孫九許，燕夢云，翟晉娜，丁凌，孫雅嘉，裴凌鵬，2

（1.中央民族大學(xué)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，北京 100081；2.民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

肌肉減少癥是指骨骼肌質(zhì)量和功能隨年齡增加而逐漸喪失的慢性退行性疾?。?］。目前，我國肌肉減少癥患病率呈上升趨勢，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。肌肉減少癥是一種復(fù)雜的疾病，研究［2］發(fā)現(xiàn)其與胰島素抵抗、慢性病、營養(yǎng)缺乏和運(yùn)動等多種因素相關(guān)，但具體病因及機(jī)制尚不明確。

肌肉減少癥歸屬于中醫(yī)“虛勞”“肉痿”等范疇，年老者脾胃虛弱，氣血生化乏源，肢體失于濡養(yǎng)，則見肢體倦怠乏力，肌肉萎縮［3］。刺老苞為五加科植物楤木或棘莖楤木的根皮或莖皮［4］。其成分以皂苷、黃酮等居多，具有保肝、抗癌以及提高免疫力等多種藥理活性?！兜崮媳静荨酚涊d刺老苞歸脾腎二經(jīng)，脾主肌肉，腎主骨，目前對于它的研究多在骨科疾病方面，而骨肌系統(tǒng)是一個有機(jī)整體，相互協(xié)調(diào)、密不可分［5］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析刺老苞治療肌肉減少癥的活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)和潛在信號通路，探討其可能的作用機(jī)制，為后期相關(guān)研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（日本島津公司），高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛公司）。刺老苞根皮（批號 091101）購自湖北施恩堂藥業(yè)；甲醇、乙腈和甲酸均購自德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備：取刺老苞適量研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末狀；稱取100 mg粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇中；每30 min渦旋1次，共渦旋6次，置于4 ℃冰箱過夜；離心（12 000 r/min，10 min）后取上清，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，保存于進(jìn)樣瓶中，用于液質(zhì)分析。

1.2.2 色譜條件：Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱；流動相0.1% 甲酸溶液～乙腈，梯度洗脫（0.00 min乙腈比例為5%，9.00 min內(nèi)乙腈比例線性增加到95%，并維持1 min；10.00～11.10 min乙腈比例降為5%，并以該比例平衡至14 min）；柱溫40℃；體積流量0.35 mL/min，進(jìn)樣量4 μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，渦輪噴霧；源溫度550 ℃；離子噴霧電壓（ionspray voltage，IS）5.5 kV（正離子模式）/-4.5 kV（負(fù)離子模式）；離子源氣體（ion source gas，GS）Ⅰ，GSⅡ和簾氣（curtain gas，CUR）分別設(shè)置為50、60和25.0 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。

1.2.4 刺老苞成分獲取及靶點(diǎn)預(yù)測：將液質(zhì)聯(lián)用得到的成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），篩選口服生物利用度（oral bioavail ability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的化合物。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫、化合物蛋白質(zhì)互作STITCH數(shù)據(jù)庫（https：//stitch.embl.de）獲得化合物靶點(diǎn)。

1.2.5 肌肉減少癥靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)篩選：以“Muscle loss” “Sarcopenia”在Genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）中檢索，得到疾病靶標(biāo)。與化合物靶點(diǎn)交集后得到共同靶點(diǎn)。

1.2.6 刺老苞治療肌肉減少癥靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖：將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺（https：//string-db.org/）獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。物種“Homo sapiens”，最低相互作用閾值 “highest confidence 0.9”。使用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，利用軟件中的Analyze Network功能進(jìn)行拓?fù)浞治觯@得各節(jié)點(diǎn)的中心度值（degree）。

1.2.7 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建：將藥物、有效成分、疾病、交集靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.8.2進(jìn)行可視化分析，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，然后通過Network Analysis插件分析節(jié)點(diǎn)度值。

1.2.8 交集靶點(diǎn)富集分析：將交集靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//David.ncifcrf.gov）進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。將分析結(jié)果根據(jù) FDR值從小至大進(jìn)行排序，篩選前 15 條繪制氣泡圖和條形圖。

2 結(jié)果

2.1 刺老苞成分篩選及靶點(diǎn)獲取

超高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定出445個化合物。OB值和DL值符合條件的有茵芋苷（MOL013083）、美洲茶酸（MOL001521）、花旗松素（MOL004576）、杜仲脂素 A（MOL009007）、槲皮素（MOL000098）、N-阿魏酰酪胺（MOL008647）、槲皮萬壽菊素（MOL002721）7個化合物。預(yù)測出163個化合物靶點(diǎn)。

2.2 肌肉減少癥疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取

運(yùn)用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索肌肉減少癥靶點(diǎn)，整理后得到靶點(diǎn)1 348個。與藥物靶點(diǎn)取交集得到共同靶點(diǎn)64個。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

結(jié)果顯示，PPI網(wǎng)絡(luò)有57個節(jié)點(diǎn)，211條邊（圖1）。利用Analyze Network進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得各節(jié)點(diǎn)的中心度值，選取排名前20的靶點(diǎn)，以度值為橫坐標(biāo)，基因名為縱坐標(biāo)繪制條形圖（圖2）。JUN、AKT1、IL6、TP53以及MAPK1等排名前10的基因可能是刺老苞防治肌肉減少癥的核心基因。

圖1 潛在PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Protein-protein interaction network of potential targets

圖2 PPI互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)Fig.2 The core targets of the protein-protein interaction network

2.4 可視化網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Cytoscape軟件構(gòu)建“刺老苞-活性成分-靶點(diǎn)-肌肉減少癥”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。圖中包括73個節(jié)點(diǎn)，144條邊，其中靶點(diǎn)64個，活性成分7個，疾病和藥物各1個。同一成分對應(yīng)多個作用靶點(diǎn)和多個成分對應(yīng)同一靶點(diǎn)的關(guān)系，體現(xiàn)了刺老苞多成分多靶點(diǎn)治療肌肉減少癥的特點(diǎn)。對圖中節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治觯l(fā)現(xiàn)槲皮素節(jié)點(diǎn)度值明顯高于其他成分，表明其可能是刺老苞治療肌肉減少癥的關(guān)鍵成分。

圖3 刺老苞-活性成分-靶點(diǎn)-肌肉減少癥互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Aralia echinocaulis active components-targets-sarcopenia network

2.5 GO分析及KEGG富集分析

GO功能富集分析涉及生物過程（biological process，BP）456條，分子功能（molecular function，MF）57條，細(xì)胞組分（cellular component，CC）43條。選取FDR排名前10的基因繪制條形圖（圖4）。KEGG 通路分析涉及106條通路，篩選前15條通路進(jìn)行分析（表1），主要涉及TNF、FoxO以及PI3K-Akt信號通路等。運(yùn)用RStudio軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化分析（圖5），其中，氣泡面積大小反映該通路富集基因數(shù)目的多少，氣泡顏色深淺反映富集的顯著程度。氣泡越大表明富集到的基因數(shù)越多；氣泡顏色越淺表明富集的顯著程度越高。PI3K-Akt信號通路氣泡面積大且顏色淺，可作為刺老苞治療肌肉減少癥的主要通路。

圖5 KEGG通路富集氣泡圖Fig.5 KEGG pathway enrichment bubble map

表1 KEGG通路富集分析結(jié)果Tab.1 KEGG enrichment analysis results

圖4 GO富集分析結(jié)果Fig.4 GO enrichment analysis results

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)刺老苞治療肌肉減少癥的7個活性成分和64個潛在靶點(diǎn)，其中槲皮素度值最高。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用［6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過減少過氧化氫生成和提高線粒體抗氧化能力增加成肌細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，防止肌肉萎縮。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出度值排名前10的靶蛋白，這些靶蛋白很可能在刺老苞治療肌肉減少癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，AP-1 轉(zhuǎn)錄因子亞基可誘導(dǎo)肌原素分化進(jìn)而引發(fā)肌細(xì)胞分化［8］。蛋白激酶Bα能抑制肌生成素的轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)骨骼肌分化［9］。不同濃度白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）可誘導(dǎo)成肌細(xì)胞增殖與分化［10］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）可誘導(dǎo)肌肉萎縮，在肌肉病理機(jī)制中起到重要作用［11］。這些核心靶點(diǎn)參與成肌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物過程。

研究［12-17］報道，KEGG分析中 的HIF-1、TNF、FoxO以及PI3K-Akt信號通路是目前研究肌肉減少癥的主要通路。氣泡圖結(jié)果表明，PI3K-Akt通路很可能是刺老苞治療肌肉減少癥的一條重要通路。PI3K/AKT信號通路在骨骼肌修復(fù)再生方面發(fā)揮著重要作用，其不僅可以上調(diào)信號通路的蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)磷酸化過程、促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化、抑制細(xì)胞凋亡，還能促進(jìn)骨骼肌蛋白合成、骨骼肌再生以及修復(fù)損傷［12-13］。轉(zhuǎn)錄因子FoxOs可以通過促進(jìn)肌細(xì)胞中特異性分化因子MyoD的表達(dá)影響肌纖維分化［14］。TNF-α在肌肉再生中對肌肉細(xì)胞有直接作用，在炎性和非炎性肌病中與肌纖維再生有關(guān)［15］。HIF-1可通過調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的紅細(xì)胞生成和血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的血管生成來增加氧轉(zhuǎn)運(yùn)，有助于骨骼肌對耐力運(yùn)動的適應(yīng)過程［16］。其中血管內(nèi)皮生長因子可刺激肌肉血管生成和成肌細(xì)胞增殖［17］。

綜上所述，本研究通過液質(zhì)聯(lián)用和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了刺老苞治療肌肉減少癥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用網(wǎng)絡(luò)，揭示了刺老苞多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同發(fā)揮治療作用的特點(diǎn)，從理論層面預(yù)測了刺老苞治療肌肉減少癥可能的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供思路，但仍需更多相關(guān)的分子以及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。