慶保平，張亞祖，段 英，趙 偉，王興龍

(1.陜西漢中朱鹮國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，陜西洋縣 723300；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

朱鹮(Nipponianippon)是鵜形目(Pelecaniformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮屬(Nippona)的大中型涉禽,屬國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)物種紅色名錄瀕危(EN)物種;瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅰ物種[1-2]。歷史上朱鹮曾廣泛分布與東亞地區(qū)，20世紀(jì)中葉以來(lái)，朱鹮種群從繁盛迅速衰退，相繼在俄羅斯、朝鮮、韓國(guó)和日本野外滅絕[3]。1981年，鳥類學(xué)家在陜西洋縣發(fā)現(xiàn)了當(dāng)時(shí)僅存的7只個(gè)體，經(jīng)過(guò)40年的有效保護(hù)，陜西種群數(shù)量已發(fā)展到5 275只，占全球朱鹮種群數(shù)量的68.67%[4]，但其野生種群仍分布在洋縣及其周邊市縣的狹小區(qū)域。

簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌(Aeronmnasjandaei)屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)細(xì)菌。1991年Carnahan A等[5]首先確定了簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌(Aeromnasjandaei)的分類地位。隨后，研究表明該菌不僅可感染羅非魚、暹羅鱷等水生動(dòng)物，也能感染人和水牛等家畜，是一種人-畜-魚共患病原菌[6-10]。但尚未見(jiàn)朱鹮等鳥類感染簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌的病例的報(bào)道。

2020年12月下旬，陜西省洋縣清涼水庫(kù)周邊陸續(xù)出現(xiàn)多只野生朱鹮死亡?，F(xiàn)場(chǎng)收集死亡時(shí)間不超過(guò)8 h的2具成年朱鹮尸體剖檢，采集肝、脾組織分離出2株相同的革蘭氏陰性病原菌，經(jīng)過(guò)細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化特征測(cè)定和16S rDNA基因序列同源性和聚類分析，確認(rèn)為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌。人工感染回歸試驗(yàn)證實(shí)簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌為引起朱鹮感染死亡的病原菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 無(wú)菌采集2只死亡成年朱鹮的肝、腎組織各1份。

1.1.2 主要試劑 瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管、藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；綿羊血平板，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室自制；革蘭氏染液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；DNA 標(biāo)準(zhǔn)，北京Genstar生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要設(shè)備 超凈工作臺(tái)，上海茸研儀器有限公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱，上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng)廠產(chǎn)品；搖床，上海能共實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司產(chǎn)品；PCR儀，杭州博日科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠9只，體重30 g～35 g,購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢 對(duì)死亡時(shí)間不超過(guò)8 h的2具成年朱鹮尸體剖檢，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.2.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng) 無(wú)菌操作取病料組織，分別接種普通瓊脂平板和綿羊血平板37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)、溶血性等培養(yǎng)特征。挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株。取純培養(yǎng)菌株單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌染色形態(tài)特征。

1.2.3 生化試驗(yàn) 挑選純培養(yǎng)菌株單個(gè)菌落，按照細(xì)菌生化微量鑒定管使用說(shuō)明接種培養(yǎng)，觀察其反應(yīng)。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)》對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.4 16S rDNA PCR鑒定 按照細(xì)菌DNA提取試劑盒所述方法提取分離菌DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后送西安擎科澤西生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性相近的序列，應(yīng)用MEGA7.0軟件對(duì)選取的序列進(jìn)行同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)菌株單個(gè)菌落，在LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)，至OD 600 nm值為0.3左右時(shí)，PBS調(diào)整菌液濃度為1.05×1011CFU/mL。將9只試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組，每組3只，按照1.0×1010CFU/只和1.0×108CFU/只的量分別腹腔接種試驗(yàn)組小鼠，對(duì)照組小鼠腹腔接種0.5 mL滅菌生理鹽水。接種后，各組小鼠分籠飼養(yǎng)，每天記錄小鼠的臨床表現(xiàn)和發(fā)病、死亡情況。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法(KB法)，取濃度1.0×108CFU/mL的菌液100 μL均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上,將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判讀試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病理變化

死亡朱鹮剖檢可見(jiàn)主要病變?yōu)榉尾坑傺?、肝臟腫脹、胰臟點(diǎn)狀出血，腺胃和肌胃充盈，胃內(nèi)容物為魚類，腸道彌散性出血等。

2.2 細(xì)菌的形態(tài)特征

分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，形成乳白色、圓形、微隆起，表面光滑、邊緣整齊、半透明的中等大小菌落。在綿羊血平板上生長(zhǎng)良好，呈明顯的β溶血，培養(yǎng)48 h后呈灰白色、扁平狀大菌落。細(xì)菌革蘭氏染色陰性，多數(shù)菌體短小，無(wú)芽孢，多為單個(gè)排列，部分呈現(xiàn)短絲狀排列(圖1)。

A.普通瓊脂平板;B.血瓊脂平板;C.革蘭氏染色

2.3 生化培養(yǎng)特性

分離菌株精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、氧化酶和接觸酶呈陽(yáng)性;鳥氨酸脫羧酶呈陰性；葡萄糖、麥芽糖、甘露糖呈陽(yáng)性;庶糖、乳糖、阿拉伯糖、纖維二糖、七葉苷、肌醇、水楊苷呈陰性;靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性,VP試驗(yàn)陽(yáng)性(表1)。分離菌生化特性與《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和《臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)》所提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化特性與簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌基本一致。

表1 分離菌株的生化培養(yǎng)特征

2.4 16S rDNA PCR鑒定結(jié)果

分離菌株16S rDNA的PCR檢測(cè)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)1 500 bp左右的特異性條帶(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;-.陰性對(duì)照；1、2.分離菌

PCR產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所測(cè)得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列進(jìn)行對(duì)比，分離菌與氣單胞菌屬(Aeromonas)細(xì)菌的同源性為100%。將獲得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的氣單胞菌基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，(Mega7，Maximum Likelihood Tree)，分離菌株(ZXQb3)，在種上與JX426061.1:50-1373Aeromonasjandaeistrain HME8596菌株匯為一支(圖3)，表明其親緣關(guān)系較近，同源性為99%。結(jié)合該菌株的形態(tài)特征、生化反應(yīng)特點(diǎn)等，確定分離菌為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌。

圖3 分離菌16S rDAN序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

接種細(xì)菌的小鼠出現(xiàn)精神沉郁、被毛凌亂、食欲降低癥狀。24 h內(nèi)高劑量感染小鼠死亡2只(2/3)，低劑量感染小鼠無(wú)死亡；48 h內(nèi)高劑量感染小鼠全部死亡，低劑量感染小鼠死亡1只；對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好,食欲正常。

剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠腸道脹氣，腹腔有惡臭腐爛氣味，肝臟發(fā)黑，肺臟出血。取肝臟、肺臟、脾臟接種綿羊血平板再次分離培養(yǎng)細(xì)菌，獲得形態(tài)和生理生化特征與朱鹮臟器分離菌特征一致的菌株。

2.6 藥敏試驗(yàn)

病原菌對(duì)10種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)菌對(duì)丁胺卡那霉素、氟哌酸、氯霉素、復(fù)方新諾明4種藥物高度敏感;對(duì)慶大霉素、紅霉素2種藥物中度敏感;對(duì)青霉素、氨芐青霉素、頭孢唑林(先鋒Ⅴ)3種藥物產(chǎn)生耐藥性。

3 討論

為排除禽流感和新城疫等重大動(dòng)物疫病疫情的可能，樣品采集前，分別取口咽和肛門拭子，按照國(guó)家禽流感和新城疫診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了禽流感和新城疫的診斷，結(jié)果均為陰性。在確定排除重大疫情的前提下開展了上述試驗(yàn)研究。

根據(jù)分離菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合16S rDNA PCR鑒定結(jié)果,確認(rèn)該菌株為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌。動(dòng)物感染試驗(yàn)中高劑量人工感染小鼠病程短且病死率高，其臨床癥狀和肝臟、肺臟及消化道病理變化與死亡朱鹮表現(xiàn)趨于一致，從死亡小鼠體內(nèi)重新分離到與死亡朱鹮內(nèi)臟組織中分離菌相同的菌株，因此可以認(rèn)為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌是引起朱鹮死亡的致病性病原菌。

多年來(lái)，人們對(duì)朱鹮疾病的研究多集中在人工飼養(yǎng)種群，目前報(bào)道的朱鹮細(xì)菌性疾病的病源菌主要有大腸埃希氏菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌等[11-13]。野生朱鹮常年在河流、水田、塘庫(kù)、灘涂等濕地中覓食，魚、蝦、蟹、螺和水生昆蟲是其主要的食物來(lái)源，水和食物的安全關(guān)乎朱鹮的健康。簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌等氣單胞菌屬細(xì)菌存在于水生環(huán)境和水生動(dòng)物體內(nèi)，鄧玉婷等[14]、胡萌[15]分別在廣東和江蘇省部分水產(chǎn)養(yǎng)殖地區(qū)水體中檢測(cè)到簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌。溫貴蘭等[16]、龍?zhí)K等[17]、楊文飛等[18]分別從患病的彩鯉、禾花鯉和黃顙魚體內(nèi)分離到簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌，并對(duì)其致病性進(jìn)行了研究。可見(jiàn)簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌是一種分布廣泛，可致使多種水生生物，尤其是魚類感染的致病菌。本研究樣本采集地清涼水庫(kù)是野生朱鹮的一處覓食地和夜宿地，多年來(lái)一直有朱鹮在此覓食和夜宿。事發(fā)時(shí)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該水庫(kù)因水體污染嚴(yán)重，水邊漂浮著許多死亡的鯉魚、鯽魚和小雜魚，結(jié)合朱鹮死亡環(huán)境和死亡個(gè)體胃內(nèi)充滿大量魚刺、魚骨的現(xiàn)象，懷疑朱鹮的死亡與取食簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌感染的魚類有關(guān)，具體情況有待進(jìn)一步研究。

本研究是對(duì)野生朱鹮感染簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌引起死亡的首次報(bào)道，希望引起保護(hù)部門對(duì)野生朱鹮疾病和取食環(huán)境的關(guān)注，從而加強(qiáng)野生朱鹮管理，使其遠(yuǎn)離污染水域、防止取食腐敗變質(zhì)食物，確保朱鹮安全。試驗(yàn)中藥敏試驗(yàn)結(jié)果為本次朱鹮疾病的防治提供了一定依據(jù)，可以為該病的研究和綜合防治提供參考。