的其他4組小鼠分批放置于霧化箱中，5% OVA溶液空氣壓縮霧化，30 min/次，1次/d；NC組小鼠用等量生理鹽水霧化，余條件同前。

1.2.2 無創(chuàng)氣道阻力檢測：最后一次霧化激發(fā)48 h內(nèi)，用DSI Buxco無創(chuàng)雙腔檢測系統(tǒng)檢測各組小鼠的特殊氣道阻力（special resistance of airway，sRaw）。

1.2.3 單肺灌洗及細(xì)胞計數(shù)：將小鼠麻醉后行單肺灌洗，將回收的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）離心（1 500 r/min，4 ℃）10 min，棄上清，加入200 μL 4%多聚甲醛重懸，吸取適量BALF滴在血細(xì)胞計數(shù)板上，鏡下計數(shù)白細(xì)胞總數(shù)；另取適量BALF根據(jù)瑞氏吉姆薩染色液試劑盒要求操作，鏡下分類計數(shù)白細(xì)胞。

1.2.4 標(biāo)本采集：取小鼠右下肺，4%多聚甲醛固定，-80 ℃凍存，用于后續(xù)實驗。

1.2.5 HE、PAS、Masson染色：將固定好的肺組織制成石蠟切片，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行染色，鏡下觀察各組小鼠氣道、氣道周圍、氣道黏膜下的生理病理形態(tài)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，根據(jù)抗體說明書進(jìn)行抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑滅活30 min，非特異染色阻斷劑封閉30 min，加入MUC5AC抗體（1∶200稀釋）4 ℃過夜，加入二抗孵育20 min，SABC孵育20 min，DAB顯色。

1.2.7 qRT-PCR檢測各組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA表達(dá)水平：提取小鼠肺組織總RNA，按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后行PCR擴增。內(nèi)參照β-actin正向引物序列5’-CTACCTCATGAAGATCCTG ACC-3’，反向引物序列5’-CACAGCTTCTCTTTGATGT CAC-3’；MUC5AC正向引物序列5’-ATCTGTAAGGA AGCCACGCTAA-3’，反向引物序列5’-CTCCTCGTA TGTGACTATCAGG-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系：qRT-PCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，Dye 0.4 μL，cDNA模 板2.0 μL，RNase-free H2O 6.8 μL，共20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法分析相對表達(dá)量。

1.2.8 Western blotting檢測各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)量：提取總蛋白，按照BCA試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，制備蛋白樣品。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，經(jīng)一抗（TNF-α、IL-1β抗體稀釋1∶1 000，GAPDH抗體稀釋1∶10 000，p-AKT/AKT抗體稀釋1∶3 000）4 ℃孵育、二抗（稀釋1∶10 000）室溫孵育后，ECL法發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Dunnett’sT3檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 各組氣道阻力比較

氣道阻力檢測結(jié)果顯示，NA組小鼠的sRaw［（3.11±1.00）cmH2O·s］明顯高于NC組［（0.85±0.06）cmH2O·s］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；SH組［（1.46±0.12）cmH2O·s］、DXM組［（1.20±0.23）cmH2O·s］、SH+DXM組［（0.89±0.13）cmH2O·s］均低于NA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05）。

2.2 各組單肺灌洗及細(xì)胞計數(shù)比較

BALF白細(xì)胞總數(shù)計數(shù)結(jié)果顯示，NA組BALF中白細(xì)胞總數(shù)［（352.75±56.96）×104/mL］高于NC組［（19.54±11.52）×104/mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。SH組、DXM組、SH+DXM組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)分別為（125.42±31.03）×104/mL、（55.96±10.29）×104/mL、（47.13±6.97）×104/mL，均高于NC組，但較NA組均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；DXM組、SH+DXM組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)較SH組均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。

BALF瑞氏吉姆薩染色白細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果顯示，NA組、SH組、DXM組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)［（18.50±0.71）×104/mL、（9.42±0.58）×104/mL、（7.83±0.75）×104/mL］均高于NC組［（3.67±0.92）×104/mL］，中性粒細(xì)胞數(shù)［（71.08±5.93）×104/mL、（22.79±3.10）×104/mL、（5.79±0.89）×104/mL］亦均高于NC組［（2.17±1.10）×104/mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；SH+DXM組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)［（4.42±0.89）×104/mL］及中性粒細(xì)胞數(shù)［（3.71±0.51）×104/mL］與SH組、DXM組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)較NA組均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）；DXM組、SH+DXM組的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)較SH組均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。NA組、SH組、DXM組、SH+DXM組的巨噬細(xì)胞數(shù)分別為（36.42±11.44）×104/mL、（31.38±11.01）×104/mL、（21.29±4.57）×104/mL、（15.54±3.02）×104/mL，均高于NC組［（7.46±4.26）×104/mL］，淋巴細(xì)胞數(shù)分別為（26.58 ±8.04）×104/mL、（30.00±11.84）×104/mL、（17.92±3.59）×104/mL、（16.17±2.06）×104/mL，亦高于NC組［（5.13±3.71）×104/mL］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。

2.3 各組肺組織和氣道組織染色結(jié)果比較

HE染色顯示，NC組小鼠氣道無炎癥表現(xiàn)，而NA組氣道上皮細(xì)胞肥大、管壁增厚、管腔狹窄，肺組織及氣道有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，SH組、DXM組、SH+DXM組肺組織及氣道炎癥明顯減輕。PAS染色顯示，NA組小鼠氣道有明顯的黏液高分泌，NC組則幾乎沒有，SH組、DXM組、SH+DXM組分泌明顯減少；Masson染色顯示，NA組小鼠肺組織及氣道黏膜下有明顯的纖維化，NC組幾乎沒有纖維化發(fā)生，SH組、DXM組、SH+DXM組纖維化顯著減少，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織及氣道組織 HE、PAS、Masson 染色 ×200Fig.1 HE，PAS，and Masson staining of lung tissues and airway of mice in each group ×200

2.4 各組小鼠肺組織中黏蛋白和炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

IHC染色顯示，NA組肺組織中MUC5AC的表達(dá)（0.076±0.022）明顯高于 NC組（0.011±0.002），SH組（0.025±0.005）、DXM組（0.024±0.008）、SH+DXM組（0.021±0.003）的表達(dá)量較 NA組明顯減少，見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織及氣道IHC染色 ×200Fig.2 IHC staining of lung tissue and airway of mice in each group ×200

2.5 各組小鼠肺組織中MUC5AC mRNA表達(dá)水平比較

qRT-PCR結(jié)果顯示，NA組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA表達(dá)水平（25.02±13.52）顯著高于NC組（0.85±0.44），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），SH組（12.26±7.03）、DXM組（2.04±1.07）、SH+DXM組（5.17±2.81）均低于NA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 各組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

Western blotting結(jié)果顯示，NA組小鼠肺組織中TNF-α蛋白相對表達(dá)量（1.38±0.17）高于NC組（1.00±0.69），SH組（1.01±0.10）、DXM組（0.85±0.12）、SH+DXM組（0.78±0.19）TNF-α相對表達(dá)量則 低于NA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；NA組小鼠肺組織中IL-1β蛋白相對表達(dá)量（1.51±0.42）高于NC組（0.96±0.17），SH組（0.90±0.20）、DXM組（0.89±0.22）、SH+DXM組（0.80±0.30）IL-1β相對表達(dá)量低于NA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 Western blotting檢測各組小鼠肺組織中TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)水平Fig.3 TNF-α and IL-1β protein expression levels in lung tissues of mice in each group detected by Western blotting

Western blotting結(jié)果還顯示，NA組小鼠肺組織中p-AKT表達(dá)水平（1.51±0.30）高于NC組（0.75±0.10），SH組（0.99±0.31）、DXM組（0.80±0.28）、SH+DXM組（0.96±0.25）p-AKT表達(dá)水平低于NA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織中 p-AKT/AKT蛋白表達(dá)水平Fig.4 p-AKT/AKT protein expression in lung tissues of mice in each group

3 討論

NA是哮喘的表型之一［7］，其特征是多數(shù)中性粒細(xì)胞聚集于肺組織和氣道，釋放大量炎癥介質(zhì)（如TNF-α、IL-1β），從而引發(fā)炎癥反應(yīng)［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，NA組小鼠sRaw、BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)、肺組織TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)量均較NC組增加。研究［10］發(fā)現(xiàn)，MUC5AC在NA中高表達(dá)，IL-1β可增加人原代氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC表達(dá)。研究［11］表明，NA氣道上皮細(xì)胞中TNF-α、MUC5AC 表達(dá)增加。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NA組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)量較NC組增多。本研究結(jié)果還顯示，SH組、DXM組、SH+DXM組小鼠肺組織中MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)量較NA組減少，說明SH、DXM及兩者聯(lián)合干預(yù)均可降低NA小鼠肺組織中MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)水平。

AKT是AGC蛋白家族成員之一，有研究［12］證明NA小鼠模型中AKT磷酸化信號增強。LI等［13］指出，TNF-α可能通過激活A(yù)KT磷酸化參與氣道炎癥。MA等［14］證實，車前草苷通過抑制AKT磷酸化降低MUC5AC及IL-1β的表達(dá)量。在本研究中，NA組小鼠肺組織中p-AKT/AKT蛋白表達(dá)量較NC組增多，SH組小鼠肺組織中p-AKT/AKT蛋白表達(dá)量較NA組明顯減少，提示SH可以抑制NA小鼠肺組織中AKT磷酸化。

魚腥草素是魚腥草的主要活性成分。因SH較魚腥草素注射液更安全穩(wěn)定，故臨床上通常使用SH。SH在多種細(xì)胞和動物模型中發(fā)揮抗炎作用，可抑制牛和小鼠乳腺上皮細(xì)胞中 TNF-α、IL-1β 的表達(dá)［15-16］；降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的水平［17］，可通過抑制p38、JNK和ERK通路的磷酸化來抑制NF-κB活 化。本研究中，SH組、DXM組、SH+DXM組小鼠的sRaw、BALF中白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)、肺組織中TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)量均低于NA組，提示SH、DXM及兩者聯(lián)合干預(yù)均可抑制NA小鼠的炎癥。ZHU等［18］的研究結(jié)果表明，魚腥草可抑制肺纖維化p-AKT/AKT的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，DXM組、SH+DXM組小鼠肺組織中p-AKT/AKT的蛋白表達(dá)量較NA組減少，提示DXM干預(yù)、SH聯(lián)合DXM干預(yù)均可抑制NA小鼠肺組織中AKT磷酸化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SH可通過抑制AKT磷酸化，減少炎性細(xì)胞因子及黏蛋白的表達(dá)，緩解 NA的炎癥表現(xiàn)，為NA的治療提供了一種新的策略。