吳思，路一平，王馨藝，孫崢嶸

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽 110004）

宮頸癌在全球所有癌癥中發(fā)病率排名第14位，在女性癌癥中排名第4位［1-2］。已知宮頸癌發(fā)病機(jī)制主要是以破壞正常細(xì)胞為前提，而原代培養(yǎng)細(xì)胞由于離體時(shí)間短，遺傳性狀更接近體內(nèi)細(xì)胞的原始狀態(tài)，適合用于觀察細(xì)胞形態(tài)、分化及功能學(xué)等研究［3］，建立正常宮頸上皮原代細(xì)胞有利于更好地了解人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染宮頸上皮細(xì)胞所導(dǎo)致的病理學(xué)改變。而宮頸癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)則可以更加真實(shí)地反映人體細(xì)胞在癌癥發(fā)生后的功能學(xué)改變，因此宮頸上皮原代細(xì)胞的培養(yǎng)至關(guān)重要。

上皮細(xì)胞培養(yǎng)的難點(diǎn)在于細(xì)胞分離后具有增殖能力的底層細(xì)胞數(shù)量較少，在后期的培養(yǎng)過程中很容易被成纖維細(xì)胞污染［4］。此前已經(jīng)有許多關(guān)于宮頸上皮細(xì)胞分離方法的嘗試，包括中性蛋白酶聯(lián)合法、Ⅰ型膠原酶法等進(jìn)行組織消化分離［5］。也有研究［6］表明，采用無血清培養(yǎng)基K-SFM進(jìn)行原代培養(yǎng)，不但可以有效防止成纖維細(xì)胞的過快生長，還能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長。盡管宮頸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法有很多，但國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的宮頸原代培養(yǎng)方案，嚴(yán)重阻礙了以原代宮頸細(xì)胞為模型的相關(guān)宮頸疾病的研究。本文就正常宮頸和宮頸癌如何簡便準(zhǔn)確地分離原代細(xì)胞進(jìn)行了探討，并成功建立了新的分離方法。

1 材料與方法

1.1 組織來源

選取2019年5月至2019年12月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的4例患者的正常宮頸組織進(jìn)行原代正常宮頸細(xì)胞培養(yǎng)，年齡40～50歲；另選取因?qū)m頸活檢提示為宮頸鱗狀細(xì)胞癌行全子宮切除術(shù)的4例患者的宮頸癌組織進(jìn)行原代宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)，年齡35～55歲。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

K-SFM 培養(yǎng)基（美國 Gibco公司），Dispase Ⅱ型（美國Sigma公司），膠原酶Ⅰ型（美國Sigma公司），0.25%胰酶-EDTA（中國Solarbio公司），D-PBS（中國solarbio公司），DMEM/F12培養(yǎng)基（美國 Hyclone公司），胎牛血清（美國 Gibco公司），鼠尾膠原Ⅰ型（中國Solarbio公司），P40（1∶100，英國 Abcam 公司），Ki-67（1∶100，英國 Abcam公司），P16（1∶100，英國Abcam公 司），CD326（1∶200，美國 CST公司），Dylight488（1∶200，中國 Abbinke公司），Dylight594（1∶200，中國Abbinke公司）二抗（1∶200），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司），熒光顯微鏡（日本 Nikon 公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1 正常宮頸上皮原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：取正常宮頸組織標(biāo)本，置于無菌離心管中，加入 DMEM培養(yǎng)液，30 min內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；D-PBS清洗5遍，用預(yù)冷后的3 mL DispaseⅡ+7 mL DMEM的消化液，消化20 h；取出消化好的組織，室溫放置1 h，放入新的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷將鱗狀上皮與下面的組織分離開，D-PBS清洗；將分離出來的鱗狀上皮組織剪碎，胰酶消化10 min；立即用等量的含有血清的培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打混勻成單細(xì)胞懸液；用200目的細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清，加入5%FBS的KFSM培養(yǎng)基重懸；將單細(xì)胞懸液加入用鼠尾膠原包被好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后首次換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合70%～80%；14 d后進(jìn)行首次傳代。

1.3.2 宮頸鱗狀細(xì)胞癌原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng)：取宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本，置于無菌離心管中，加入DMEM培養(yǎng)液，30 min內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；眼科剪剔除壞死組織及血漬，D-PBS清洗5遍；眼科剪將組織剪碎，加入3 mL的胰酶37 ℃、5%二氧化碳孵箱靜置消化 30 min，組織消化為黏糊狀；將消化好的組織移至15 mL離心管中，1 500 r/min離心3 min，棄上清，加入膠原酶Ⅰ型5 mL，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中振蕩消化30～60 min，至組織完全溶解；用含10%FBS血清的DMEM/F12等體積中和，200目濾網(wǎng)過濾，過濾后的細(xì)胞懸液1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，加入5%FBS的KFSM培養(yǎng)基重懸；將單細(xì)胞懸液加入用鼠尾膠原包被好的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后首次換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合70%～80%；14 d后進(jìn)行首次傳代。

1.4 細(xì)胞鑒定

采用免疫細(xì)胞熒光染色法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。將密度為4×105/ mL的細(xì)胞接種到包被含爬片的12孔板中，每個(gè)板接種8個(gè)孔，每個(gè)孔加入1 mL的細(xì)胞懸液。2孔行Ki-67+P16雙染，2孔行P40，2孔行CD326，1孔作為陰性對(duì)照（PBS代替一抗），1孔備用，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合，PBS洗滌2次后將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，吸去固定液，PBS洗滌3次，每次5 min；加入0.3%Triton-100穿孔15 min，吸去Triton-100，PBS洗滌3次，每次5 min；加入封閉液，封閉1 h，吸去封閉液，每孔加入150 μL一抗，4 ℃過夜；吸去一抗，PBS洗滌3次，每次5 min；每孔加入150 μL的相應(yīng)抗鼠或抗兔二抗，避光孵育1 h；吸去多余的二抗，PBS洗滌3次，每次5 min；取出爬片，用含DAPI的封片劑將爬片封閉到玻片上，鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

2 結(jié)果

2.1 宮頸正常上皮細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

正常宮頸原代培養(yǎng)2 d后首次貼壁，細(xì)胞貼壁伸展，呈多角形，成團(tuán)聚集生長，胞核明顯，周圍有少量成纖維細(xì)胞圍繞上皮細(xì)胞，呈紡錘形或梭形（圖1A），細(xì)胞從培養(yǎng)的第7天開始生長速度明顯增快（圖1B），培養(yǎng)至第14天時(shí)細(xì)胞融合可達(dá)70%～80%，細(xì)胞之間排列緊密，胞核明顯，呈典型的宮頸上皮細(xì)胞，胞質(zhì)大胞核?。▓D1C），傳代細(xì)胞接種24 h即可貼壁，可傳4～5代，細(xì)胞形態(tài)呈多角或圓形，胞質(zhì)豐富，胞核清晰，可見明顯核仁，增殖速度較快（圖1D）。

圖1 正常宮頸上皮細(xì)胞形態(tài)×200Fig.1 Cellular morphology of primary cells from normal cervical squamous cells ×200

2.2 宮頸正常上皮細(xì)胞鑒定

對(duì)傳代的宮頸上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色（圖2），CD326、P40、P16胞質(zhì)呈紅色熒光，Ki-67胞核呈綠色熒光：CD326，P40表達(dá)強(qiáng)陽性，代表此細(xì)胞為鱗狀上皮細(xì)胞；P16表達(dá)弱陽性，Ki-67僅幾個(gè)細(xì)胞表達(dá)，證明此細(xì)胞增殖活性差，為正常鱗狀上皮細(xì)胞。

圖2 正常宮頸上皮細(xì)胞熒光鑒定Fig.2 Identification of primary normal cervical squamous cells by immunofluorescence

2.3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

原代宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞培養(yǎng)2 d后首次貼壁，細(xì)胞貼壁伸展，呈多角形或圓形，成團(tuán)聚集生長，周圍有大量成纖維細(xì)胞圍繞上皮細(xì)胞呈旋渦狀或放射狀排列，呈紡錘形或梭形（圖3A），由于成纖維在胰酶消化時(shí)可較快脫壁，所以在培養(yǎng)第5天時(shí)，采用胰酶消化1 min后進(jìn)行吹打，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞明顯減少，且上皮細(xì)胞只有少量損失，消化后上皮細(xì)胞生長速度明顯加快。細(xì)胞從培養(yǎng)的第7天開始生長速度明顯增快（圖3B），培養(yǎng)至第14天細(xì)胞融合可達(dá)70%～80%，細(xì)胞之間排列緊密，胞核明顯，呈典型的鋪路石樣形態(tài)（圖3C），傳代細(xì)胞接種24 h貼壁，可傳5～6代，細(xì)胞形態(tài)呈多角或圓形，胞質(zhì)豐富，胞核清晰，可見明顯核仁，增殖速度較快（圖3D）。

圖3 宮頸癌細(xì)胞形態(tài)×200Fig.3 Cellular morphology of primary cells from cervical squamous cell carcinoma tissues×200

2.4 宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞鑒定

傳代的宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的免疫熒光染色（圖4），CD326、P40、P16胞質(zhì)呈紅色熒光，Ki-67胞核呈綠色熒光：CD326，P40表達(dá)強(qiáng)陽性，代表此細(xì)胞為鱗狀上皮細(xì)胞；P16表達(dá)陽性，Ki-67廣泛表達(dá)于細(xì)胞核中，證明此細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，為宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞。

圖4 宮頸癌細(xì)胞熒光鑒定Fig.4 Identification of primary cells from the cervical squamous cell carcinoma tissues by immunofluorescence

3 討論

本研究結(jié)果顯示，原代上皮細(xì)胞可以在含有低濃度 FBS 的 K-SFM 中培養(yǎng)，而無需成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。既往研究［3］證實(shí)，成纖維細(xì)胞在正常濃度的 FBS培養(yǎng)中迅速生長，上皮細(xì)胞在后續(xù)的培養(yǎng)中極易被成纖維細(xì)胞污染。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)中選擇了低濃度FBS的K-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行宮頸上皮細(xì)胞的純化，得到了高度純化的宮頸上皮細(xì)胞培養(yǎng)物。

有研究［4］運(yùn)用Ⅰ型膠原酶成功分離出正常宮頸上皮細(xì)胞。但在本研究中發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原酶對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的分離效果較好，細(xì)胞獲得量尚可，但對(duì)正常宮頸上皮細(xì)胞分離效果較差，因此本研究按照文獻(xiàn)［4］中的方法將剪碎的正常組織置于Ⅰ型膠原酶溶液中，37 ℃ 恒溫振蕩器中以 200 r/min消化 40 min，組織消化明顯不夠充分，細(xì)胞篩過濾細(xì)胞溶液，并將單細(xì)胞懸液置于事先包被Ⅰ型鼠尾膠原蛋白的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)獲得的細(xì)胞以成纖維細(xì)胞為主，這一結(jié)果在李雅等［5］的研究中也得到驗(yàn)證。研究［7-8］發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶作用于細(xì)胞間橋，可將上皮組織與結(jié)締組織完全分開，而不破壞基底層細(xì)胞，故針對(duì)正常宮頸上皮細(xì)胞本研究采用中性蛋白酶聯(lián)合胰酶-EDTA 法進(jìn)行細(xì)胞分離，結(jié)果顯示聯(lián)合法分離的正常宮頸細(xì)胞成功率高、細(xì)胞純度高、細(xì)胞貼壁好。對(duì)分離培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行1∶2傳代，正常宮頸上皮細(xì)胞可傳代4～5次，而宮頸癌細(xì)胞則可傳代5～6次。在細(xì)胞生長過程中，可利用形態(tài)最好、增殖速度最快的三、四代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)及功能學(xué)研究。

通過CD326和P40進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光鑒定，證明了原代培養(yǎng)細(xì)胞首次傳代后的細(xì)胞均為上皮細(xì)胞。已知P16是一種細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子，Ki-67是一種核增殖基因。在正常條件下，2種分子不會(huì)共表達(dá)，當(dāng)P16和Ki-67出現(xiàn)共表達(dá)時(shí)提示細(xì)胞周期失調(diào)，可以預(yù)測宮頸病變的存在［9］。本研究選取P16和Ki-67進(jìn)行熒光雙染細(xì)胞鑒定，結(jié)果表明正常宮頸上皮細(xì)胞P16表達(dá)很弱，Ki-67只有少數(shù)細(xì)胞表達(dá)，而宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞P16和Ki-67均表達(dá)強(qiáng)陽性，進(jìn)而證明了細(xì)胞分離的可靠性與真實(shí)性。

綜上所述，本研究展示了一種改良的上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法，可以通過不同的消化方法增強(qiáng)不同級(jí)別宮頸上皮細(xì)胞的獲得率，改變培養(yǎng)基血清含量進(jìn)而凈化原代培養(yǎng)中的上皮細(xì)胞。這種培養(yǎng)技術(shù)簡單、實(shí)用、可靠；并且可以產(chǎn)生高度純化的宮頸上皮細(xì)胞，此方法的建立也為宮頸病變的研究提供了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。