王洪偉 王 賀 司春嬰 解金紅 關懷敏

(1 河南中醫(yī)藥大學，鄭州，450000； 2 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科第三病區(qū)，鄭州，450000； 3 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心臟中心，鄭州，450000)

心房顫動(Atrial Fibrillation，AF)是較為常見的心律失常，其患病率逐年增加，至2016年，全球有4 630萬人患有AF或心房撲動，據(jù)估計成人AF的患病率為2%～4%[1]。此外，AF患者并發(fā)卒中的風險是正常人的5倍，據(jù)估計占所有卒中的15%[2]，預計到2050年AF將導致全球范圍內(nèi)100.8億失能調(diào)整生命年(Disability-Adjusted Life Year，DALY)的損失及42.7萬人死亡[3]。并且在各種心律失常中，由AF引起的并發(fā)癥影響巨大而受到世界衛(wèi)生組織的極大關注[4]。目前，主要采取藥物和消融的方式達到治療AF目的，其中藥物治療以控制心室率、恢復竇性心律、抗凝治療為主，臨床研究發(fā)現(xiàn)這些抗心律失常藥有較大的致心律失常的風險；而消融術雖能達到治療AF的目的，但其有價格昂貴和高復發(fā)的缺陷[5-6]。隨著對中醫(yī)藥的深入研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在AF的治療方面有著巨大潛力，并且有低成本、低不良反應、高療效的優(yōu)勢。

中醫(yī)根據(jù)AF的癥狀將其歸屬于心悸動、驚悸、怔忡、雀啄等范疇，主要癥狀為心悸、脈結，常伴頭暈、胸悶、氣短等[7]。根據(jù)臨床證候的不同，將AF的證型分為氣陰兩虛證、氣滯血瘀證、心腎不交證、肝腎陰虛證、陽虛濕阻證和絡風內(nèi)動證6種，其中以氣陰兩虛證在臨床上較為常見[8]。參松養(yǎng)心膠囊由赤芍、丹參、甘松、黃連、炒酸棗仁、南五味子、人參、桑寄生、山茱萸、麥門冬等藥物組成[9]。有益氣養(yǎng)陰，活血通絡，清心安神的功效，臨床主要用于治療氣陰兩虛證[10]。此外，有研究表明參松養(yǎng)心膠囊聯(lián)合胺碘酮對氣陰兩虛型AF較單用胺碘酮療效更佳[11]。但目前參松養(yǎng)心膠囊在AF的治療中的作用機制尚未清楚，本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術，旨在探索分析參松養(yǎng)心膠囊的藥物活性成分和治療AF的潛在作用靶點，從而預測參松養(yǎng)心膠囊在AF治療中潛在作用機制，為以后相關研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)；中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)；有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/)；String數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/)；UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)；人類基因數(shù)據(jù)庫(Human Gene Database，GeneCards，https://genealacart.genecards.org/)；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)；遺傳藥理學和藥物基因組學數(shù)據(jù)庫(PharmGKB，https://www.pharmgkb.org/)；治療性靶點數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database，TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)；綜合性藥物數(shù)據(jù)庫(DrugBank，https://go.drugbank.com/)；疾病相關基因數(shù)據(jù)庫(DisGeNET，https://www.disgenet.org/)；Draw Venn Diagram在線數(shù)據(jù)平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)；Cytoscape 3.8.0軟件；R4.0.5軟件；DOSE、clusterProfiler、enrichplot R軟件包；String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)；CytoNCA插件；MCODE插件；PDB蛋白質(zhì)在線數(shù)據(jù)庫(https://www1.rcsb.org/)；ChemBio 3D 20軟件；AutoDock vina軟件；PyMOL軟件。

1.2 參松養(yǎng)心膠囊活性成分的獲取 利用TCMSP、ETCM數(shù)據(jù)庫檢索參松養(yǎng)心膠囊中赤芍、丹參、甘松、黃連、南五味子、人參、桑寄生、山茱萸、炒酸棗仁、麥門冬等藥物化學成分，根據(jù)藥物動力學特征篩選藥物活性成分，設置口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18[12]，ETCM保留可靠性分值大于0.8的活性成分。對于TCMSP數(shù)據(jù)庫中查詢不到的作用靶點，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫找到藥物活性成分的2D結構，下載SDF文件格式上傳Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進行靶點預測，將上述二部分數(shù)據(jù)進行整合，利用String數(shù)據(jù)庫進行標準化處理獲得靶點相應基因名，運用UniProt數(shù)據(jù)庫對String數(shù)據(jù)未能獲得的靶基因進行補充。

1.3 AF疾病相關靶點獲取 以“Atrial Fibrillation”為關鍵檢索詞，以“Homo Sapiens”為目標物種，通過檢索GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DrugBank、DISGeNET等數(shù)據(jù)庫，獲取與AF相關的疾病靶點。

1.4 參松養(yǎng)心膠囊治療AF的潛在疾病靶點的獲取 使用Draw Venn Diagram在線數(shù)據(jù)平臺對1.2及1.3中所獲得的藥物活性成分靶點及AF疾病靶點繪制韋恩圖，二者的交集即為參松養(yǎng)心膠囊治療AF的潛在治療靶點。

1.5 藥物活性成分與AF潛在靶點網(wǎng)絡的構建 整理1.4獲得的潛在作用靶點，為了找出作用于AF疾病靶點的單味藥及藥物活性成分，建立以節(jié)點表示單味藥、藥物活性成分、成分或疾病的靶點，而邊則表示節(jié)點與節(jié)點之間的相互關系，以此構建藥物-藥物活性成分-AF潛在治療靶點的相互作用的網(wǎng)絡關系表；將其導入Cytoscape軟件中繪制藥物-藥物活性成分-AF潛在治療靶點網(wǎng)絡圖，同時計算每個節(jié)點相對應的度值，并以每個節(jié)點度值的大小調(diào)節(jié)節(jié)點的大小。

1.6 基因本體功能分析和KEGG通路富集分析 利用R軟件借助腳本，將1.4獲得的“藥物成分-AF”共同靶點的基因名轉(zhuǎn)換為Entrez ID，并將DOSE、clusterProfiler、enrichplot軟件包載入R軟件中，通過運行ClusterProfiler功能包進行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，其中“P<0.05”，并以P值大小從小到大排列，GO功能分析結果取前10位和KEGG通路富集分析結果取前20位，將結果可視化分析并繪制氣泡圖、條形圖。

1.7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡構建及AF潛在治療靶點的篩選 將1.4中獲得的藥物成分與疾病公共靶點導入String數(shù)據(jù)庫，物種選擇“Homo Sapiens”，最低互作分數(shù)設置為“Highest Confidence(0.9)”獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)關系，將分析結果導出并運用Cytoscape軟件繪制潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡；使用CytoNCA插件對初始網(wǎng)絡節(jié)點的拓撲學屬性的中位數(shù)作為篩選標準進行了2步篩選簡化網(wǎng)絡，使用MCODE插件以默認參數(shù)應用插件得到不同的靶點團[13]，得分(Score)越高越能說明該靶點是參松養(yǎng)心膠囊治療AF的核心靶點團。MCODE Score反映每個節(jié)點與其他節(jié)點的聯(lián)系緊密度[14]。

1.8 分子對接 利用PDB數(shù)據(jù)庫對1.6獲得核心靶點3D結構進行檢索并下載其PDB格式，并用PyMOL軟件對其去水和去配體；利用AutoDock vina軟件對其加氫，并將其設置為受體保存為PDBQT格式；通過反向分子篩選得到參松養(yǎng)心膠囊中相應的藥物活性成分，利用PubChem數(shù)據(jù)中下載其對應的2D結構，將其導入Chem3D軟件對其進行能量最小化處理存為MOL2格式，再分別導入AutoDock vina軟件，確定可旋轉(zhuǎn)化學鍵個數(shù)，將其設置為配體輸出為PDBQT格式；確定分子對接受體的活性口袋，并將設置參數(shù)為“exhaustiveness=25、energy_range=5、num_modes=20”，使用AutoDock Vina軟件進行分子對接對接。最后，利用PyMOL軟件對分子對接結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 活性成分的篩選及作用靶點預測 通過多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合文獻檢索分析，經(jīng)類藥性五原則對其進行篩選共檢索到參松養(yǎng)心膠囊藥物活性成分190個，成分基因818個。見表1。將活性成分對應的蛋白去重后導入String數(shù)據(jù)庫將成分蛋白轉(zhuǎn)換為基因名，使用UniProt數(shù)據(jù)庫對其補充，共獲得參松養(yǎng)心膠囊活性成分靶點基因262個。

表1 參松養(yǎng)心膠囊包含活性成分及對應靶點數(shù)

2.2 參松養(yǎng)心膠囊藥物活性成分-AF潛在靶點網(wǎng)絡 共得到AF疾病相關靶點3 577個與2.1篩選得到參松養(yǎng)心膠囊藥物活性成分靶點262個，最終獲得171個參松養(yǎng)心膠囊治療AF的潛在靶點。見圖1。將這171個潛在靶點連同參松養(yǎng)心膠囊單味藥及藥物活性成分共同靶點導入Cytoscape軟件構建藥物-藥物活性成分-AF靶點網(wǎng)絡圖。結果說明參松養(yǎng)心膠囊治療AF是通過多成分、多靶點發(fā)揮作用。見圖2。

2.3 AF潛在治療靶點GO生物功能分析 GO生物功能分析結果顯示共得到基因功能相關信息2 837個。其中參松養(yǎng)心膠囊活性成分治療AF潛在的靶點在生物過程(Biological Processes，BP)中富集了2 545個GO功能，主要富集于對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對金屬離子的反應、對藥物的反應、細胞對化學應激的反應、氧化應激反應、細胞對氧化應激的反應、神經(jīng)元死亡、對活性氧的反應、細胞對生物刺激的反應；在細胞組分(Cell Components，CC)中富集了107個GO功能，主要富集在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、小窩、質(zhì)膜筏、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、囊腔、蛋白激酶復合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復合物、胞質(zhì)泡腔；在分子功能(Molecular Functions，MF)中富集了185個GO功能，主要和DNA結合轉(zhuǎn)錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉(zhuǎn)錄因子結合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、泛素樣蛋白質(zhì)連接酶結合、泛素-蛋白質(zhì)連接酶結合、細胞因子受體結合、兒茶酚胺結合、蛋白酶結合、磷酸酶結合有關。見圖3。

2.4 AF潛在治療靶點KEGG通路富集分析 應用R校對對AF潛在治療靶點進行KEGG通路富集分析，經(jīng)過運算得到AF潛在治療靶點參與信號通路183條，通過q值由小到大排序，取前20位。見表2。其中有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE Signaling Pathway In Diabetic Complications)、IL-17信號通路(IL-17 Signaling Pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF Signaling Pathway)、MAPK信號通路(MAPK Signaling Pathway)、細胞凋亡(Apoptosis)、HIF-1信號通路(HIF-1 Signaling Pathway)6條信號通路與AF的發(fā)生維持及治療密切相關。見圖4。KEGG分析結果說明參松養(yǎng)心膠囊治療AF是通過多條信號通路實現(xiàn)，其中MAPK信號通路可能是參松養(yǎng)心膠囊治療AF主要涉及的信號通路。見圖5。

表2 參松養(yǎng)心膠囊治療AF潛在靶點的KEGG富集通路

2.5 AF潛在治療靶點PPI網(wǎng)絡分析 PPI網(wǎng)絡由152個節(jié)點及716條邊組成。見圖6A。第一次拓撲學分析得到由35個節(jié)點與195條邊構成簡化的PPI網(wǎng)絡。見圖6B。第二次拓撲學分析最終構成由7個節(jié)點與19條邊組成的核心靶點團。見圖6C。PPI結果顯示，參松養(yǎng)心膠囊主要通過作用于MAPK(絲裂原激活蛋白激酶)1、MAPK8、MAPK14、Jun激酶、STAT(信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子)3、FOS(Fos原癌基因)、TNF(腫瘤壞死因子)治療AF。

2.6 參松養(yǎng)心膠囊成分與AF治療潛在靶點蛋白分子對接分析 將2.5經(jīng)拓撲學分析最終獲得核心靶團MAPK1、MAPK8、MAPK14、JUN、STAT3、FOS、TNF通過反向分子篩選得到參松養(yǎng)心膠囊治療AF的10個藥物活性成分；利用Pubchem在線數(shù)據(jù)檢索得到其相應的2D結構(其中MAPK14尚未找到相對應2D結構)，對上述檢索到的9個活性成分運用ChemBio 3D 20軟件使其能量最小化；利用PDB蛋白質(zhì)在線數(shù)據(jù)庫檢索下載AF潛在治療靶基因相對應的蛋白質(zhì)結構文件MAPK1(PDB ID:2Y9Q)、MAPK8(PDB ID:2XRW)、STAT3(PDB ID：6NJS)、JUN(PDB ID：5FV8)、TNF(PDB ID:7JRA)、FOS(PDB ID:1A02)；采用autoduck vina軟件依次與小分子化合物進行虛擬對接，對接結果見表3。分子虛擬對接結合能(affinity)<-7 kcal/mol(1 cal=4.184 J)時則認為配體與受體結合活性較好且結合能越低則說明分子對接結果越好。分子對接結果顯示，有39對結合能少于-7 kcal/mol藥物成分與靶點蛋白，其中排在前5位的配體與受體以隱丹參酮與MAPK1的結合活性最好(affinity=-10 kcal/mol)，隨后依次是隱丹參酮與MAPK8(affinity=-9.9 kcal/mol)、黃芩素與TNF(affinity=-9.3 kcal/mol)、木犀草素與MAPK1(affinity=-9.1 kcal/mol)、山柰酚與MAPK1(affinity=-9.1 kcal/mol)；利用Pymol對分子對接結果進行可視化處理，藥物活性成分配體均能與靶蛋白受體的活性口袋結合且二者匹配良好，部分分子對接圖。見圖7。

表3 核心靶蛋白團與其反向篩選的藥物活性成分的分子對接結果(1 cal=4.184 J)

3 討論

AF的發(fā)病機制，涉及心房電結構重構、代謝重構、炎癥反應、氧化應激反應、折返環(huán)路學說、神經(jīng)體液學說、分子遺傳學說等方面[8]。目前AF治療主要從恢復竇性心律、控制心室率和抗凝等角度入手。但AF患者恢復竇性心律后有較高的復發(fā)率，并且在使用抗心律失常藥物的過程中存在較高致心律失常的風險。AF屬于中醫(yī)“心悸”范疇,臨床上的AF患者根據(jù)證候群分多為氣陰兩虛證型，參松養(yǎng)心膠囊具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡、清心安神的功效，是治療氣陰兩虛證的常用藥物[10]。

本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法，研究發(fā)現(xiàn)參松養(yǎng)心膠囊中的多種藥物活性成分通過多個靶點蛋白發(fā)揮治療AF的作用，這些靶點蛋白經(jīng)GO富集分析，結果顯示參松養(yǎng)心膠囊的藥物活性成分主要影響氧化應激反應、金屬離子反應、應激反應及活性氧等生物過程；參與蛋白的合成、轉(zhuǎn)運及離子通道復合物合成；調(diào)節(jié)基因的表達，蛋白的功能及降解等。PPI網(wǎng)絡結果顯示MAPK1、MAPK8、MAPK14、JUN、STAT3、FOS、TNF是參松養(yǎng)心膠囊治療AF的潛在作用靶點；分子對接的結果顯示參松養(yǎng)心膠囊藥物活性成分與AF治療靶點蛋白對接良好，以隱丹參酮與MAPK1的結合活性最好，隨后依次是隱丹參酮與MAPK8、黃芩素與TNF、木犀草素與MAPK1、山柰酚與MAPK1。因此，參松養(yǎng)心膠囊的活性藥效成分可以通過作用于潛在靶點MAPK1對AF治療發(fā)揮作用。

KEGG富集分析顯示有6條信號通路與AF有著密切相關，MAPK信號通路調(diào)控細胞的生長、分化、應激、炎癥反應等多種重要的生理病理過程。Gao等[15]發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路的激活促進心房纖維化的發(fā)生。Cheng等[16]實驗證明激活的MAPK信號通路可使得L型鈣通道和Kv4.3鉀通道表達發(fā)生改變可能是心房電重構的基礎。說明參松養(yǎng)心膠囊可以通過抑制MAPK信號通路抑制心房電結構重構。

糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路通過激活PKC/JNK/NF-κB信號通路，使得白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α在內(nèi)的多種細胞炎癥介質(zhì)的表達上調(diào)。除此之外，它還可激活PCK/PK-1信號通路，使得單核細胞趨化蛋白-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、細胞間黏附分子-1等蛋白過表達，進而使得血液黏滯度增加，致使AF合并糖尿病患者易形成血栓。Burr等[17]認為糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路通過促進心肌細胞中成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，進而促進細胞外基質(zhì)合成增加。研究者還發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE信號通路使心肌細胞氧化應激反應增強。因此，參松養(yǎng)心膠囊可能通過抗炎、抗氧化、抑制心房結構重構及降低血液黏滯度抑制血栓形成發(fā)揮治療AF合并糖尿病的藥理學作用。

此外，Yue等[18]實驗發(fā)現(xiàn)白細胞介素-17通過激活下游的核因子кB和MAPK信號通路促進心房電結構重構；He等[19]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α通過促進KCa3.1通道蛋白的表達，從而促進心房電重構；Deng等[20]認為細胞凋亡在AF發(fā)生和維持的過程中發(fā)揮一定的作用。以上證據(jù)表明參松養(yǎng)心膠囊可能通過作用于IL-17、TNF、細胞凋亡信號通路發(fā)揮治療AF的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法及虛擬分子對接技術預測參松養(yǎng)心膠囊治療AF的藥物活性成分、潛在作用靶點及可能的作用機制，并認為參松養(yǎng)心膠囊藥物活性成分可能通過作用于潛在靶點MAPK1影響心房電結構重構、調(diào)節(jié)代謝、抑制炎癥反應、調(diào)節(jié)細胞凋亡相關的多條信號通路達到治療AF的作用，為臨床應用參松養(yǎng)心膠囊治療AF提供了參考。