◎ 陳志敏

（石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050011）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種嚴(yán)重危害人類健康的食源性致病菌，是革蘭氏陽(yáng)性菌的典型代表菌，無(wú)芽胞和鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜，革蘭氏染色呈陽(yáng)性[1]。在一定的生長(zhǎng)條件下，金黃色葡萄球菌會(huì)合成腸毒素且該菌具有較強(qiáng)的菌膜形成能力，廣泛地存在于自然界的空氣、污水等環(huán)境中。菌膜是耐藥性傳播的一種潛在載體，研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌存在多重耐藥現(xiàn)象。目前世界各國(guó)均把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目。

散裝即食食品是提供給消費(fèi)者可直接食用的非預(yù)包裝食品（含預(yù)先包裝但需要計(jì)量稱重的散裝即食食品）。相對(duì)于預(yù)包裝食品而言，散裝食品在制作、銷售過(guò)程中，容易受器具、工作人員等環(huán)節(jié)的污染，更具引發(fā)食源性疾病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。近年國(guó)內(nèi)外散裝即食食品微生物監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，食源性致病菌的檢出比例較高，由金黃色葡萄球菌等食源性致病菌引發(fā)的食源性疾病屢見不鮮[2]。正因如此，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[3]應(yīng)運(yùn)而生，其中明確規(guī)定了金黃色葡萄球菌在各類散裝即食食品中的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及限量要求。

本文擬對(duì)食品中金黃色葡萄球菌目前存在的較常見的檢測(cè)方法作系統(tǒng)介紹，以期在散裝即食食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)的進(jìn)一步深入研究以及國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 以傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）[4]中要求將傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法，該標(biāo)準(zhǔn)是檢測(cè)金黃色葡萄球菌的國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)。區(qū)楚君等[5]通過(guò)改進(jìn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，挑取疑似菌落在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%瓊脂和體積分?jǐn)?shù)2%乙醇的胰蛋白酶大豆瓊脂上進(jìn)行分離，分離率由2.61%提至19.98%，可有效避免假陰性結(jié)果，提高準(zhǔn)確度。測(cè)試片法是以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為基礎(chǔ)進(jìn)行商品化后的產(chǎn)物，主要以3M公司的Petrifilm Staph Express Count Plate為代表。董娜等[6]通過(guò)優(yōu)化已有復(fù)配比例，并與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化已有復(fù)配比例得出的結(jié)果線性相關(guān)性良好，檢出限可達(dá)到2 CFU·mL-1，可應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。此外，研究發(fā)現(xiàn)將傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法得到的可疑菌株與全自動(dòng)微生物分析儀或基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用以增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果的時(shí)效性、準(zhǔn)確性[7-8]。因此，可通過(guò)此方法在食品抽檢機(jī)構(gòu)中尤其是散裝即食食品這種流通快、檢測(cè)時(shí)效要求高的樣品中實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

2 以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法

2.1 PCR技術(shù)

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）的簡(jiǎn)稱，是目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌的最常用方法之一，具有快速、靈敏、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。但由于食品成分的復(fù)雜性及食品加工時(shí)可能破壞了DNA且可擴(kuò)增已死亡的金黃色葡萄球菌DNA造成假陽(yáng)性結(jié)果，限制了PCR技術(shù)在檢測(cè)食品病原菌上的應(yīng)用。近年來(lái)，以常規(guī)PCR為基礎(chǔ)技術(shù)的各種新型PCR技術(shù)不斷出現(xiàn)，使食品中微生物的檢測(cè)愈來(lái)愈快捷、簡(jiǎn)便，同時(shí)彌補(bǔ)了常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度低的缺陷。

2.1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time，PCR）技術(shù)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。因其在檢測(cè)通量高、時(shí)效性好、靈敏度高等方面的優(yōu)勢(shì)得以迅速發(fā)展。范維等[9]建立了同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的多重實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，并對(duì)散裝即食肉制品進(jìn)行檢測(cè)，均與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果一致，證明該方法可用于散裝食品中3種致病菌的檢測(cè)。

2.1.2 PCR與膜芯片雜交技術(shù)

PCR與膜芯片雜交技術(shù)是指將采集的樣品通過(guò)混合培養(yǎng)基得到濃縮溶液，進(jìn)而提取并純化DNA后，采用PCR與膜芯片技術(shù)聯(lián)用檢測(cè)樣品中的致病菌。楊丹妮等[10]利用膜芯片的特異與多重PCR結(jié)合，檢測(cè)9種食源性致病菌，實(shí)現(xiàn)了同一平臺(tái)同時(shí)檢測(cè)多種食源性致病菌，在提高檢測(cè)通量的同時(shí)提高了檢測(cè)效率，為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供了有效手段。

2.1.3 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是基于傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理的一種新型PCR。趙麗青等[11]將疊氮溴化丙錠與微滴式數(shù)字PCR技術(shù)結(jié)合進(jìn)行定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌活菌，檢出限可達(dá)到1×102CFU·mL-1，在實(shí)際應(yīng)用中具有極高的應(yīng)用價(jià)值。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），是一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特點(diǎn)是靈敏度高，反應(yīng)時(shí)間短。郭建平等[12]利用金黃色葡萄球菌特異性靶點(diǎn)基因SAR0395建立一種可視化LAMP檢測(cè)方法，該方法不需要昂貴的設(shè)備且操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)在設(shè)備較落后的地區(qū)進(jìn)行金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplication，RPA）是一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，依賴于能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，其反應(yīng)靈敏性高，特異性強(qiáng)，可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場(chǎng)、快速核酸檢測(cè)。后來(lái)旺等[13]建立RPA結(jié)合側(cè)流層析試紙條的快速檢測(cè)方法，其與微生物生化鑒定法總符合率為95.3%。

2.4 實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)（Real-Time Simultaneous Amplification and Testing，SAT） 方 法 的 靶 標(biāo) 是RNA，擴(kuò)增產(chǎn)物也是RNA，且反應(yīng)全程僅需40 min。李桂金等[14]建立的金黃色葡萄球菌SAT方法，純培養(yǎng)物檢測(cè)下限達(dá)到1×103CFU·mL-1，其靈敏度高、特異性好、假陽(yáng)性率低至2.9%，為散裝、預(yù)包裝食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)提供參考。

3 結(jié)語(yǔ)

以往實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)實(shí)際樣品中，預(yù)包裝食品中春卷、速凍面筋、速凍餃子等市售速凍米面制品中金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性率較高，目前國(guó)家出臺(tái)了散裝即食食品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，散裝即食食品中以米面為原料的制品、肉制品成為了食品抽查的重點(diǎn)，因此必須加強(qiáng)散裝即食食品食品金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)?zāi)芰?。傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法仍停留在分離培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生化鑒定和血清型分型水平，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，且無(wú)法對(duì)培養(yǎng)難度較大的病原菌進(jìn)行檢測(cè)。雖然以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)，但是檢測(cè)成本較高、靈敏性相對(duì)較低且因不能區(qū)分死菌以及活菌導(dǎo)致假陽(yáng)性率高，某些新型多技術(shù)連用檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件及工作人員的專業(yè)能力要求較高，不能得到普及。因此建立快速、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高且經(jīng)濟(jì)的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法才能應(yīng)對(duì)散裝即食食品的檢測(cè)，從而確保食品安全。