郝明杰，孫偉楠，蘇敬陽(yáng)，郝麗英

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110122）

鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CaM）是一種鈣離子（Ca2+）結(jié)合蛋白，通過(guò)與Ca2+結(jié)合調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生物學(xué)功能，并在多種疾病中發(fā)揮作用［1-4］。CaM能夠與L-型鈣離子通道（L-type Ca2+channels，LTCCs）結(jié)合，調(diào)節(jié)通道的開(kāi)放和關(guān)閉，影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，而細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載或濃度過(guò)低均會(huì)引發(fā)心血管系統(tǒng)疾病及神經(jīng)精神疾病［5-6］。心肌中CaV1.2通道高表達(dá)，是Ca2+進(jìn)入心肌細(xì)胞的主要途徑，通道的開(kāi)放和關(guān)閉受Ca2+依賴性易化（Ca2+-dependent facilitation，CDF）和Ca2+依賴性失 活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）的反饋調(diào)節(jié)，而以上過(guò)程均需CaM參與。研究［7-8］表明，CaV1.2和CaM的結(jié)合及其介導(dǎo)的Ca2+依賴的調(diào)節(jié)作用在生理學(xué)和病理生理學(xué)中具有重要作用。

氯化卡咪唑銨（calmidazolium chloride，CMZ）是一種以咪唑?yàn)榛A(chǔ)的特異性CaM拮抗劑。CMZ主要通過(guò)拮抗CaM依賴性磷酸二酯酶和CaM誘導(dǎo)的紅細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的活化，發(fā)揮拮抗CaM的作用［9］。本研究通過(guò)檢測(cè)CMZ存在下CaM與心肌CaV1.2通道的CT1基序蛋白片段的結(jié)合情況，探討CMZ調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用機(jī)制，為闡明相關(guān)疾病發(fā)生的潛在分子機(jī)制及深入理解疾病的病理生理過(guò)程、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，提供理論依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-3/CaM質(zhì)粒由日本鹿兒島大學(xué)KAMEYAMA教授惠贈(zèng)；pGEX-6P-3/CT1質(zhì)粒購(gòu)自上海生工生物有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自美國(guó)Oxid公司；氨芐西林（ampicillin，Amp）、異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、溶菌酶（lysozyme，Lys）以及N-月桂酰肌氨酸（N-lauroylsarcosine sodium，N-lau）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Triton X-100和磷酸鹽緩沖液（phosphate bufer，PBS）粉末購(gòu)自北京Solarbio公司；谷胱甘肽瓊脂糖4B珠蛋白（glutathione-sepharose 4B beads，GS-4B beads）、PreScission酶購(gòu)自英國(guó)GE Healthcar公司；CMZ購(gòu)自中國(guó)MCE公司，溶解于二甲基亞砜中，現(xiàn)用現(xiàn)配制。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白的制備：將CaM的cDNA（GenBank FJ012165，人源CaM基因）和CT1（GenBank AB016287，豚鼠源CaV1.2通道基因 a.a.1509-1789）克隆入pGEX-6P-3質(zhì)粒。在無(wú)菌條件下，應(yīng)用42 ℃精確熱休克法將CaM和CT1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中。將菌液分別均勻涂布到含AMP的固體培養(yǎng)平板表面，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。挑取單克隆菌落于適量培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600約0.6～1.0），取800 μL菌液加入50%高壓滅菌過(guò)的200 μL甘油中混勻，-80℃冰箱中保留菌種。取60 μL菌種加入含有Amp的LB培養(yǎng)液中，37 ℃下空氣搖床中（110 r/min）振蕩培養(yǎng)10 h。次日清晨測(cè)得光密度OD600為0.8～1.2時(shí)，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)4 h。采用超聲破碎法從菌液中提取純化GST-CT1和CaM蛋白。使用GS-4B beads純化CaM，并利用PreScission酶切除其GST標(biāo)簽。應(yīng)用BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)量CaM濃度。GSTCT1蛋白離心（15 000g，10 min）后，取上清與預(yù)先用PBS清洗過(guò)的GS-4B beads過(guò)夜孵育。

1.2.2 融合蛋白的提純驗(yàn)證：提取純化的GST-CT1和CaM融合蛋白各40 μL，加入15 μL 5×SDS loading buffer，充分混勻；煮沸5 min，蛋白變性，行15%SDSPAGE凝膠電泳?？捡R斯亮藍(lán)R染色，脫色，拍照。

1.2.3 Pull-down assay實(shí)驗(yàn)：將GST-CT1蛋白固定于用PBS清洗過(guò)的GS-4B beads上，4 ℃下緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。12 h后取40 μL GST-CT1與CaM（終濃度0.35、0.7、1.4、2.1、3.5 μmol/L）在300 μL體系的Tris buffer緩沖液中孵育。實(shí)驗(yàn)分為2組進(jìn)行，即對(duì)照組（GST-CT1+CaM）和CMZ組（GST-CT1+CaM+CMZ，CMZ終濃度為1 μmol/μL［10］）。在不同 Ca2+濃度（100 nmol/L和10 μmol/L）條件下，4 ℃孵育4 h后，用相應(yīng)濃度的Ca2+緩沖液清洗體系2次。然后，將樣品重懸于SDSPAGE上樣緩沖液中，并在15%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳分離?？捡R斯亮藍(lán)R染色，Scanwizard Bio軟件掃描并數(shù)字化，CS Analyzer軟件定量灰度值，利用SigmaPlot軟件繪制CaM與CaV1.2 CT1結(jié)合的擬合曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)合配體（Y）用 Hills 方程擬合，單點(diǎn)擬合模型用 Hill 方程表示如下：Y=Bmax×［X］/（Kd+［X］）。其中Bmax為最大結(jié)合，［X］ 為自由配體濃度，Kd為表觀離解常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白的鑒定

對(duì)超聲破碎法提取的GST-CT1融合蛋白、Pre-Scission 酶切的CaM蛋白分別行15%SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)染色、脫色后，在表觀分子量約為54×103（GST-CT1）、26×103（GST）和16.7×103（CaM）處出現(xiàn)蛋白條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 純化后的GST-CT1和CaM的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of purified GST-CT1 and CaM

2.2 CMZ對(duì)CaM與GST-CT1結(jié)合的影響

10 μmol/L和100 nmol/L Ca2+濃度下，CaM與CaV1.2 CT1均具有結(jié)合作用，且結(jié)合具有CaM濃度依賴性。加入CMZ后，CaM與CaV1.2 CT1結(jié)合明顯減少，且在10 μmol/L Ca2+濃度下結(jié)合減少更顯著（圖2、表1），表明CMZ能抑制CaM與CaV1.2 CT1的結(jié)合，且在高鈣條件下抑制更顯著。

圖2 CMZ抑制CaM與CT1基序的結(jié)合Fig.2 CMZ inhibits the binding of CaM to CT1 motif

為了能夠更加清晰直觀地了解CMZ對(duì)CaM與GST-CT1結(jié)合的抑制作用，對(duì)CMZ組和對(duì)照組的CaM（0.35～3.5 μmol/L）與GST-CT1的結(jié)合值進(jìn)行了具體分析。結(jié)果如圖3所示，在Ca2+濃度為10 μmol/L和100 nmol/L時(shí)，CMZ顯著抑制CaM與CT1基序的結(jié)合，且隨著CaM濃度的增加，該抑制作用逐漸減弱，即在低CaM濃度時(shí)，抑制作用更顯著。最大結(jié)合量Bmax值在Ca2+濃度為10 μmol/L時(shí)＞100 nmol/L，而表觀解離常數(shù)Kd值減小。表明高鈣時(shí)CaM與CT1基序的結(jié)合親和力增加，結(jié)合量增多。加入CMZ后，Kd值增加，表明CaM與CT1基序的結(jié)合親和力降低，且在Ca2+濃度為100 nmol/L時(shí)結(jié)合親和力降低更多（表1）。以上結(jié)果表明，CMZ在鈣超載的情況下對(duì)CaM與CT1基序的結(jié)合抑制作用更佳。

表1 CaM與GST-CT1結(jié)合的參數(shù)Tab.1 CaM and GST-CT1 binding parameters

圖3 CMZ存在或不存在時(shí)CaM與GST-CT1的結(jié)合情況對(duì)比Fig.3 The binding comparison of CaM and GST-CT1 with or without CMZ

3 討論

細(xì)胞內(nèi)Ca2+是作用于細(xì)胞受體并控制多種細(xì)胞功能外部信號(hào)的關(guān)鍵信使。細(xì)胞通過(guò)一系列調(diào)控過(guò)程，嚴(yán)密調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度水平，以調(diào)節(jié)多種生理功能。CaM是所有真核細(xì)胞中最主要的Ca2+感受器蛋白，它與Ca2+結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，激活或抑制Ca2+通道，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。細(xì)胞死亡、增殖異常和重大疾病等均與Ca2+穩(wěn)態(tài)的失調(diào)關(guān)系密切。研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用CMZ等CaM拮抗劑可通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放和進(jìn)入，干擾Ca2+依賴性調(diào)節(jié)，從而使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。本研究中討論了Ca2+濃度為100 nmol/L（相當(dāng)于生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度）和10 μmol/L（相當(dāng)于心血管疾病發(fā)生時(shí)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載狀態(tài)）時(shí)［13-15］，CMZ對(duì)CaM與心肌CaV1.2通道CT1蛋白片段結(jié)合的抑制作用，結(jié)果表明，CMZ抑制了CaM與LTCCs CaV1.2 的結(jié)合，可能為應(yīng)用CMZ后促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高提供了新的理論基礎(chǔ)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

自CaM被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，對(duì)其抑制劑的研究一直是研究熱點(diǎn)之一。研究表明，CaM拮抗劑有多種藥理作用及廣泛的臨床應(yīng)用前景，如誘導(dǎo)多種腫瘤模型的細(xì)胞凋亡［16］，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度炎癥反應(yīng)等，為治療帕金森病和阿爾茨海默病等與炎癥增加和小膠質(zhì)細(xì)胞增殖相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病提供了基礎(chǔ)［17-18］。而且，一些CaM拮抗劑已被廣泛用作抗癌藥物、治療造血系統(tǒng)疾病藥物以及抗精神病藥物［19］。CMZ作為CaM的一種特異性抑制劑，其臨床應(yīng)用具有廣闊前景，但也有研究［20］發(fā)現(xiàn)，CMZ可導(dǎo)致離體成年大鼠心肌細(xì)胞舒張功能受損，從而導(dǎo)致心臟疲勞，還會(huì)導(dǎo)致H9c2細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，線粒體功能障礙，氧化和亞硝化應(yīng)激，產(chǎn)生劑量依賴性的生長(zhǎng)抑制，這些嚴(yán)重的不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。但有也研究［21］表明，CaM拮抗劑使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，可以通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)血小板的凋亡，不影響血小板活化，但影響其黏附和聚集，提示CMZ可作為治療血栓的潛在有效藥物，未來(lái)可將其制作為合適的劑型或靶向CaM和（或）CaM依賴的系統(tǒng)，以減少不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，CaM拮抗劑CMZ抑制了CaM與心肌CaV1.2通道 C末端CT1基序的結(jié)合，揭示了CMZ作為CaM拮抗劑的一種新的作用機(jī)制。為CMZ潛在作用的挖掘以及其他CaM抑制劑的新的作用機(jī)制研究提供了思路，也為將CMZ應(yīng)用于臨床治療某些疾病提供了理論基礎(chǔ)。