楊勇，趙陽(yáng)娟，劉希，童星

(1.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 518064；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511)

乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、非產(chǎn)孢、微需氧菌，碳水化合物的主要發(fā)酵產(chǎn)物是乳酸。乳酸菌包括球菌(Lactococcus，Leuconostoc，Oenococcus，Pediococcus，Tetragenococcus，Streptococcus，Enterococcus)和桿菌(Lactobacillus，Carnobacterium,Bifidobacterium)。這些乳酸菌中有許多是公認(rèn)的具有開(kāi)發(fā)風(fēng)味和香氣以及延緩腐敗的作用的菌。因此，傳統(tǒng)上利用這些微生物作為發(fā)酵劑進(jìn)行食品和飲料發(fā)酵，應(yīng)用于種類(lèi)繁多的農(nóng)產(chǎn)品(牛奶、肉、水果、蔬菜、谷類(lèi)等)中。存在于這些發(fā)酵劑培養(yǎng)物中的乳酸菌有助于提高感官質(zhì)量，同時(shí)通過(guò)原位產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，如乳酸、醋酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等，進(jìn)行發(fā)酵食品的保存。因?yàn)榭偟内厔?shì)是減少使用化學(xué)添加劑，因此這類(lèi)天然抑菌劑可以替代傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑，如二氧化硫、苯甲酸、山梨酸、硝酸鹽、亞硝酸鹽等。因此，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素作為生物食品防腐劑在未來(lái)食品保鮮中很有前景[1-7]。

1 細(xì)菌素

細(xì)菌素(bacteriocins)是由革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的蛋白質(zhì)化合物，主要是針對(duì)其密切相關(guān)的細(xì)菌。1928年研究人員首次發(fā)現(xiàn)了乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素。隨后該細(xì)菌素于1971年被鑒定(化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，被命名為乳酸鏈球菌素(Nisin)。早期的研究提出，存在幾種不同類(lèi)型的乳酸鏈球菌素分子。1952年，Bavin等指出乳酸鏈球菌素有兩種不同類(lèi)型的分子。同期Berridge等表明乳酸鏈球菌素可能有4種類(lèi)型,并定義為A、B、C、D，A和B的生物活性高，C和D的生物活性只有A和B的1/5。1967年，Javis報(bào)道了第5種類(lèi)型E。1991年，Mulders報(bào)道了乳酸鏈球菌素Z，除了His27變?yōu)锳sn之外，它的結(jié)構(gòu)與Nisin A一致。

Nisin表現(xiàn)了廣泛的對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用，其抑菌濃度(較低的納摩爾范圍內(nèi))對(duì)許多革蘭氏陽(yáng)性菌，包括腐敗和食源性病原體，如葡萄球菌、桿菌、肉毒梭菌、單增李斯特菌和多種抗藥性細(xì)菌。Nisin已被多國(guó)批準(zhǔn)，其廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)中作為一種安全高效的食品防腐劑已有幾十年的歷史，廣泛應(yīng)用于各種食品中。我國(guó)批準(zhǔn)其列入國(guó)標(biāo)GB 2760-86的1990年增補(bǔ)品種中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中[8]。

圖1 Nisin A的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of Nisin A

2 Nisin是羊毛硫菌素的一員[10]

過(guò)去20多年的基因組測(cè)序工作證實(shí)核糖體合成的、翻譯后修飾的肽(ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides，RiPPs)比之前預(yù)期的要普遍得多。在生命的每個(gè)階段，RiPPs在生物體的基因組中被編碼，顯示出巨大的結(jié)構(gòu)多樣性以及生物活性多樣性。它們是許多生物醫(yī)學(xué)和食品相關(guān)的研究小組關(guān)注的焦點(diǎn)。大多數(shù)的RiPPs是由一個(gè)較大的前體肽生物合成而來(lái)，前體肽包括可轉(zhuǎn)變?yōu)榻K產(chǎn)物的核心肽和一個(gè)N-或C-端延伸段(先導(dǎo)肽或追隨肽，leader or follower peptide)。這些延伸段引導(dǎo)了大多數(shù)發(fā)生在核心肽中的翻譯后修飾。RIPS通常是大環(huán)狀的，類(lèi)似于在非核糖體肽中常見(jiàn)的環(huán)化。環(huán)化可增加其自生的代謝穩(wěn)定性，改善細(xì)胞吸收和預(yù)先識(shí)別細(xì)胞目標(biāo)。

在目前已公布的基因組中發(fā)現(xiàn)含羊毛硫氨酸(lanthionine)的肽，或稱(chēng)之為羊毛硫肽(lanthipeptides)或羊毛硫菌素(lantibiotics)的生物合成基因簇的頻率，在所有RiPPs中是最高的。它們?cè)诶砘再|(zhì)上共有的特征是富含高度修飾的羊毛硫氨酸，且又具有疏水性。對(duì)羊毛硫菌素的研究，特別是對(duì)乳酸菌分泌的、熱穩(wěn)定多肽的研究成果最多，因?yàn)槠渲械囊粏T——Nisin作為食品工業(yè)中的防腐劑而最受關(guān)注。Nisin是第一個(gè)，也是迄今為止唯一一個(gè)有商業(yè)用途的羊毛硫細(xì)菌素。卓越的商業(yè)成功使乳酸鏈球菌素在細(xì)菌素中的地位達(dá)到頂峰。廣譜的抗菌活性以及作為食品工業(yè)天然防腐劑日益廣泛的應(yīng)用激發(fā)了人們對(duì)這個(gè)羊毛硫菌素分子的研究興趣。

羊毛硫菌素有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4大類(lèi)，其中Nisin屬于Ⅰ型羊毛硫菌素，包含翻譯后修飾氨基酸——羊毛硫氨酸(簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)an)和甲基羊毛硫氨酸(簡(jiǎn)寫(xiě)為MeLan，其中一個(gè)β-碳原子上有一個(gè)額外的甲基)以及它們的前體——脫氫丙氨酸和脫氫氨基丁酸。Nisin由5個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)、34個(gè)氨基酸組成，包括2個(gè)脫氫丙氨酸殘基(位置5和33)，1個(gè)脫氫氨基丁酸殘基(位置2)和5個(gè)分子內(nèi)硫醚羊毛硫氨酸橋(殘基3-7)以及甲基羊毛硫氨酸橋(殘基8-11、13-19、23-26、25-28)。在成熟過(guò)程中，1個(gè)23個(gè)殘基的N-端先導(dǎo)肽從57個(gè)殘基的前體分子中酶解而脫離，形成34個(gè)殘基、成熟的Nisin。羊毛硫菌素不尋常的多環(huán)結(jié)構(gòu)特征引起了人們對(duì)其生物合成途徑極大興趣。

3 Nisin的結(jié)構(gòu)和功能[11-12]

與其他羊毛硫菌素成員相似，Nisin A的結(jié)構(gòu)特征是存在多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸殘基，如由一系列酶介導(dǎo)的翻譯后修飾產(chǎn)生的羊毛硫氨酸(Lan)、甲基羊毛硫氨酸(MeLan)。這些修飾不僅賦予多肽的結(jié)構(gòu)和功能，而且使其具有自生抗水解和抗氧化的能力。事實(shí)上，這一系列令人滿(mǎn)意的分子特性使它們適合用于人類(lèi)和脊椎動(dòng)物的治療，以及制藥、生化、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生這類(lèi)生物活性肽，用來(lái)拮抗與其競(jìng)爭(zhēng)的其他微生物，從而使這些產(chǎn)抗菌具有選擇性?xún)?yōu)勢(shì)。這些抗菌肽與目前使用的化學(xué)治藥物的作用機(jī)制相比，對(duì)致病性微生物和臨床靶點(diǎn)的作用機(jī)理不同。

一些重量級(jí)的研究表明，乳酸鏈球菌素發(fā)揮其抗菌作用，既通過(guò)細(xì)胞膜孔的形成(它可以組裝成一個(gè)總計(jì)由4個(gè)Nisin分子和8個(gè)lipid Ⅱ分子形成的、強(qiáng)有力的“打孔器”，在目標(biāo)細(xì)菌的細(xì)胞膜上形成結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的孔洞)，又通過(guò)特異性結(jié)合脂質(zhì)Ⅱ(細(xì)胞壁的基本前體物質(zhì))，從而抑制細(xì)胞壁的合成。這種聯(lián)合作用是位于N-和C-末端的2個(gè)結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)。

N-末端結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)羊毛硫氨酸環(huán)(A、B和C)通過(guò)一個(gè)由3個(gè)氨基酸組成的柔性鉸鏈區(qū)(Asn20-Met21-Lys22)與C-末端的2個(gè)環(huán)所連接見(jiàn)圖3。已經(jīng)鑒定A、B和C環(huán)形成了一個(gè)“籠狀”的外殼，便于結(jié)合脂質(zhì)Ⅱ的焦磷酸部分，從而抑制細(xì)胞壁合成。這種結(jié)合增強(qiáng)了包含環(huán)D和E的C-末端的能力，即在細(xì)胞膜中形成孔隙，導(dǎo)致離子和細(xì)胞質(zhì)溶液快速流出。這兩種活性的綜合作用導(dǎo)致抑制敏感細(xì)菌靶點(diǎn)的最小抑制值在納摩爾范圍內(nèi)。值得注意的是，脂質(zhì)Ⅱ也是糖肽抗生素萬(wàn)古霉素的靶點(diǎn)。但是，由于Nisin在不同于萬(wàn)古霉素的部位結(jié)合脂質(zhì)Ⅱ，因此它保留了對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的革蘭陽(yáng)性病原菌的抑制活性。

4 Nisin的生物合成基因簇[13-14]

在過(guò)去的20多年中，天然產(chǎn)物肽的生物合成，無(wú)論是基因編碼還是非核糖體起源，均受到廣泛關(guān)注。Nisin的生物合成基因簇大小為15 kb左右。

包括編碼Nisin前體的結(jié)構(gòu)基因(nisA)在內(nèi)，其生物合成基因簇還有對(duì)Nisin前體進(jìn)行后修飾的蛋白基因(nisB和nisC)、前體修飾后的分泌(nisT)、自身的免疫(nisIFEG)、酶解釋放(nisP)、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(nisKR)。Nisin A的生物合成基因簇見(jiàn)圖2。

圖2 Nisin生物合成基因簇的結(jié)構(gòu)[15]Fig.2 The structure of biosynthetic gene cluster of Nisin

5 Nisin的翻譯后修飾[16]

首先，乳酸鏈球菌素前體肽(NisA)由核糖體合成，沒(méi)有活性。結(jié)構(gòu)包括N端先導(dǎo)肽以及C-末端前肽,見(jiàn)圖3。

對(duì)于Nisin A來(lái)說(shuō)，1個(gè)羊毛硫氨酸(Lan)和4個(gè)甲基羊毛硫氨酸(MeLan)的結(jié)構(gòu)是與N端先導(dǎo)肽相連的非修飾核心肽中的1個(gè)絲氨酸和4個(gè)蘇氨酸殘基脫水引入的，生成相應(yīng)的脫氫丙氨酸(Dha)和Z-脫氫氨基丁酸殘基(Dhb)，由脫水酶NisB催化。然后是nisC催化分子內(nèi)、立體選擇性Michael加成反應(yīng)，將半胱氨酸的巰基和Dha或Dhb雙鍵之間進(jìn)行加成，生成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸的硫醚交聯(lián)產(chǎn)物。在此過(guò)程中底物Ser/Thr殘基的α-碳在立體化學(xué)上被轉(zhuǎn)變?yōu)镈構(gòu)型。因?yàn)榈湫偷难蛎螂暮写罅康慕z氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸殘基，所以終產(chǎn)物是多環(huán)結(jié)構(gòu)，展示出顯著的結(jié)構(gòu)多樣性。

含有前導(dǎo)肽的Nisin隨后通過(guò)專(zhuān)門(mén)的ABC型的轉(zhuǎn)運(yùn)子nisT而被運(yùn)輸。乳鏈菌肽的抗菌特性決定了菌株必須對(duì)自身產(chǎn)物的影響免疫。由兩個(gè)不同的系統(tǒng)組成的脂蛋白nisI和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子nisFEG構(gòu)成了免疫系統(tǒng)。只有在N端前導(dǎo)序列被特殊的胞外絲氨酸蛋白酶nisP水解后，成熟的具有生物活性的nisA才被釋放,見(jiàn)圖3。乳酸鏈球菌素的生物合成被由受體組氨酸激酶(NisK)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(NisR)組成的雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)(以維持在生產(chǎn)和免疫之間的適當(dāng)平衡)。

圖3 Nisin A的翻譯后成熟過(guò)程Fig.3 Process of post-translational maturity of Nisin A

NisA前肽由核糖體合成，然后NisB催化絲氨酸和蘇氨酸殘基(下劃線)脫水。NisC以區(qū)域和立體選擇性的方式催化Cys殘基和5個(gè)Dha(綠色)和Dhb(品紅)殘基進(jìn)行共軛加成反應(yīng)，生成5個(gè)環(huán)硫醚：1個(gè)羊毛硫氨酸(紅色)和4個(gè)甲基羊毛硫氨酸(藍(lán)色)。脫水/環(huán)化完成后，未修飾的先導(dǎo)肽被NisP蛋白酶進(jìn)行水解。先導(dǎo)肽的序列是MSTKDFNLDVSVSKDSGSGR。Abu，S-2-氨基丁酸。

6 令人關(guān)注的羊毛硫氨酸形成機(jī)理[17-18]

雖然所有的羊毛硫肽都是通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸殘基脫水，生成脫水氨基酸，隨后是半胱氨酸殘基的加成，但發(fā)生這些反應(yīng)的催化機(jī)理是多樣的。目前，已經(jīng)鑒定了4種，有些在進(jìn)化上有關(guān)聯(lián)。對(duì)于Nisin和其他Ⅰ型羊毛硫肽來(lái)說(shuō)，脫水反應(yīng)由脫水酶LanB催化，環(huán)化反應(yīng)由環(huán)化酶LanC催化。LanB酶分子量較大，大約為120 kDa，并且與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他特征蛋白質(zhì)沒(méi)有同源性。NisB，即參與乳酸鏈球菌素生物合成的LanB脫水酶，需要在ATP、谷氨酸和一個(gè)尚未被鑒定的大分子的共同參與下，對(duì)前體肽中的8個(gè)Ser/Thr殘留物進(jìn)行脫水反應(yīng)。在此過(guò)程中絲氨酸和蘇氨酸的羥基首先被轉(zhuǎn)化為谷氨酰酯，然后發(fā)生消除反應(yīng)，形成碳-碳雙鍵。短暫的谷氨酰化構(gòu)成了一個(gè)新的肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾反應(yīng)類(lèi)型。此前已知的蘇氨酸谷氨?；睦硬皇浅霈F(xiàn)在肽類(lèi)或蛋白質(zhì)底物上，而是分別出現(xiàn)在谷氨酰胺和谷胱甘肽的水解反應(yīng)中，作為催化?；傅墓劝滨０访?天冬酰胺酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的中間代謝產(chǎn)物。目前尚不清楚羊毛硫菌素前體的谷氨?；降咨婕肮劝彼岬摩?還是γ-羧基。

參與Nisin生物合成的環(huán)化酶nisC的催化半胱氨酸的巰基加成形成Dha和Dhb，通過(guò)光譜分析和晶體結(jié)構(gòu)鑒定了這個(gè)酶具有一個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。與其他激活巰基親核的酶類(lèi)似，如法尼基轉(zhuǎn)移酶，Zn2+離子被認(rèn)為是可激活底物肽中半胱氨酸巰基。NisC不僅與法尼基轉(zhuǎn)移酶的催化機(jī)理相似，而且在結(jié)構(gòu)上也與其具有同源性，具有相同一個(gè)α，α-桶狀環(huán)形折疊，Zn2+離子位于桶狀結(jié)構(gòu)的頂部。有趣的是，LanB酶與其他預(yù)測(cè)的脫水酶沒(méi)有同源性，而LanC樣蛋白廣泛地在多種高等生物中，包括植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)，且功能未知。

羊毛硫肽生物合成酶最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)是控制著產(chǎn)物環(huán)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)上可以看出,目前已知的羊毛硫肽的一小部分,中每個(gè)環(huán)化酶產(chǎn)生一系列不同序列和大小的環(huán)結(jié)構(gòu)。如Nisin，脫水底物肽含有5個(gè)半胱氨酸和8個(gè)脫水氨基酸，按照上述想法，如果缺乏選擇性，環(huán)化過(guò)程中產(chǎn)生的環(huán)拓?fù)洚悩?gòu)體可達(dá)6720種。如果同時(shí)考慮所有可能形成的立體異構(gòu)體，這個(gè)數(shù)字至少是8.6×105。然而，nisC只產(chǎn)生其中的一個(gè)結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。環(huán)化酶是如何實(shí)現(xiàn)這些壯舉，對(duì)于化學(xué)家來(lái)說(shuō)，這仍然是一個(gè)懸而未決的問(wèn)題，但一些觀點(diǎn)最近開(kāi)始出現(xiàn)了。一種可能性是完全脫水的中間產(chǎn)物實(shí)際上是永遠(yuǎn)不會(huì)形成的。例如，可能是脫水酶和環(huán)化酶交替修飾底物肽，以致于環(huán)化作用在所有脫水反應(yīng)發(fā)生之前就開(kāi)始了。這種設(shè)想會(huì)減少半胱氨酸識(shí)別的親電體的數(shù)量。

7 依賴(lài)于細(xì)胞密度的調(diào)節(jié)方式

許多革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生的抗菌肽是以依賴(lài)于細(xì)胞密度的方式調(diào)節(jié)的。生產(chǎn)這些抗菌肽通常在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期和末期開(kāi)始產(chǎn)生，在穩(wěn)定期的初期達(dá)到最大值。在許多情況下，這種調(diào)節(jié)模式涉及到了扮演信息分子(肽信息素)的分泌肽。這些肽信息素在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)在環(huán)境中積累，當(dāng)達(dá)到一定的閾值濃度時(shí)，由肽信息素與其同源受體(組氨酸激酶?jìng)鞲械鞍?的相互作用而介導(dǎo)抗菌肽被大量產(chǎn)生，組氨酸激酶?jìng)鞲械鞍卓梢鹂缒ば盘?hào)傳導(dǎo)，激活抗菌肽的產(chǎn)生。這種調(diào)節(jié)模式歸為革蘭氏陽(yáng)性菌肽信息素介導(dǎo)的菌群效應(yīng)系統(tǒng)中的抗菌肽產(chǎn)生系統(tǒng)。這些系統(tǒng)涉及到了多種表型的細(xì)胞密度依賴(lài)的調(diào)節(jié)。

很明顯，控制在高細(xì)胞密度下產(chǎn)生抗菌肽在生物學(xué)上是有意義的。這種調(diào)節(jié)機(jī)制確保了環(huán)境中的抗菌肽迅速達(dá)到所需的水平殺死產(chǎn)抗細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。此外，在較高的細(xì)胞密度下大量產(chǎn)生AMP，產(chǎn)抗細(xì)胞不允許目標(biāo)微生物啟動(dòng)或形成防御反應(yīng)，從而確?？咕牡挠行浴；蛘撸覀兛梢酝评恚寒?dāng)在誘導(dǎo)物迅速擴(kuò)散到細(xì)胞環(huán)境中的生長(zhǎng)條件下，產(chǎn)抗細(xì)胞為避免無(wú)效、高水平抗菌肽的產(chǎn)生，從而防止這種誘導(dǎo)物積累到觸發(fā)生產(chǎn)抗菌肽所需的水平。

修飾和分泌組分已被證實(shí)與Nisin前體存在互相作用，一起組裝成多聚蛋白質(zhì)復(fù)合物。值得注意的是，Nisin基因簇還編碼一種胞外蛋白酶(nisP)，它參與了Nisin前體前導(dǎo)肽的去除，生成成熟的Nisin分子。基因簇還包含編碼EnvZ-OmpR類(lèi)型的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)，由傳感激酶(nisK)和一個(gè)應(yīng)答調(diào)控子(nisR)，參與nis基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期可檢測(cè)到Nisin的產(chǎn)生，在穩(wěn)定期開(kāi)始時(shí)達(dá)到最大水平。

8 nis基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

觀察到的Nisin細(xì)胞密度依賴(lài)性生產(chǎn)揭露了其在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。Nisin的生物合成基因簇包含幾個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。結(jié)構(gòu)nisA基因作為單順?lè)醋觤RNA高水平轉(zhuǎn)錄，而包含nisABTCIP的多順?lè)醋觤RNA的一部分，卻以較低的水平轉(zhuǎn)錄。

這些mRNA均由位于nisA上游的單個(gè)啟動(dòng)子控制，這些轉(zhuǎn)錄單位的差異表達(dá)可能是由nisA基因下游的一個(gè)終止子序列引起的、允許下游基因(nisBTCIP)的有限讀取。

另兩個(gè)Nisin基因簇中的轉(zhuǎn)錄單位分別包含nisRK和nisFEG，其轉(zhuǎn)錄取決于在nisR和nisF上游的啟動(dòng)子。不過(guò)，也有報(bào)道稱(chēng)nisRKmRNA也存在于源自nisA啟動(dòng)子的、含有nisABCTIPRK的多順?lè)醋觤RNA中。

很明顯，調(diào)節(jié)基因nisRK編碼的產(chǎn)物對(duì)于Nisin生物合成調(diào)控是必需的。然而它們的功能持續(xù)幾年時(shí)間是未知的，直到對(duì)Nisin的產(chǎn)生菌乳酸乳桿菌的結(jié)構(gòu)基因nisA進(jìn)行4個(gè)堿基對(duì)的缺失試驗(yàn)才回答了這個(gè)問(wèn)題。這種突變不僅導(dǎo)致預(yù)料中的Nisin生產(chǎn)能力喪失，而且完全廢除了nisA基因轉(zhuǎn)錄。通過(guò)向培養(yǎng)物中添加亞抑制量的Nisin即可恢復(fù)ΔnisA的轉(zhuǎn)錄，因此可以得出結(jié)論，Nisin不僅具有抗菌活性，而且還是信號(hào)分子。有趣的是，有幾個(gè)Nisin變種似乎或多或少具有誘導(dǎo)肽的潛力，而它們的抗菌活性與野生型Nisin相比，并不是成比例的增加或減少，這說(shuō)明這兩種活性不一定相關(guān)。此外，ΔnisA突變株中缺失nisR和/或nisK，就喪失了nisA激活ΔnisA轉(zhuǎn)錄的能力，這說(shuō)明nisA介導(dǎo)的對(duì)其編碼基因轉(zhuǎn)錄激活作用與由nisR和nisK組成的兩組分調(diào)控系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)除了抗菌肽的活性，Nisin也作為分泌肽信息素，通過(guò)菌群效應(yīng)樣的方式，觸發(fā)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，誘導(dǎo)自身的生物合成。

9 nis的啟動(dòng)子

通過(guò)引物延伸，以及與大腸桿菌中無(wú)啟動(dòng)子的β-葡萄糖醛酸酶基因(gusA)在啟動(dòng)子探針載體pNZ273上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄融合，鑒定了Nisin基因簇中的3個(gè)啟動(dòng)子。為nisA和nisF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄，是被Nisin介導(dǎo)的、依賴(lài)nisRK的信號(hào)傳導(dǎo)所觸發(fā)。而nisR啟動(dòng)子顯示不依賴(lài)Nisin、具有組成性特征。nisA和nisF啟動(dòng)子活力水平是直接依賴(lài)于胞外添加Nisin的濃度，表明誘導(dǎo)劑(Nisin)濃度和由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄水平之間存在線性劑量反應(yīng)關(guān)系。源自nisA啟動(dòng)子的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄拷貝(單獨(dú)的nisA和nisABTCIP)的相對(duì)產(chǎn)量可能維持一個(gè)均衡的水平，即Nisin前體相對(duì)于其后修飾、運(yùn)輸、加工(nisB、C、T和P)，還有免疫組分(nisI)之間的均衡。觀察到Nisin介導(dǎo)的nisF啟動(dòng)子的調(diào)控，即當(dāng)細(xì)胞遭受較高濃度Nisin時(shí)，提供更高的免疫力這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，為說(shuō)明nisFEG基因產(chǎn)物在自身細(xì)胞對(duì)Nisin的免疫中的角色提供了合理的依據(jù)。nisRK的組成型表達(dá)可能是細(xì)胞對(duì)Nisin存在的快速反應(yīng)所必需的，包括免疫反應(yīng)的快速構(gòu)建。此外，在Nisin存在的情況下，nisRK表達(dá)(作為nisABCTIPRK轉(zhuǎn)錄的一部分)的加強(qiáng)甚至可能進(jìn)一步放大Nisin觸發(fā)的反應(yīng)。

10 對(duì)Nisin的免疫和耐受[19]

3種重要的表型可導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌素不敏感：免疫與細(xì)菌素的產(chǎn)生有遺傳上的聯(lián)系，并發(fā)揮最強(qiáng)水平的非敏感性；在細(xì)菌素選擇性壓力下產(chǎn)生、自發(fā)突變株的耐受；耐受是由一種與細(xì)菌素產(chǎn)生沒(méi)有遺傳聯(lián)系的基因賦予的。所有對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐受的原因，無(wú)非就是以上3個(gè)。

Nisin的免疫遺傳決定因素被認(rèn)為是nisI。完整的Nis蛋白與其他蛋白沒(méi)有同源性，但其N(xiāo)-端與源自革蘭氏陰性菌——大腸桿菌、革蘭氏陽(yáng)性菌——枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌中的脂肽的信號(hào)肽序列有很強(qiáng)的相似性。細(xì)菌脂蛋白是一類(lèi)由脂質(zhì)部分連接的、錨定在細(xì)胞或細(xì)胞表面的跨膜蛋白。脂質(zhì)部分共價(jià)連接到位于分泌蛋白N末端的半胱氨酸殘基。nisI也具有以上結(jié)構(gòu)，被發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞膜外的膜結(jié)合脂蛋白。nisI蛋白所賦予的免疫機(jī)制仍然是推測(cè)的。當(dāng)脂質(zhì)部分附著在細(xì)胞膜的外部時(shí)，脂蛋白nisI可能通過(guò)直接與胞外Nisin相互作用或通過(guò)干擾Nisin聚集體的結(jié)合，從而阻止了通道的形成。

另外，nisE和nisG蛋白具有疏水性的6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。nisF組分包含兩個(gè)潛在的ATP結(jié)合位點(diǎn)。疏水性的nisF和nisE可形成了一個(gè)復(fù)合體。因此，有人認(rèn)為，nisF和nisE構(gòu)成一個(gè)ATP依賴(lài)轉(zhuǎn)運(yùn)體中的跨膜和ATP結(jié)合域。nisG與大腸桿菌素免疫蛋白具有同源性，可能具有類(lèi)似的功能——對(duì)Nisin免疫。

11 Nisin前體的分泌和蛋白水解激活以及前導(dǎo)肽的角色

nisP蛋白含一段N端信號(hào)序列，一個(gè)絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域以及羧端膜錨。其結(jié)構(gòu)特征說(shuō)明分泌后錨定在膜上形成定位在胞外、催化活性的N-末端尾部。沒(méi)有活性的Nisin前體可被表達(dá)nisP蛋白菌株的細(xì)胞膜所激活，而且nisP突變株分泌完全修飾但沒(méi)有后加工的Nisin前體，表明活性功能蛋白——nisP位于細(xì)胞膜上，參與Nisin的成熟。

nisT基因編碼一個(gè)600個(gè)殘基的蛋白質(zhì)，與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有很強(qiáng)的同源性。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有兩個(gè)主要的同源區(qū)域，C-端ATP結(jié)合基序和N-端的6個(gè)跨膜域。這些數(shù)據(jù)表明蛋白水解是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)膜的外膜面，隨后分泌。

細(xì)菌素先導(dǎo)肽不同于介導(dǎo)由sec依賴(lài)途徑分泌蛋白外排的N端信號(hào)序列，因?yàn)镹端信號(hào)序列缺乏10個(gè)或更多殘基的疏水跨膜拉伸和典型的蛋白水解加工位點(diǎn)。Nisin前導(dǎo)肽含有保守的殘基，如位置-2處的脯氨酸殘基，位置-6處的絲氨酸殘基和所謂的-F-N-L-D-V-box。定點(diǎn)突變表明，非常保守的脯氨酸殘基并不是加工所必需的，但位置-1處的正電荷和位置-4處的小疏水殘基是必需的。在-F-N-L-D-V-box中的苯丙氨酸、亮氨酸或天冬氨酸殘基或-6位的絲氨酸殘基的突變阻止了Nisin的生物合成，甚至不能檢測(cè)到前體。迄今為止取得的成果即利用定點(diǎn)突變清楚地證明了先導(dǎo)肽中特殊殘基對(duì)于Nisin生物合成的重要性。同時(shí)，還有證據(jù)表明酶解加工是Nisin成熟的最后一步，所以修飾反應(yīng)發(fā)生在前肽階段，前體分子是沒(méi)有活性的。因此，前導(dǎo)肽可能在生物合成中的作用，要么是因?yàn)樗赡馨粋€(gè)特定的識(shí)別基序，可使前體定位于生物合成酶；要么先導(dǎo)肽可與前肽區(qū)相互作用以穩(wěn)定構(gòu)象，此構(gòu)象對(duì)于正確的修飾至關(guān)重要。

12 Nisin成熟的概念模型[20]

因此，結(jié)合上述調(diào)查結(jié)果可得出以下Nisin生物合成的假設(shè)模型。

第一步，誘導(dǎo)信號(hào)通過(guò)雙組分信號(hào)通路激活負(fù)責(zé)表達(dá)Nisin操縱子的啟動(dòng)子。產(chǎn)抗和免疫已經(jīng)證明可自動(dòng)調(diào)節(jié)。

第二步，翻譯生成無(wú)活性、未修飾的前體肽。前體含有游離半胱氨酸和未脫水殘基。

第三步，Nisin前體分子借助于先導(dǎo)肽、定位到膜連的修飾酶nisB和nisC復(fù)合體上。

第四步，脫水以及羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸的形成。

第五步，胞外加工與分泌。Nisin前體被細(xì)胞外蛋白酶nisP激活，而nisP通過(guò)脂肪酰膜錨勾住細(xì)胞膜。分泌后活性Nisin就釋放到環(huán)境中去。

13 展望

乳酸鏈球菌素作為天然防腐劑在食品工業(yè)中廣泛地得到應(yīng)用。本文對(duì)Nisin的生物合成機(jī)理等方面進(jìn)行綜述，希望為國(guó)內(nèi)廣大研究者在發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌素方面提供一些思路。