李 慧，張 婉，李 靜，朱景樂，陳夢嬌，唐 駿，孟益德，劉 丹

（1.河南農業(yè)大學，河南 鄭州 450002；2.中國林業(yè)科學研究院 a.經濟林研究所；b.經濟林種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州 450003；3.中國農業(yè)科學院 果樹研究所，遼寧 興城 125100；4.國有信陽市平橋區(qū)天目山林場，河南 信陽 464100；5.山東省林草種質資源中心，山東 濟南 250102）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.為杜仲科杜仲屬單科單屬植物，是一種名貴的中藥材和重要的經濟樹種。杜仲多以皮入藥，但有關研究結果表明，其葉片與樹皮有著相似的化學成分和抗氧化活性，且杜仲葉片的再生能力強，葉片資源更加豐富也更容易采取[1]。黃酮類物質具有抗氧化、抗癌、增強免疫力等多種功效，是杜仲葉中一類重要的活性成分，其在杜仲葉片和樹皮中的含量相近，因此，亦可以葉片代替樹皮作為藥源[2-5]。‘華仲12 號’杜仲Eucommia ulmoides‘Huazhong No.12’是葉片變異型的杜仲品種，其葉片呈現(xiàn)紅色，與葉片呈綠色的杜仲相比，‘華仲12 號’杜仲表現(xiàn)出更加優(yōu)良的園林觀賞價值[2]。有關研究結果表明，黃酮類物質在組成和含量上的差異是影響植物葉色表現(xiàn)的重要因素，對于不同品種杜仲來說，其葉色的不同與黃酮類物質的組成和含量都有一定的相關性[6-10]。為了進一步了解‘華仲12 號’杜仲葉片呈現(xiàn)紅色的現(xiàn)象與黃酮類物質組成和含量之間的相關性，以葉片呈綠色的‘華仲11 號’為對照，檢測并分析‘華仲12 號’與‘華仲11 號’杜仲葉片中黃酮類物質的組成和含量，以期為后期關于‘華仲12 號’杜仲合理定向化利用的研究奠定基礎。

近些年來，針對杜仲葉片中生物活性物質的提取方法、藥理分析、活性物質與其生態(tài)因子間的相關性等方面的研究不斷深入[11-14]，但有關‘華仲12 號’杜仲葉片中黃酮類物質的組成成分及含量的分析鮮見報道。常用于檢測黃酮類物質的方法有超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法、紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法等，與后兩種方法相比，超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法具有自動化程度高、分離速度快、定性準確等優(yōu)點[15-17]。黃酮類物質是以2-苯基色原酮（圖1）為母核的化合物，其組分復雜，本研究運用UPLC-PDA-MS/MS 法，通過將其與標準品比對，采用色譜與質譜信息分析、數(shù)據(jù)分析等方法，對‘華仲12 號’杜仲葉片中黃酮類物質分別進行定性與定量分析，并選取葉色呈綠色的葉用型良種‘華仲11 號’杜仲Eucommia ulmoides‘Huazhong No.11’葉片作為對照材料，比較分析兩種杜仲無性系葉片中黃酮類物質組成與含量的差異情況，以期為 ‘華仲12 號’杜仲合理的定向化利用的研究奠定理論基礎。

圖1 2-苯基色原酮的化學結構式Fig.1 Chemical structure of 2-phenyl-chromone

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的‘華仲12 號’與‘華仲11 號’杜仲葉片均采自于河南省新鄉(xiāng)市原陽杜仲良種繁育圃。標準品分別為矢車菊素-3-O 葡萄糖苷、槲皮素-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁、山柰酚-葡萄糖苷，均為美國Sigma-Aldrich 公司生產。

1.2 黃酮類物質的提取與純化

將采集的‘華仲12 號’與‘華仲11 號’杜仲葉片迅速地分別置于液氮中冷凍，并利用冷凍研磨機（SPEX 公司）研磨成粉，分別稱取約為1.0 g 的樣品，加入10 mL 的甲醇（HPLC 級，美國Fisher公司），以超聲波超聲提取20 min，然后置于高速冷凍離心機（CF16RXII 式，日本日立公司）中，以10 000 r·min-1的轉速離心5 min，分別取上清液（提取液）以備用。參照相關文獻[18]中說明的方法分別進行純化，對其中的部分步驟有所改進，將所用的樣品提取液、淋洗所用的甲醇、最終定容體積均改為5.0 mL，淋洗固相萃取小柱的水體積為2.5 mL，純化后再上機檢測。

標準品的制備：每種標準品各準確稱取5.0 mg，以甲醇溶解并定容至10 mL，得到500 mg·L-1的標準品儲備液，根據(jù)需要配置成適宜濃度的標準溶液使用液。

1.3 UPLC 和MS/MS 條件

UPLC 條件：柱溫40 ℃，進樣量2.0 μL，流速0.3 mL·min-1。流動相A、B 分別為乙腈（HPLC 級，美國Fisher 公司生產）和0.5%的甲酸（LCMS 級，美國Anaqura Chemicals Supply 公司生產）。A 液的洗脫梯度為：0%，0 min；10%，1 min；20%，10 min；25%，16 min；80%，18 min；洗脫20 min后回到初始狀態(tài)，平衡5 min。

MS/MS 條件：參考有關文獻[19]進行設定。

1.4 杜仲葉片中黃酮類物質組成的鑒定與含量的測定

因為不能確認兩種杜仲葉片中所含有的黃酮類物質的具體組成，無法獲取全部相應物質標準品，對于有標準品的物質，可以利用標準品的保留時間和MS/MS 質譜信息，結合其相對分子質量及二級質譜碎片離子進行結構分析，完成對該黃酮類物質的定性分析；而對于未獲得相應標準品的物質，則可結合其苷元及糖基等信息進行鑒定。

采用相對定量的分析方法，采用正離子MRM模式，將標準品配制成不同濃度的標準溶液使用液，用外標法準確測定杜仲葉片提取液中相應物質的含量，根據(jù)標準品的峰面積及含量、從提取液中測得的其他黃酮類物質的峰面積，運用公式（1）計算出各黃酮類物質的含量。因為無法得到全部相應黃酮類物質的標準品，無法準確確定黃酮類物質的質譜響應差異，所以先假設各種黃酮類物質的質譜響應與標準品一致，即Fj=1，F(xiàn)j表示相同摩爾質量的化合物j與標準品i在相同試驗條件下檢測信號的比值，然后按式（1）計算各黃酮類組分的含量。所有的測定結果均以3 次測定值的（平均值±標準差）來表示。

式（1）中：j表示利用標準品測定其含量的某種黃酮類物質，Cj表示其含量；i為標準品；A為某種黃酮類物質的峰面積；M為某種黃酮類物質的相對分子質量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使 用Microsoft Excel 2016 和SPSS 25.0 軟 件進行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結果與分析

2.1 ‘華仲12 號’杜仲葉片中黃酮類物質的組成

‘華仲12 號’杜仲葉片中15 種黃酮類物質的色譜圖如圖2所示，各類黃酮類物質的化學結構式如圖3所示，圖2和圖3中的數(shù)字均表示峰號；15 種黃酮類物質的保留時間、分子離子的質荷比（m∶z）、碎片離子質荷比及物質組成與含量見表1，表1中的峰號分別與2 和圖3中的數(shù)字相對應。

表1 ‘華仲12 號’杜仲和‘華仲11 號’杜仲葉片中黃酮類物質組成及含量（n=3）Table 1 Composition and content of flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’ and ‘Huazhong 11’ (n=3)

圖2 ‘華仲12 號’杜仲葉片中15 種黃酮類物質的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 15 flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’

圖3 ‘華仲12 號’杜仲葉片中各類黃酮類物質的化學結構式Fig.3 Chemical structure of flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’

由表1可知，‘華仲12 號’杜仲葉片中共檢測出15 種黃酮類物質，根據(jù)其苷元結構可將15 種黃酮類物質劃分為3 類：槲皮素糖苷類有10 種，分別為槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖、槲皮素-戊糖酰-己糖酰-己糖、槲皮素-己糖-己糖、槲皮素-戊糖酰-蕓香糖苷、槲皮素-戊糖-己糖、槲皮素-脫氧己糖-己糖、槲皮素-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-丙二酰-葡萄糖苷；山柰酚糖苷類有3 種，分別為山柰酚-蕓香糖苷、山柰酚-葡萄糖苷、山柰酚-丙二酰-葡萄糖苷；矢車菊素糖苷類有2 種，分別為矢車菊素-3-桑布糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。在相同的試驗條件下，‘華仲11 號’杜仲葉片中共檢測出12 種黃酮類物質，包括槲皮素糖苷類的9 種和山柰酚糖苷類的3 種。比較分析可知，槲皮素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O 桑布糖苷、矢車菊素-3-O 葡萄糖苷此3 種物質都是‘華中12 號’杜仲葉片獨有的。

圖2A 顯示，在相同的試驗條件下，峰號分別為7、8、9 和11 的保留時間和二級質譜碎片離子的質荷比（m∶z）與其對應標準品的均相似，據(jù)此可識別出其對應的黃酮類化合物可能分別為蘆丁、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-蕓香糖苷。

由圖2A 可知，峰號1、2、3 對應的化合物分子離子的質荷比分別為773、759、627，據(jù)此可以初步判斷，峰號1、2、3 對應的物質可能分別為槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖、槲皮素-戊糖酰-己糖酰-己糖、槲皮素-己糖-己糖，測得的其相對分子質量與其對應的理論相對分子質量都相匹配。對照圖3中黃酮類物質的化學結構式分析可知，峰號1 對應的特征子離子碎片的質荷比分別為627、465、303，其代表的物質可能分別為槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖失去一分子脫氧己糖（其質荷比為627）、槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖失去一分子脫氧己糖和一分子己糖（其質荷比為465）、槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖失去一分子脫氧己糖和兩分子己糖（其質荷比均為303）的碎片離子；峰號1 對應的碎片離子的質荷比為611，其可能是槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖失去一分子己糖的碎片離子。峰號2 對應的特征子離子碎片的質荷比分別為627、465、303，其可能分別為槲皮素-戊糖酰-己糖酰-己糖失去一分子戊糖（其質荷比為627）、一分子戊糖和一分子己糖（其質荷比均為465）、一分子戊糖和兩分子己糖（其質荷比均為303）的碎片離子；峰號3 對應的特征子離子碎片的質荷比分別為465、303，其可能分別為槲皮素-己糖-己糖失去一分子己糖、失去兩分子己糖的碎片離子。

峰號4 對應的分子離子的質荷比為 743，初步判斷其代表的物質為槲皮素-戊糖酰-蕓香糖苷，其特征碎片離子的質荷比分別為611、465、303，其可能分別為槲皮素-戊糖酰-蕓香糖苷失去一分子戊糖（其質荷比為611）、失去一分子戊糖和一分子鼠李糖（其質荷比均為465）、失去一分子戊糖和蕓香糖（葡萄糖+鼠李糖）（其質荷比均為303）的碎片離子。峰號5 和6 對應的分子離子的質荷比分別為 597 與611，可初步判斷其代表的物質分別為槲皮素-戊糖-己糖和槲皮素-脫氧己糖-己糖；峰號5 對應的特征碎片離子的質荷比分別為465 與303，其代表的物質可能為槲皮素-戊糖-己糖失去戊糖和失去戊糖及己糖的碎片離子；峰號6 對應的特征碎片離子的質荷比分別為465與303，其代表的物質可能分別為槲皮素-脫氧己糖-己糖失去一分子脫氧己糖和失去脫氧己糖和己糖的碎片離子。

峰號10 和13 對應的分子離子的質荷比分別為551 與535，初步判斷其代表的物質分別為槲皮素-丙二酰葡萄糖苷和山柰酚-丙二酰葡萄糖苷，且測定的相對分子質量與其對應的理論相對分子質量相匹配。其碎片離子的質荷比分別為303 與287，其可能分別是槲皮素-丙二酰葡萄糖苷和山柰酚-丙二酰-葡萄糖苷失去丙二酰葡萄糖的碎片離子。

峰號12 對應的分子離子的質荷比為443，初步判斷其代表的物質為山柰酚-葡萄糖苷，測定的相對分子質量與其對應的理論相對分子質量一致；其碎片離子質荷比為287，其可能是山柰酚-葡萄糖苷失去一分子葡萄糖的碎片離子。

對于‘華仲12 號’杜仲葉片中矢車菊素糖苷類物質的檢測結果，可以通過將其與標準品進行比對而確認。根據(jù)圖2B 中杜仲葉片提取液在510 nm 波長下的譜圖中的保留時間，可初步判斷‘華仲12 號’杜仲葉片中含有矢車菊素-3-O 桑布糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。由表1可知，峰號14 和15 分別代表矢車菊素-3-O-桑布糖苷與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，其碎片離子的質荷比分別為287 與287，推測其分別為矢車菊素-3-O 桑布糖苷失去一分子桑布糖和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷失去葡萄糖的碎片離子（圖3C）。這一結果表明，在相同的試驗條件下，杜仲葉片中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的色譜保留時間、二級質譜碎片離子與其對應的標準品均一致；杜仲葉片中矢車菊素-3-O-桑布糖苷的色譜保留時間、二級質譜碎片離子與其對應的質譜分析參數(shù)也都一致。根據(jù)上述分析結果可以鑒別，‘華仲12 號’杜仲葉片中很可能含有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-桑布糖苷。

圖4 華仲12 號’杜仲和‘華仲11 號’杜仲葉中15 種黃酮類物質的含量分布情況Fig.4 Content distribution of 15 flavonoids in leaves of E.ulmoides ‘Huazhong No.12’ and ‘Huazhong 11’

2.2 杜仲葉中黃酮類物質的含量及分析

兩種杜仲葉片中各種黃酮類物質的含量見表1。由表1可知，‘華仲11 號’杜仲葉片中12 種黃酮類化合物的總含量為4.136 6 g·kg-1，‘華仲11 號’杜仲葉片中槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-丙二酰-葡萄糖苷、槲皮素-戊糖-己糖、槲皮素-蕓香糖苷的含量均相對較高，其含量與‘華仲11 號’杜仲葉片中其他黃酮類物質的含量均有顯著差異。

從表1中還可看出，‘華仲12 號’杜仲葉片中共檢測到15 種黃酮類物質，其總含量為36.732 3 g·kg-1，約為‘華仲11 號’杜仲葉片中黃酮類物質總含量的8.88 倍。其中，槲皮素糖苷類（10 種）、山柰酚糖苷類（3 種）、花色苷類（2 種）物質的含量分別占其黃酮類物質總含量的94.33%、4.39%、1.29%。槲皮素-戊糖-己糖和槲皮素-3-O-葡萄糖苷都是‘華仲12 號’杜仲葉片中的主要黃酮類物質，其含量分別占其組分總含量的48.80%與27.67%，此二者與‘華仲11 號’杜仲葉片中對應組分含量的差異均顯著，且與‘華仲11 號’杜仲葉片中其他黃酮類組分的含量相比亦有顯著差異。作為‘華仲12 號’杜仲葉片中獨有的物質，槲皮素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-桑布糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量分別為0.494 9、0.440 0、0.035 1 g·kg-1。比較分析‘華仲12 號’與‘華仲11 號’杜仲葉片中黃酮類物質的組分與含量可知，除了‘華仲12 號’獨有的3 種物質及槲皮素-脫氧己糖-己糖-己糖、槲皮素-丙二酰-葡萄糖苷、山柰酚-蕓香糖苷、山柰酚-丙二酰-葡萄糖苷外，‘華仲12 號’與‘華仲11 號’杜仲葉片間對應的其他黃酮類物質的含量均表現(xiàn)出顯著差異。

3 討論與結論

在反相液相色譜分離過程中，含有葡萄糖的黃酮醇糖苷類化合物的色譜保留時間一般長于含有半乳糖的[20]。槲皮素-3-O-葡萄糖苷與槲皮素-3-O-半乳糖苷均屬于異構體，結合保留時間及二級質譜碎片離子分析后判斷，峰號8 和9 所代表的物質分別為槲皮素-3-O-半乳糖苷與槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

不同品種的杜仲葉片中黃酮類物質的組成有所不同。研究結果表明，‘華仲12 號’杜仲葉片中獨有的3 種黃酮類組分分別為槲皮素-半乳糖苷、矢車菊素-桑布糖苷和矢車菊素-葡萄糖苷。唐芳瑞等[21]從杜仲葉片中鑒定出的8 種黃酮類物質中，除了quercetin-3-O-rutinoside、quercetin-3-O-glucoside、quercetin-3-O-galactoside之外，還包括本研究未測得的槲皮素、quercetin-3-O-sambubioside、kaempherol-3-O-sambubioside 等。閆建昆等[22]從杜仲的干燥葉中分離得到了圣草素、山柰酚-3-Oα-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-6’-乙?；拎咸擒盏? 種黃酮類物質。在上述已報道的杜仲葉片中的黃酮類物質中，‘華仲12 號’杜仲葉片中含有的矢車菊素-桑布糖苷和矢車菊素-葡萄糖苷均未見報道。

本研究從‘華仲12 號’杜仲葉片中鑒定出的黃酮類物質共有15 種，與從‘華仲11 號’杜仲葉片中鑒定出的黃酮類物質相比，槲皮素-半乳糖苷、矢車菊素-桑布糖苷、矢車菊素-葡萄糖苷均為‘華仲12 號’杜仲葉片中獨有的，其含量分別占其組分總含量的1.39%、1.12%、0.10%?！A仲12 號’杜仲葉片中黃酮類物質的總含量高達36.732 3 g·kg-1，約為‘華仲11 號’杜仲葉中的8.88 倍，說明‘華仲12 號’杜仲葉片中黃酮類物質的含量遠高于‘華仲11 號’的。且作為‘華仲12 號’杜仲葉片中黃酮類物質的主要組分，槲皮素-戊糖-己糖和槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量分別高達17.924 0 與10.164 1 g·kg-1，無論是與供試材料中其他黃酮類物質相比，還是與‘華仲11 號’杜仲葉中各對應組分相比，這2 種組分都有顯著差異。路買林等[23]曾報道，花色苷含量的變化是‘華仲12 號’杜仲葉色呈現(xiàn)紅色的直接原因。朱景樂等[24]曾以杜仲的3 種優(yōu)良無性系‘華仲11 號’‘華仲12 號’和密葉杜仲為試驗材料，采用分光光度計法測定其葉片中花色苷的含量，結果表明，‘華仲12 號’杜仲葉片中花色苷的含量顯著高于‘華仲11 號’杜仲葉片的，是‘華仲11 號’杜仲葉片的1.8 倍，他們指出，葉片中高含量的花色苷是‘華仲12 號’杜仲葉片表現(xiàn)出紅色的主要原因。本研究結果表明，‘華仲12 號’杜仲葉片具有3 種獨有的物質，其中的矢車菊素-桑布糖苷和矢車菊素-葡萄糖苷均屬于花色苷類，據(jù)此推測，‘華仲12 號’杜仲葉片的呈色很可能與其獨有的物質有重要關系。再者，黃酮類物質具有良好的藥用價值，‘華仲12 號’杜仲葉片中高含量的黃酮類物質使其具有良好的開發(fā)利用前景。

綜上所述，本研究從‘華仲12 號’杜仲葉片中共鑒定出15 種黃酮類物質，包括槲皮素糖苷類（10 種）、山柰素糖苷類（3 種）及花色苷類（2 種）物質。‘華仲12 號’杜仲葉片中存在高含量的黃酮類物質，與‘華仲11 號’杜仲相比，其多種組分含量也均顯著較高，且其獨具槲皮素-半乳糖苷、矢車菊素-桑布糖苷和矢車菊素-葡萄糖苷這3 種物質。此3 種其獨有的物質及多種高含量黃酮類組分的存在，可能共同影響著‘華仲12號’杜仲葉片的呈色，也是影響杜仲品種的觀賞價值、藥用價值及開發(fā)利用前景的重要因素。此研究結果對于 ‘華仲12 號’杜仲葉片化學成分的研究、特定組分的高效積累機理的研究、‘華仲12 號’杜仲的定向利用研究等方面都具有重要意義。