陳曉媚 馬圓媛 聶 靜 朱風新

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腎內科，廣州 510000 )

急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)是由多種病因引起的腎功能快速下降而出現的臨床綜合征，具有高發(fā)病率和高病死率。流行病學研究[1]顯示，目前我國每年大約有300萬患者發(fā)生AKI，與未發(fā)生AKI的人群相比，AKI患者患慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)的風險增加8.8倍，患終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)的風險增加3.1倍。延緩AKI向CKD的進展，將縮短患者住院時間，降低患者的病死率和醫(yī)療負擔。但目前關于AKI向CKD轉化的確切機制還未完全闡明。腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells, RTECs)是腎臟功能最主要的執(zhí)行者，也是AKI最主要的受損細胞。損傷較輕時，存留下來的RTECs出現短暫的適應性再生表型，通過增殖與分化產生成熟的RTECs，進而使腎功能得以恢復；當損傷較重或持續(xù)存在時，RTECs則進行不恰當的修復，不能完成正常的增殖分化，并持續(xù)分泌炎性因子和促纖維化因子，直至死亡，從而導致腎臟結構不可逆性破壞[2]。因此，RTECs的損傷和修復是影響AKI轉歸的核心環(huán)節(jié)。本文將從細胞死亡、RTECs損傷后適應不良性修復機制、與其他細胞之間的對話3個方面，綜述RTECs損傷修復的作用及機制的最新進展。

1 AKI中RTECs的死亡形式

RTECs的死亡是公認的促進AKI發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。既往研究[3-4]證實凋亡和壞死是RTECs的死亡形式。調節(jié)性壞死(regulated necrosis, RN)，定義為受到信號通路高度調控且具有壞死的形態(tài)學特征的非凋亡性細胞死亡途徑[5]。RN的共同終點是細胞膜破裂和損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)釋放，導致炎癥激活。RN有幾種形式：壞死性凋亡、細胞焦亡、鐵死亡等。近年研究[6]證實AKI中RTECs發(fā)生RN。

1.1 壞死性凋亡

壞死性凋亡是一種由受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)、RIPK3和混合系激酶區(qū)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)介導的程序性細胞壞死。機制上，壞死性凋亡最主要的觸發(fā)因子是腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)，也可由TNF-α死亡配體家族的其他成員引起，如Fas配體、干擾素(interferon, IFN)等[7]。當TNF-α與其受體結合時，受體相關復合物聚集，RIPK1和RIPK3通過與RIP同型相互作用基序相互作用導致RIPK3的磷酸化和激活。接著，RIPK3催化MLKL的磷酸化和低聚化，由此誘導分子開關，導致細胞膜破裂和細胞死亡，促進了壞死性凋亡信號轉導[8-9]。在腎臟，給予RIPK1抑制劑necrostatin-1(Nec-1)可緩解由缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)誘導的AKI，首次證實壞死性凋亡參與AKI的發(fā)生[10]。后來陸續(xù)發(fā)現壞死性凋亡在順鉑、橫紋肌溶解、葉酸等多種因素誘導的AKI中均發(fā)揮作用。Chen等[11]研究發(fā)現，抑制RTECs的壞死性凋亡，可顯著減少腎間質巨噬細胞浸潤，降低IRI后持續(xù)的炎癥反應，不僅可以改善AKI，還可以延緩AKI向CKD的進展。且在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)的小鼠CKD模型中也發(fā)現，RTECs的壞死性凋亡促進腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展[12]。因此，靶向抑制RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路可以作為AKI及腎臟纖維化的治療靶點。目前多種壞死性調節(jié)抑制劑已作為抗癌藥物進入臨床試驗，但其相關毒副作用是否適用于腎臟疾病患者仍有待觀察。

1.2 細胞焦亡

細胞焦亡是一種由成孔蛋白Gasdermin介導的炎性程序性細胞壞死。研究[13-14]顯示，細胞焦亡期間，細胞內炎癥小體形成并活化，激活caspase-1和caspase-11，進而對白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-18前體進行切割，形成有活性的IL-1β/18，誘導炎癥反應。近來研究[15]證實，caspase-1和caspase-11均可切割Gasdermin D(GSDMD)，后者釋放形成質膜孔道的N端活性片段，導致滲透性腫脹和細胞膜破裂，并迅速釋放胞質內容物，促進細胞焦亡發(fā)生。在順鉑或IRI誘導的AKI動物模型中，caspase-1/11-GSDMD依賴地RTECs焦亡觸發(fā)腎小管損傷、尿IL-18的排泄以及腎功能的惡化[16]。因此，GSDMD的切割及IL-1β和IL-18前體的切割活化是細胞焦亡的關鍵信號。近年來的研究[17]證實，RTECs焦亡參與了腎間質纖維化的發(fā)生發(fā)展。在敲除NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)基因的小鼠UUO模型中，活化的caspase1/IL-1β/IL-18顯著降低，腎間質纖維化明顯改善。

GSDMD的切割并不是細胞焦亡的唯一“殺手锏”，Gasdermin E(GSDME)經caspase-3切割后釋放的N端片段，也可導致細胞焦亡。2021年有研究[18-19]顯示，GSDME切割后的N端在順鉑誘導的AKI模型及UUO和5/6腎切除術(5/6 nephrectomy, 5/6Nx)誘導的CKD模型中表達均顯著升高，且GSDME缺失或藥物抑制對腎臟炎癥反應、腎功能損傷和腎間質纖維化均有緩解作用，證明GSDME在AKI及AKI到CKD的進程中均發(fā)揮了作用。但目前仍缺乏關于RTECs焦亡的分子機制和作用的研究。

1.3 鐵死亡

鐵死亡是一種新型的鐵依賴性的細胞死亡方式，以細胞內鐵超載、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)耗竭和胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄積導致脂質過氧化物大量堆積為主要特征[20]。鐵死亡的關鍵媒介包括胱氨酸/谷氨酸反向轉運體(System Xc-)和谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)。研究[21]顯示，GPX4敲除引起脂質過氧化蓄積，導致RTECs發(fā)生鐵死亡，從而誘發(fā)自發(fā)性AKI。后來，在包括IRI、順鉑、葉酸、橫紋肌溶解等多種原因誘導的AKI模型中，陸續(xù)證實RTECs確實存在鐵死亡，并且目前認為在葉酸誘導的AKI小鼠模型中，鐵死亡是腎小管細胞的主要死亡方式[22]。Yang等[23]發(fā)現抑制鐵死亡可顯著減輕小鼠UUO模型中的腎間質纖維化。但是，關于鐵死亡發(fā)揮效應的確切分子機制還有待進一步完善。

2 RTECs損傷后適應不良性修復機制

AKI發(fā)生后，如果損傷因素持續(xù)存在，則RTECs修復不良，出現線粒體功能障礙、細胞周期阻滯和細胞衰老，以及上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，誘發(fā)腎間質持續(xù)性炎癥反應，促進腎間質纖維化。

2.1 線粒體功能障礙

腎小管具有強大的重吸收功能，大約70%的腎小球濾液及其溶質在近端小管重吸收[24]。AKI發(fā)生后，RTECs線粒體出現不同程度的功能障礙，表現為線粒體生物合成、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS)、線粒體動力學異常，導致線粒體膜電位下降、ROS產生增加，以及炎癥反應的加重。線粒體功能障礙持續(xù)存在可誘導AKI逐漸發(fā)展為CKD。

2.1.1 線粒體生物發(fā)生受損

過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha, PGC-1α)是線粒體生物發(fā)生的主要調控分子[25]。PGC-1α通過刺激線粒體生物發(fā)生，以維持線粒體數量和功能的穩(wěn)定。RTECs主要依靠線粒體脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)作為燃料來源并通過OXPHOS產生ATP。在小鼠AKI和CKD模型中均觀察到PGC-1α表達降低，在人CKD腎活檢標本和小鼠腎間質纖維化模型中，FAO的關鍵酶及關鍵轉錄調節(jié)因子表達均下調，相反，增加RTECs中PGC-1α的表達可以改善線粒體生物發(fā)生和OXPHOS，改善腎臟疾病進程。并且在動物模型中給予FAO激動劑非諾貝特可減輕腎間質纖維化[26-29]，提示盡早恢復FAO可以一定程度上延緩AKI向CKD的轉化。通過對不同培養(yǎng)條件下的腎臟類器官進行單細胞RNA測序分析，發(fā)現在促進OXPHOS發(fā)生的培養(yǎng)基中，PGC-1α及脂質代謝基因表達更高，且在該培養(yǎng)條件下，近端腎小管細胞(proximal tubular cells, PTCs)的細胞標志物表達更高[30]，提示FAO和OXPHOS是細胞分化的直接驅動因素。綜上，PGC-1α通過協調線粒體生物發(fā)生和FAO之間的復雜網絡，介導AKI的發(fā)生發(fā)展，并在AKI向CKD的轉化過程中起一定作用。

2.1.2 線粒體動力學紊亂

線粒體是一種動態(tài)的細胞器，通過融合和裂變的微妙平衡以及線粒體自噬來維持其形態(tài)及穩(wěn)定數量和質量。線粒體動態(tài)平衡受多種蛋白質調節(jié)，包括動力蛋白相關蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP1)、線粒體裂變蛋白1、線粒體裂變因子、線粒體融合蛋白1/2和視神經萎縮蛋白等[31]。Brooks等[32]首次提出線粒體斷裂是先于凋亡發(fā)生的AKI早期事件。本課題組進一步發(fā)現，在順鉑誘導的AKI小鼠模型中，Numb蛋白缺失通過增加DRP1在絲氨酸656殘基的磷酸化，加速DRP1向線粒體的募集，進而加重線粒體斷裂；給予DRP1的藥物抑制劑mdivi-1可減輕順鉑誘導的腎小管損傷和腎功能障礙[33]。因此，線粒體動力學的調節(jié)可能為防治AKI提供新視角。

2.1.3 線粒體功能障礙與炎癥反應

研究[34-36]證實，線粒體損傷可引起炎癥反應促進AKI發(fā)展為CKD。在這一過程中，環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)-干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)通路起著至關重要的作用[37-38]。在順鉑誘導的AKI小鼠模型中，線粒體DNA(mtDNA)泄漏到細胞質中激活cGAS/STING通路，敲低STING可顯著減輕mtDNA誘導的炎癥反應和腎臟損傷[38]，提示cGAS/STING通路參與AKI的發(fā)生發(fā)展。腎小管特異性缺失線粒體轉錄因子A小鼠的RTECs中線粒體功能顯著缺陷，并在6周齡時即出現腎間質纖維化，間質炎性細胞浸潤，敲除STING或藥物抑制STING活性，可減少腎間質炎性細胞浸潤，改善腎間質纖維化[39]，提示除熟知的DNA病毒等，mtDNA也可以激活cGAS/STING軸，從而導致慢性炎癥反應，加重腎臟損傷，為線粒體損傷參與腎臟疾病提供新的思路。

2.2 細胞周期阻滯

當細胞在外界因素的作用下出現DNA損傷時，細胞周期中斷，細胞將不能從上一個階段通過細胞周期檢查點進入下一個階段，這種現象稱為細胞周期阻滯[40]。在G1期，細胞周期蛋白依賴性激酶4/6(cyclin-dependent kinases 4 and 6, CDK4/6)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)形成的復合物磷酸化視網膜母細胞瘤抑制蛋白(retinoblastoma protein, Rb)，解除后者對轉錄因子E2F的抑制作用，使細胞正向進入細胞周期，活化的E2F促進CDK2與Cyclin E結合，又進一步磷酸化Rb。DiRocco等[41]發(fā)現，在順鉑或IRI誘導的AKI小鼠模型中，給予CDK4/6的小分子抑制劑PD 0332991抑制CDK4/6，誘導短暫的G0/G1阻滯，可減輕RTECs損傷，減少腎間質炎癥細胞浸潤。然而，G2/M阻滯是AKI進展為CKD的重要機制，Yang等[42]在急慢性腎損傷模型中均發(fā)現RTECs受損后阻滯于G2/M期，激活c-Jun氨基末端激酶信號通路，上調轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)和結締組織因子(connective tissue growth factor, CTGF)的表達，促進腎間質炎癥浸潤和細胞外基質(extracellular matrix, ECM)沉積，導致腎間質纖維化。本課題組以往的研究[43]揭示，在UUO模型中，PTCs中Numb的表達上調，在體外培養(yǎng)的PTCs中過表達Numb導致更多的細胞停留在G2/M期并上調TGF-β1和CTGF的表達，PTCs特異性地敲除Numb可以抑制G2/M阻滯，減輕腎間質纖維化。本團隊新的研究[44]進一步顯示Numb過表達可以升高缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的蛋白水平，沉默HIF-1α可以阻斷Numb過表達誘導的PTCs的G2/M阻滯。值得注意的是，處于周期阻滯的RTECs可出現細胞衰老并喪失增殖能力。衰老的細胞同時伴有細胞表型的變化，表現為衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP),通過自分泌和旁分泌方式釋放促炎因子和細胞外基質等，影響自身或臨近的細胞。2019年，Canaud等[45]發(fā)現了一種新的不典型的細胞周期蛋白(Cyclin G1)，觀察到阻滯于G2/M期的RTECs中Cyclin G1的表達升高，促進雷帕霉素-自噬空間耦合室的靶點的形成，誘導促纖維化因子的分泌，出現類似于SASP的變化，從而促進腎間質纖維化。綜上，RTECs周期阻滯和衰老在AKI向CKD的轉變中發(fā)揮重要作用。雖然目前關于調控RTECs周期阻滯的關鍵分子的研究已經很多，但這些分子對RTECs周期阻滯的具體調控信號通路仍尚未清楚，這是值得我們進一步去思考和探索的問題。

2.3 上皮-間充質轉化

上皮-間充質轉化是指完全分化的上皮細胞向成纖維細胞表型轉變的過程，包括增強的遷移能力、侵襲性，以及生成過量的ECM。以往的研究[46]顯示，發(fā)生EMT的RTECs是活化的肌成纖維細胞的重要來源。Iwano等[47]在小鼠UUO模型的腎臟中，通過細胞譜系追蹤實驗，證實腎間質36%的成纖維細胞特異蛋白-1(fibroblast-specific protein-1, FSP-1)(+)成纖維細胞是由PTCs轉化而來。而且在糖尿病腎病、5/6Nx、慢性移植腎病等的動物模型及人腎臟活檢標本中均發(fā)現了RTECs EMT的證據。然而，Zeisberg等[48]和LeBleu等[49]用類似的細胞示蹤技術，證實大多數經EMT而來的肌成纖維細胞實際上是由血管內皮細胞轉化而來，由RTECs轉化而來的僅占5%。因此，RTECs的EMT是否是活化的肌成纖維細胞的重要來源仍存在爭議。近年來，不少研究者[50-51]觀察到受損的RTECs能同時表達上皮細胞和間充質細胞的標志物，但RTECs并不直接遷移到腎間質，而是分泌促纖維化因子，傳遞至腎間質，誘導肌成纖維細胞活化，導致腎間質纖維化，這一現象被稱為部分EMT(partial EMT)。Lovisa等[51]發(fā)現，過表達正向調控EMT的轉錄因子Twist1或Snail1，可以誘導RTECs發(fā)生partial EMT，同時細胞出現G2/M阻滯。此外，研究[52-53]證實多個細胞內信號傳導通路，包括TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin和Notch等信號通路，在EMT中發(fā)揮調控作用。Pyo等[54]的研究表明，長期暴露于赭曲霉素A(ochratoxin A)的腎臟可出現EMT，進一步在體內和體外模型中發(fā)現，ochratoxin A是通過TGF-β1/Smad2/3和Wnt1/β-catenin信號通路誘導RTECs發(fā)生EMT，進而引起腎間質纖維化。因此，EMT在AKI的損傷后不良修復及腎間質纖維化中可能起著重要的作用。值得注意的是，目前學者們對于EMT的認識仍存在爭議，未來的研究方向仍是尋找更加確鑿的證據來證明EMT的重要性。

3 RTECs與其他細胞之間的對話

現已明確，AKI發(fā)生后，受損的RTECs與腎間質其他固有細胞，如炎癥細胞和成纖維細胞之間的交流介導AKI的發(fā)展，促進AKI發(fā)展為CKD。

3.1 RTECs與巨噬細胞之間的對話

AKI后持續(xù)存在的慢性炎癥反應是AKI向CKD轉化的重要推手，腎間質炎癥細胞的浸潤和活化是AKI后炎癥發(fā)生的主要途徑，而巨噬細胞是促進腎臟炎癥和纖維化的主要炎癥細胞。近年來，實驗[55]證實，RTECs與巨噬細胞之間的交流在RTECs的損傷與修復中發(fā)揮重要作用。受損的RTECs可分泌TNF-α、IL-1β等促炎細胞因子，招募巨噬細胞進入損傷部位，導致損傷小管局部微環(huán)境的變化，從而進一步促進腎小管損傷[56]。Lv等[57]發(fā)現在小鼠腎損傷模型和IgA腎病患者中富含趨化因子配體2(c-c motif chemokine ligand 2, CCL2) mRNA的外泌體從RTECs向巨噬細胞傳遞炎癥信號，最終導致巨噬細胞的激活和遷移，進而促進了腎小管間質炎癥，提示RTECs與巨噬細胞之間可通過外泌體進行細胞間通訊。有趣的是，RTECs與巨噬細胞之間的作用并不僅僅是單向的。蔣文娟等[58]發(fā)現RTECs來源地富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(leucine-rich-alpha-2-glycoprotein-1, LRG1)的外泌體以轉化生長因子-β受體1(transforming growth factor-beta recepter 1，TGF-βR1)依賴的方式激活巨噬細胞，并誘導巨噬細胞釋放富含TNF-α相關凋亡誘導配體的外泌體，通過死亡受體5信號途徑誘導受損的RTECs細胞發(fā)生凋亡?？傊?，RTECs與巨噬細胞之間的對話使腎間質炎癥反應不斷升級，致使損傷的腎小管不能正常修復，最終發(fā)展為腎間質纖維化。

3.2 RTECs與成纖維細胞之間的對話

RTECs在適應性不良修復過程中常伴隨著大量促纖維化因子的表達，包括：TGF-β1、CTGF和Wnt等，他們可作用于成纖維細胞，誘導其轉化為肌成纖維細胞，活化的肌成纖維細胞進一步增殖并合成和分泌大量的ECM，促進腎間質纖維化的發(fā)展[59]。因此，RTECs與成纖維細胞之間的對話在AKI向CKD進展中具有重要意義。Hong等[60]觀察到RTECs來源的LRG1可以增加腎小管細胞中TGF-β/Smad3信號級聯，并以旁分泌方式增強間質中成纖維細胞的TGF-β介導的Smad3激活，進而誘導促纖維化基因的表達，促進腎小管間質纖維化。同時，活化的肌成纖維細胞也可以反過來加重RTECs的損傷。在UUO模型中，成纖維細胞特異性過表達絲氨酸/蘇氨酸激酶90 000核糖體蛋白S6激酶1(Ser/Thr kinase 90 000 ribosomal protein S6 kinase 1, p90RSK)的小鼠，通過ROS激活β-catenin/FOXO1信號通路，誘導RTECs凋亡，促進腎間質纖維化[61]。Zhou等[62]發(fā)現，經TGF-β1處理的成纖維細胞的細胞培養(yǎng)基中分離出的微囊泡中，miR-34a顯著上調，這些微囊泡將上調的miR-34a從成纖維細胞傳遞到RTECs，誘導RTECs發(fā)生凋亡。綜上，在AKI向CKD轉化中，RTECs和成纖維細胞之間存在串擾，這種串擾主要是通過促炎因子和促纖維化因子實現的，這也引起研究者的進一步思考，是否對這些相關因子進行干預就可以有效阻斷AKI向CKD的轉變？

4 總結

綜上，AKI后受損的RTECs啟動適應性不良修復過程以促進向CKD轉變，其中涉及的機制極其復雜，既包括細胞自身的病理生理變化，還包括細胞與細胞之間的相互作用。特別地，關于RTECs的線粒體功能障礙方面的研究已經越來越深入，未來的重點應是為這些潛在的治療靶點尋找更多的臨床證據。另外，對于一些仍然存在爭議的機制，比如上皮間充質轉化，未來的研究應更致力于通過應用一些新的技術，例如單細胞組學、類器官模型等，深入了解RTECs損傷后的動態(tài)變化過程，以期對這些機制有更加深刻的認識和理解。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明陳曉媚、馬圓媛：論文撰寫；聶靜、朱風新：研究指導、論文修改、經費支持。