黃文韜，李 冰△，陳 恒，李 武，李朵朵

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005，2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種涉及膝骨變性并累及周圍組織(特別是滑膜組織)的退行性關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中慢性低度炎癥是驅(qū)動(dòng)關(guān)節(jié)退化的主要原因之一[1]。隨著人口老齡化的加劇，KOA在臨床中的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病率已經(jīng)增加到45%，在老年人中高達(dá)80%，致殘率約53%，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量[2]。KOA的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長期慢性的不可逆過程，常采用保守治療和手術(shù)治療，尚無特效藥，在傳統(tǒng)中醫(yī)中認(rèn)為KOA病在筋骨，電針作為中醫(yī)藥的特色治療法，已經(jīng)被證實(shí)在KOA的保守治療方面發(fā)揮良好的療效，但作用機(jī)制尚不明確。臨床KOA患者大多表現(xiàn)出明顯的滑膜炎癥，減少炎癥介質(zhì)(白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子)的積聚與釋放，可以減輕KOA所致膝骨紅腫、疼痛等癥狀，滑膜炎癥可能是關(guān)節(jié)破壞的重要因素[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin，SIRT1)在滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，其高表達(dá)可降低高遷移率族蛋白B1(HMGB1)和促炎因子的表達(dá)，增加滑膜細(xì)胞的壽命[4-5]。本研究在以往的研究基礎(chǔ)上，以SIRT1激動(dòng)劑為對(duì)照，探討電針干預(yù)對(duì)KOA模型大鼠滑膜SIRT1/ HMGB1信號(hào)通路表達(dá)的影響，以期為臨床治療KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量約(200±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK(湘)2019-0004]，在湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(湘)2020-0008]飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)程序根據(jù)湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理規(guī)定進(jìn)行，允許大鼠在恒定溫度、濕度和光暗循環(huán)(20～25℃；55±10 %；12 h/12 h明暗光照循環(huán)，自由飲水和攝食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 SRT2104(批號(hào)：SC0272)，碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-1β ELISA試劑盒(批號(hào)：E-EL-R0012c)、IL-6 ELISA試劑盒(批號(hào)：E-EL-R0015c)，Elabscience公司；SIRT1抗體(批號(hào)：60303-1-1g)，proteintech公司；HMGB1抗體(批號(hào)：66525-1-1g)，proteintech公司；HRP標(biāo)記山羊抗大鼠(批號(hào)：G0001-2L)，Servicebio公司。SIRT1、HMGB1和β-actin引物，上海生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 SDZ-ⅡB型華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，中國)，Envision2105型酶標(biāo)儀(PE公司)；ChemiDoc MP 型全能型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)；DYY-6C型電泳儀(中國北京六一)；D3024R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(DRAGONLAB，中國)。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與分組[6]大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組、SIRT1激動(dòng)劑組(SRT2104，25mg/kg)，每組8只。除正常組外，其余各組參考文獻(xiàn)誘導(dǎo)KOA模型：3%戊巴比妥鈉(2 mg/kg)腹腔注射麻醉，分別在造模的第1、4、7 d，于左膝關(guān)節(jié)間隙處注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，然后按壓1 min，來回屈伸關(guān)節(jié)使藥液吸收，右膝不做處理。以Lequesne MG評(píng)分評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎功能障礙程度，并判斷造模是否成功。

1.3.2 干預(yù)方法 在模型復(fù)制成功后第3 d，將SD大鼠固定在鼠板上，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]選取穴位位置：內(nèi)膝眼、外膝眼、陰陵泉穴，采用華佗牌針0.25 mm×25 mm進(jìn)行針刺，穴位深度3～5 mm，針柄處連接華佗牌SDZ-ⅡB型電子針療儀，電流輸出強(qiáng)度1 mA，疏密波型，刺激10 min/次，每日1次，連續(xù)14 d；對(duì)照組給予相同時(shí)間相同時(shí)長的固定。激動(dòng)劑組[8]腹腔內(nèi)注射SIRT1激動(dòng)劑SRT2104溶液(采用10%DMSO生理鹽水稀釋至2.5 mg/mL，2 mL)，從實(shí)驗(yàn)第1 d開始，每周注射2次。正常組腹腔注射2 mL 10%DMSO生理鹽水溶液。

1.3.3 行為學(xué)測試 Lequesne MG評(píng)分包括4個(gè)指標(biāo)之和：①局部疼痛度(無疼痛0分，患肢收縮1分，收縮伴輕度全身反應(yīng)2分，收縮伴重度全身反應(yīng)3分)；②步態(tài)改變度(正常行走0分，輕度跛行1分，跛行明顯2分，患肢不參與行走3分)；③關(guān)節(jié)腫脹度(無腫脹0分，輕度腫脹1分，重度腫脹2分)；④關(guān)節(jié)活動(dòng)度(活動(dòng)角度>90°0分，活動(dòng)角度45°～90°1分，活動(dòng)角度15°～45°2分，活動(dòng)角度15°3分)。以此，評(píng)價(jià)膝骨關(guān)節(jié)炎損傷嚴(yán)重程度。

1.3.4 樣本采集 行為學(xué)評(píng)估結(jié)束后，采用3%戊巴比妥(2 mg/kg)麻醉大鼠，大鼠膝骨關(guān)節(jié)處注入1 mL生理鹽水收集大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液，-80℃保存待用；然后剖取膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織，每組中4只浸泡于固定液(4%多聚甲醛)，保存待用；剩余組織置于凍存管中，保存于-80℃。

1.3.5 Elisa法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜液IL-1β和IL-6的含量變化 取凍存的關(guān)節(jié)滑膜液，梯度解凍后，將試劑盒平衡至室溫，按照試劑盒說明書檢測膝關(guān)節(jié)滑膜液IL-1β和IL-6的含量變化。

1.3.6 HE染色檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)變化 大鼠膝關(guān)節(jié)組織在固定液中固定15～20 d后，常規(guī)石蠟包埋，切片，制作成4 μm厚的石蠟切片，脫蠟、蘇木素和伊紅染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.7 Western-blot法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1表達(dá)變化 取凍存的膝關(guān)節(jié)滑膜組織100 mg，加入RIPA裂解液1 mL和100 μL PMSF溶液(1 mmol/kg)，低溫勻漿，靜置30 min，離心(12000 r，5 min，4 ℃)取上清液，采用核酸蛋白溶度儀測定總蛋白的濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入SIRT1和HMGB1蛋白和內(nèi)參蛋白β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入二抗孵育，ECL試劑顯影，成像系統(tǒng)獲取條帶圖像，Quantity One軟件定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.8 RT-PCR法檢測膝關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1基因表達(dá)變化 取上述凍存的海馬組織，加入1 mL Trizol，低溫下勻漿，裂解5 min，提取樣本總RNA，核酸蛋白測定儀定量。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為2× SYBR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 10 s，60℃ 30 s，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)。以GADPH為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后以2-ΔΔCt法計(jì)算分析目的基因SIRT1和HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：SIRT1：Forward：5′-TCTCCCAGATCCTCAAGCCAA-3′，Reverse：5′-TGTCCGGGATATATTTCCTTTGC-3′，93bp；HMGB1：Forward：5′-GTCCACACACCCTGCATATTG-3′，Reverse：GTCCTCAGGTAAGGAGCAGAAC-3′，213bp；β-actin：Forward：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，Reverse：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′，223 bp。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)行為學(xué)的影響 各組大鼠造模后和治療后Lequesne MG評(píng)分如表1所示，造模后，與正常組比較，其余各組大鼠左膝關(guān)節(jié)局部疼痛腫脹與活動(dòng)度增加、步態(tài)改變顯著，Lequesne MG評(píng)分總分明顯升高(P<0.01)，提示模型復(fù)制成功。干預(yù)后，與模型組比較，電針組和SIRT1激動(dòng)劑組可改善大鼠左膝關(guān)節(jié)腫脹與活動(dòng)度、局部疼痛、步態(tài)，Lequesne MG評(píng)分總分明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后膝骨關(guān)節(jié)行為學(xué)比較

2.2 電針對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜液IL-1β和IL-6含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液中IL-1β和IL-6含量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，電針組和SIRT1激動(dòng)劑組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜液中IL-1β和IL-6含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.3 電針對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)病理學(xué)的影響 正常組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜上皮組織形態(tài)正常，滑膜細(xì)胞排列有序，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜上皮組織嚴(yán)重增生，滑膜細(xì)胞核大深染，排列不整齊，可見彌漫大量炎性細(xì)胞；電針組和激動(dòng)劑組膝骨關(guān)節(jié)滑膜上皮組織輕微增生，滑膜細(xì)胞核染較淺，可見少量散在炎性細(xì)胞。

正常組

2.4 電針對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，電針組和SIRT1激動(dòng)劑組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增加，HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖2，表3。

A.正常組 B.模型組 C.電針組 D.SIRT1激動(dòng)劑組

表3 各組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 電針對(duì)大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，電針組和SIRT1激動(dòng)劑組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRT1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加，HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠膝骨關(guān)節(jié)滑膜組織SIRT1和HMGB1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎在傳統(tǒng)中醫(yī)屬于痹證范疇，稱之為“骨痹”、“膝弊”等，與外感風(fēng)寒濕邪和(或)年長體衰勞損等導(dǎo)致肝腎虧虛、經(jīng)脈閉阻有關(guān)，治療多從筋論治，調(diào)衡筋經(jīng)陰陽氣血、疏利關(guān)節(jié)[9]。針灸可通過經(jīng)絡(luò)、腧穴的傳導(dǎo)作用內(nèi)病外治，在臨床治療KOA中不僅可以有效調(diào)節(jié)疼痛中樞，改善微循環(huán)，還能避免藥物治療時(shí)的不良反應(yīng)，提高了治療的安全性[10]。位于膝關(guān)節(jié)之髕骨下兩側(cè)的內(nèi)膝眼穴和外膝眼穴，具有“通經(jīng)活絡(luò)，消腫止痛”之功，再配以“清利濕熱、益腎調(diào)經(jīng)”的陰陵泉穴，在治療KOA發(fā)揮良好的作用。本研究選取以上穴位，予以現(xiàn)代與傳統(tǒng)相結(jié)合的電針刺激，明顯改善大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)度、局部疼痛與步態(tài)。

KOA疾病早期即觀察到滑膜的慢性炎癥反應(yīng)，其可導(dǎo)致血管形成增加、關(guān)節(jié)炎性浸潤疼痛、腫脹僵硬等，抑制滑膜細(xì)胞增殖和炎性因子釋放，可有效控制關(guān)節(jié)變形，減緩KOA病程。膝骨滑膜主要由內(nèi)膜常駐巨噬細(xì)胞和成纖細(xì)胞構(gòu)成，與下層血管化結(jié)締組織等構(gòu)成了滑膜液的主要成分，對(duì)于維持正常軟骨和關(guān)節(jié)功能發(fā)揮重要作用[11]。SIRT1是一種NAD+依賴性III類蛋白脫乙酰酶，可抑制細(xì)胞代謝凋亡、炎癥反應(yīng)等，促進(jìn)各類細(xì)胞存活。有研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1參與KOA滑膜炎癥發(fā)展，低表達(dá)能夠?qū)е麓傺装Y因子的釋放，增加血管裔的生成，減少軟骨細(xì)胞的存活率[12]。此外，SIRT1激動(dòng)劑能夠減少Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型大鼠滑膜細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，有效緩解滑膜炎癥[13]。

HMGB1是炎癥反應(yīng)的重要警報(bào)器，當(dāng)機(jī)體受到炎癥侵襲時(shí)，其賴氨酸殘基乙?；?，然后釋放至胞質(zhì)或胞外參與炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。臨床研究顯示，關(guān)節(jié)炎患者血清和滑膜液中HMGB1的表達(dá)明顯升高，并與病情的發(fā)展成正相關(guān)，是關(guān)節(jié)軟骨損傷的標(biāo)志蛋白；HMGB1還能與IL-1形成復(fù)合體，促進(jìn)KOA大鼠模型滑膜成纖維細(xì)胞釋放相關(guān)促炎因子，并加速關(guān)節(jié)軟骨的降解[14-15]。SIRT1是乙酰化/去乙?；揎椀纳嫌握{(diào)節(jié)劑，可以通過去乙酰化作用調(diào)節(jié)HMGB1的釋放，從而減弱炎癥介質(zhì)(IL-1β、IL-6等)的釋放[16]。SIRT1過表達(dá)能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1乙酰化和核質(zhì)易位[17]。SIRT1新型激動(dòng)劑SRT2104，能減輕葡聚糖硫酸鈉(DDS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的炎癥，還能顯著減弱LPS誘導(dǎo)的IL-6釋放[18]。

本研究選用激動(dòng)劑SRT2104和電針干預(yù)KOA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其能有效改善滑膜炎性浸潤和損傷，減少滑膜液中炎性因子(IL-1β和IL-6)的釋放，調(diào)控滑膜組織中SIRT1和HMGB1蛋白基因的相對(duì)表達(dá)，因此，我們有理由認(rèn)為SIRT1/ HMGB1信號(hào)通路在KOA的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色。電針作為一種綠色療法已經(jīng)在臨床KOA的治療效果中被肯定，本研究為其提供更加科學(xué)和深入的理論支撐。