梁嘉俊,蒲 翔,赫 衛(wèi),潘 倩,周永強,周 英,魏 鑫
(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025)
馬錢科(Loganiaceae)鉤吻屬(Gelsemium)植物鉤吻(Gelsemiumelegans)最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中,又名胡蔓藤,斷腸草、大茶藥[1-2],為著名毒性中藥,在我國南方鉤吻廣泛分布在福建,云南,貴州,廣東,廣西等地[3]。作為傳統(tǒng)中藥,鉤吻在民間以外用為主,具有祛風(fēng)、殺蟲止癢、消腫拔毒的功效[4],在一些少數(shù)民族地區(qū),鉤吻常用于治療跌打損傷,骨折等骨關(guān)節(jié)疾病[5-6]。現(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鉤吻富含單萜吲哚生物堿類成分,具有抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜,抗焦慮,抗腫瘤,抑菌等活性[7-11]。前期鉤吻的中藥化學(xué)研究大部分集中于其根莖部位,并且發(fā)現(xiàn)一些具有良好抗菌活性生物堿類成分[12],而針對鉤吻地上部分生物堿類成分研究報道相對較少。本文采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、高效液相色譜(HPLC)等多種分離技術(shù)對于鉤吻地上部位總生物堿進行了分離純化,結(jié)合核磁共振波譜(NMR)以及質(zhì)譜(MS)等結(jié)構(gòu)鑒定手段確定了所得單體成分結(jié)構(gòu),分離得到5個鉤吻定堿類氧化單萜吲哚生物堿,分別鑒定為19-xo-gelsenicine(1),14-hydroxy-19-oxogelsenicine(2),gelsedilam(3),Nb-methylgelsedilam(4)和gelsemoxonine(5)(圖1),并對鉤吻總生物堿提取物以及化合物1和3的抗真菌的活性進行了評價,研究發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL的濃度下鉤吻總生物堿提取物對辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)菌絲生長抑制率為34.80 %。
圖1 化合物1-5的結(jié)構(gòu)圖
1.1 儀器與試劑 核磁共振共振儀(AVANCE NEO 400 MHz)購買自德國Bruker公司,RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠),SHB-III循環(huán)水式多用真空泵購買自鄭州長城科工貿(mào)易有限公司,DL-400循環(huán)冷卻器(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司),SB-600DTY超聲波多頻清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司),F(xiàn)A2104N電子天平購買自上海菁海儀器有限公司,半制備高效液相色譜儀(LC-52)購置于Separation(Beijing)科技公司,GF254硅膠板、柱層析硅膠(200-300目和80-100目)均購買于青島海洋化工有限公司,MCI(GEL-CHP 20P)(Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.Japan),Rp-18半制備柱(250 mm×10 mm,5μm)購買于賽譜銳思(北京)科技有限公司;恒溫暗培箱購買自常州華普達教學(xué)儀器有限公司;DMSO購買自北京索萊寶科技有限公司;二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮均為分析純購買于天津市富宇精細化工有限公司。鉤吻藥材地上部位于2021年4月購自云南眾和植域生物科技有限公司,經(jīng)昆明植分生物技術(shù)有限公司鑒定師婁安瑞鑒定為馬錢科鉤吻屬鉤吻Gelsemiumelegans(Gardn.et Champ.)Benth.,標本保存于貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥重點實驗室,標本號為WX_20210401。
1.2 提取與分離 干燥鉤吻地上部分 20 kg,用乙醇浸提三次,回流提取兩次,每次 2 小時,合并提取液并減壓回收乙醇得浸膏 3893 g,加適量水溶解,然后加入稀鹽酸酸化至PH=2,放置過夜,過濾,濾液用氨水調(diào)堿性至PH=10,二氯甲烷萃取,得浸膏221 g,萃取后浸膏硅膠(80-100目)拌樣,利用硅膠柱(200-300目)色譜梯度洗脫,洗脫劑二氯甲烷-甲醇體系(v/v 100% → 0%)梯度洗脫,通過薄層色譜分析得 25個組分,分別為 L-1至L-25。
L-5和L-6合并后利用硅膠柱(200-300目)色譜梯度洗脫,洗脫劑二氯甲烷-乙酸乙酯(v/v 2∶1 → 1∶4),后經(jīng)MCI柱色譜(甲醇-水v/v 40% → 100%)梯度洗脫后得分段GL-1至10,GL-7進行MCI、ODS,硅膠柱色譜洗脫,最后利用制備型 HPLC(乙腈-水v/v 20% → 60%)40 min梯度洗脫,得化合物1(6 mg)和化合物3(5 mg),MCI 柱色譜洗脫后及GL-5剩余樣品合并得分段GL-6,進行 MCI,硅膠柱色譜,ODS柱色譜洗脫,梯度洗脫,最后分別利用制備型 HPLC(乙腈-水=30% → 100%)40 min梯度洗脫,得化合物2(5mg);(乙腈-水=30% → 100%)30min梯度洗脫得化合物4(10 mg);(乙腈-水=40% → 80%)30 min 梯度洗脫得化合物5(38 mg).
1.3 抗真菌活性評價和菌絲生長抑制率測定 將在室溫保存的辣椒疫霉菌菌種接種在燕麥固體培養(yǎng)基(OMA培養(yǎng)基)上進行培養(yǎng),在25 ℃-28 ℃ 下恒溫暗培養(yǎng)3天至對照白色菌絲充分生長繁殖布滿整個培養(yǎng)基表面。取提取物0.5 mg(20 μL DMSO稀釋),燕麥培養(yǎng)基 5 mL,加入到6 cm培養(yǎng)皿中混勻,對照加入20 μL DMSO。用Φ 0.8 cm打孔器在新鮮菌平板打菌餅,取1個菌餅倒置培養(yǎng)基平板中央,培養(yǎng)3天,每天采用“十”字交叉法測量菌落大小,計算菌絲生長抑制率。
菌落直徑(cm)=測量直徑-0.8 cm
菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/ 對照菌落直徑×100 %
2.1 結(jié)構(gòu)鑒定
2.1.1 化合物1C19H20N2O4,1H NMR(600 MHz,Methanol-d4)δ 2.58(3H,s,H-18),3.42(1H,t,J=9.2 Hz,H-16),3.70(1H,dd,J=4.3,2.5 Hz,H-3),3.90(3H,s,Na-OMe),4.32(2H,m,H-17),6.96(1H,d,J=7.7 Hz,H-12),7.11(1H,td,J=7.6,1.1 Hz,H-10),7.31(1H,td,J=7.7,1.2 Hz,H-11),7.57(1H,dd,J=7.6,1.2 Hz,H-9).13C NMR(150 MHz,Methanol-d4)δ 26.2(C-18),28.6(C-14),38.9(C-6),40.5(C-15),40.5(C-16),57.8(C-7),62.4(C-17),63.9(Na-OMe),75.6(C-5),76.4(C-3),107.9(C-12),124.7(C-10),125.8(C-9),129.5(C-11),133.2(C-8),139.1(C-13),173.0(C-2),179.7(C-20),198.4(C-19).數(shù)據(jù)和參考文獻[13]相符。
2.1.2 化合物2C19H20N2O5,1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ 2.57(3H,s,H-18),3.91(3H,s,Na-OMe),4.72(1H,m,J=7.6,4.9,2.4 Hz,H-5),6.96(1H,d,J=7.6 Hz,H-12),7.13(1H,td,J=7.6,1.1 Hz,H-10),7.32(1H,td,J=7.7,1.2 Hz,H-11),7.59(1H,dd,J=7.6,1.2 Hz,H-9).13C NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ 26.1(C-18),38.6(C-6),39.4(C-16),49.9(C-15),55.9(C-7),61.9(C-17),64.0(Na-OMe),67.2(C-14),75.2(C-5),80.4(C-3),108.0(C-12),124.9(C-10),125.8(C-9),129.6(C-11),133.0(C-8),139.0(C-13),172.8(C-2),176.5(C-20),198.3(C-19).數(shù)據(jù)和參考文獻[14]相符。
2.1.3 化合物3C17H18N2O4,1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ 3.74(1H,dd,J=4.9,2.0 Hz,H-3),3.95(3H,s,Na-OMe),4.12(1H,m,H-5),4.24(1H,m,H-17),6.98(1H,dd,J=7.7,1.1 Hz,H-12),7.11(1H,td,J=7.6,1.1 Hz,H-10),7.32(1H,td,J=7.8,1.2 Hz,H-11),7.54(1H,dd,J=7.6,1.2 Hz,H-9).13C NMR(101 MHz,Methanol-d4)δ 27.8(C-14),37.5(C-16),37.7(C-6),38.1(C-15),57.2(C-7),58.5(C-5),62.6(C-17),64.0(Na-OMe),76.0(C-3),108.0(C-12),124.6(C-10),125.8(C-9),129.5(C-11),133.1(C-8),139.4(C-13),173.2(C-2),182.7(C-20).數(shù)據(jù)和參考文獻[15]相符。
2.1.4 化合物4C18H20N2O4,1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ 2.84(3H,s,Nb-Me),3.70(1H,dd,J=5.0,2.0 Hz,H-3),3.95(3H,s,Na-OMe),4.04(1H,m,H-5),6.99(1H,m,H-12),7.12(1H,td,J=7.6,1.1 Hz,H-10),7.32(1H,td,J=7.7,1.2 Hz,H-11),7.54(1H,dd,J=7.5 ,1.1 Hz,H-9).13C NMR(100 MHz,Methanol-d4)δ 27.9(C-14),28.4(Nb-Me),33.3(C-6),36.5(C-16),38.1(C-15),57.3(C-7),62.5(C-17),64.0(C-5),64.6(Na-OMe),76.3(C-3),108.1(C-12),124.6(C-10),125.8(C-9),129.5(C-11),132.9(C-8),139.4(C-13),173.0(C-2),179.3(C-20).數(shù)據(jù)和參考文獻[16]相符。
2.1.5 化合物5C19H22N2O5,1H NMR(400 MHz,Methanol-d4)δ 1.09(3H,t,J=7.2 Hz,H-18),2.23(1H,dd,J=16.0,4.8 Hz,H-6),3.84(1H,m,H-5),4.04(3H,s,Na-OMe),7.09(1H,m,H-12),7.18(1H,td,J=7.6,1.1 Hz,H-10),7.38(1H,td,J=7.7,1.2 Hz,H-11),7.58(1H,dd,J=7.5,1.2 Hz,H-9).13CNMR(100MHz,Methanol-d4)δ7.4(C-18),30.0(C-19),35.0C-16),35.3(C-6),55.8(C-7),56.7(C-5),62.2(C-17),64.2(Na-OMe),67.9(C-15),69.3(C-14),80.0(C-3),108.5(C-12),125.1(C-10),126.6(C-9),129.8(C-11),132.1(C-8),139.3(C-13),175.4(C-2),211.6(C-20).數(shù)據(jù)和參考文獻[17]相符。
2.2 抗真菌活性評價 通過觀察真菌菌絲的生長情況,對鉤吻總生物堿以及化合物1和3的抗真菌活性進行了評價,與對照組相比,能夠明顯發(fā)現(xiàn)鉤吻總生物堿在100 μg/mL的濃度下辣椒疫霉菌(P.capsici)具有中等的抑制活性,其菌絲生長抑制率為34.80 %,相同濃度下,化合物1和3并沒有顯示抗真菌活性,結(jié)果表明鉤吻總堿部位具有一定的抗真菌活性,提示鉤吻可能在辣椒疫霉菌的防治中具有一定的應(yīng)用前景。
鉤吻是中國著名毒性中藥,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[18],同時鉤吻在畜牧養(yǎng)殖業(yè)也具有極高的應(yīng)用價值,被稱為“豬人參”,可以對豬、羊等家畜產(chǎn)生促生長作用,極大提高了畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益[19]。辣椒疫霉菌是一種植物真菌,可引起辣椒疫病,是在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的毀滅性土傳病害[20],其在土壤中可長期存在,同時可在受侵染的病殘體中存活,寄主范圍廣[21]。前期鉤吻的中藥化學(xué)研究大部分集中于其根莖部位,針對鉤吻地上部分生物堿類成分研究報道相對較少。采用硅膠柱色譜、MCI 柱色譜、高效液相色譜(HPLC)等多種分離技術(shù)對鉤吻地上部位總生物堿進行了分離純化,結(jié)合核磁共振波譜(NMR)以及質(zhì)譜(MS)等結(jié)構(gòu)鑒定手段確定了所得單體成分結(jié)構(gòu),并且檢測了化合物1和化合物3及總生物堿提取物的抗辣椒疫霉菌活性,共分離得到5個鉤吻定堿類氧化單萜吲哚生物堿,分別鑒定為19-xo-gelsenicine(1),14-hydroxy-19-oxogelsenicine(2),gelsedilam(3),Nb-methylgelsedilam(4)和gelsemoxonine(5),抗菌活性測試發(fā)現(xiàn)鉤吻總生物堿提取物(100 μg/mL)對辣椒疫霉菌菌絲生長抑制率為34.80%,該研究為豐富鉤吻氧化單體吲哚生物堿的結(jié)構(gòu)類群提供支撐和有益借鑒,為進一步的鉤吻生物堿藥理學(xué)篩選提供物質(zhì)基礎(chǔ),同時為辣椒疫霉菌的防治提供參考。