潘云霞，焦卓亞，彭 燦，宋 航, 3，劉俊卿，陳峰遠(yuǎn), 3*

靈芝多糖調(diào)控抗氧化因子表達(dá)抑制乳腺癌惡性表型研究

潘云霞1，焦卓亞1，彭 燦2, 4, 5，宋 航1, 3，劉俊卿1，陳峰遠(yuǎn)1, 3*

1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012 3. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012 4. 藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012 5. 省部共建安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230012

研究靈芝多糖對(duì)乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞分別給予靈芝多糖（25、50、75 mg/mL）干預(yù)后，MTS法檢測(cè)靈芝多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響；TUNEL染色及流式細(xì)胞術(shù)探測(cè)靈芝多糖對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平；采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)抗氧化相關(guān)基因谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基（glutamate-cysteine ligase regulatory subunit，）、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，）、人硫氧還蛋白還原酶1（human thioredoxin reductase 1，）、蘋果酸酶1（malic enzyme 1，）、硫氧還蛋白（thioredoxin，）mRNA表達(dá)；采用Western blotting檢測(cè)GCLM、TXNRD1蛋白表達(dá)。給予靈芝多糖干預(yù)后，MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞活性明顯降低（＜0.01），凋亡率顯著升高（＜0.05、0.01），細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（＜0.05、0.01），GSH水平明顯下降（＜0.01）；抗氧化因子mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）。靈芝多糖能夠通過(guò)抑制GCLM等抗氧化基因表達(dá)誘導(dǎo)ROS生成，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制乳腺癌惡性進(jìn)展。

靈芝多糖；乳腺癌；活性氧；谷胱甘肽；谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基

靈芝是一種多孔菌科真菌的子實(shí)體，為我國(guó)傳統(tǒng)著名中藥，被譽(yù)為“仙草”。其味甘，性平，歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有益氣活血、扶正補(bǔ)虛之功效。靈芝主要活性成分為三萜類和多糖類化合物，此外還含有核苷酸、生物堿、甾醇、脂肪酸、多肽以及微量元素等。靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)作用等多種藥理活性[1]。靈芝多糖可通過(guò)提高機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤的功效[2]。

乳腺癌在《神農(nóng)本草經(jīng)》普濟(jì)方中稱為乳巖、石癰、翻花等[3]。中醫(yī)認(rèn)為氣滯血瘀、痰凝毒結(jié)為乳腺癌發(fā)病之本，因此靈芝益氣活血、扶正補(bǔ)虛治法符合乳腺癌根本治法。2020年乳腺癌新發(fā)病例數(shù)高達(dá)226萬(wàn)，超過(guò)肺癌，已成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤[4]。盡管醫(yī)療水平的提升延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，但是治療引起的性功能障礙和疼痛等一系列問(wèn)題仍造成患者生活質(zhì)量下降。此外晚期乳腺癌患者5年生存率僅為20%。因此深入了解乳腺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為乳腺癌治療、藥物研發(fā)和診斷監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)和新思路，具有重要的臨床意義。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成與乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，低水平的ROS可通過(guò)誘導(dǎo)基因突變、激活多條信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[5]；而高濃度的ROS堆積可導(dǎo)致線粒體功能損傷，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，因此腫瘤細(xì)胞對(duì)異常增高的ROS更為敏感。冬凌草甲素[7]、松蘿酸[8]等可通過(guò)誘導(dǎo)ROS生成誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。但靈芝多糖調(diào)控乳腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的功能及作用機(jī)制并不明確。因此本研究以人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting、qRT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)考察靈芝多糖在乳腺癌氧化應(yīng)激中的調(diào)控功能及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞

MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞（批號(hào)分別為SCSP-5043、SCSP-531）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥品與試劑

胎牛血清（批號(hào)04-001-1ACS）、RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)2134234）購(gòu)自以色列BI公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)SH30022.01）購(gòu)自Hyclone公司；青霉素-鏈霉素（批號(hào)C0222）、Annexin V-FITC試劑盒（批號(hào)C1062M）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0052）；RIPA裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；靈芝多糖（批號(hào)BCSW210324-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%）購(gòu)自西安百川生物科技有限公司；MTS細(xì)胞增殖試劑盒（批號(hào)G3580）購(gòu)自Progema公司；4%多聚甲醛（批號(hào)1912A05）、化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)BL520A）購(gòu)自Biosharp公司；TUNEL染色試劑盒（批號(hào)7E521C1）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)R232-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；H2DCFDA試劑（批號(hào)D399）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SYBR（批號(hào)MPC2201032）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；Trizol（批號(hào)15596026）、ProLong? Diamond抗淬滅封片劑（含DAPI，批號(hào)P36971）購(gòu)自Invitrogen公司；谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基（glutamate-cysteine ligase regulatory subunit，）、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，）、人硫氧還蛋白還原酶1（human thioredoxin reductase 1，）、蘋果酸酶1（malic enzyme 1，）、硫氧還蛋白（thioredoxin，）、引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；β-actin抗體（批號(hào)3700S）、二抗（批號(hào)14709S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；GCLM抗體（批號(hào)EPR6667）、TXNRD抗體（批號(hào)EPNCIR129）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器

HF160W型恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；318C+型酶標(biāo)儀（上海贛閩分析儀器有限公司）；DMi8型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；FACSCelesta流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；1645070型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Light Cycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以5×103個(gè)/mL接種于96孔板，100 μL/孔，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。靈芝多糖用DMEM培養(yǎng)基分別配制成20、40、80、120 mg/mL的溶液，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，每孔加入100 μL 1×MTS試劑，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量。

2.3 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

在24孔板內(nèi)放入細(xì)胞爬片，MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以5×104個(gè)/孔接種于24孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。分別加入不同濃度（25、50、75 mg/mL）的靈芝多糖，另設(shè)置對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，加入4%多聚甲醛，室溫靜置20 min，PBS清洗2次，每次5 min。隨后每孔加入0.2 mL 0.5% Triton-X100，室溫靜置10 min，PBS清洗2次，每次5 min，采用TUNEL染色試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，PBS清洗2次，每次5 min。取出爬片，以抗淬滅封片劑封片，于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用LAS AF Lite軟件處理，計(jì)算凋亡率。

凋亡率＝TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以3×105個(gè)/孔接種于12孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，加入不含EDTA的胰酶進(jìn)行消化，待消化完全后，加入培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5×104個(gè)細(xì)胞，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞并置于流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，加入10 μL 碘化丙啶（PI），輕輕混勻，避光冰浴20 min，隨后上機(jī)檢測(cè)，采用FlowJo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以3×105個(gè)/孔接種于12孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入500 μL培養(yǎng)基（含0.2 μL H2DCFDA），置于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 min。胰酶消化后收集細(xì)胞，PBS重懸后，隨后上機(jī)檢測(cè)，采用FlowJo軟件分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.6 細(xì)胞內(nèi)GSH水平檢測(cè)

MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以3×105個(gè)/孔接種于12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，胰酶消化后收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)。按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH水平。

2.7 qRT-PCR檢測(cè)GCLM、GCLC、TXNRD1、ME1和TXN mRNA表達(dá)

MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以3×105個(gè)/孔接種于12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，按照試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.8 Western blotting檢測(cè)TXNRD1和GCLM蛋白表達(dá)

MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞分別以3×105個(gè)/孔接種于12孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組和給藥，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，4 ℃、3600 r/min離心5 min，棄去PBS。加入RIPA裂解液，于冰上裂解細(xì)胞30 min；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入β-actin抗體（1∶5000）、GCLM抗體（1∶1500）、TXNRD抗體（1∶1500），4 ℃搖床孵育過(guò)夜；以TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 靈芝多糖抑制乳腺癌細(xì)胞增殖

MCF-7細(xì)胞IC50為45.17 mg/mL，MDA-MB-231細(xì)胞IC50為55.74 mg/mL，2種細(xì)胞的IC50接近50 mg/mL，因此取50 mg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。將IC50的50%、100%、150%作為實(shí)驗(yàn)的低、中、高劑量，即分別以25、50、75 mg/mL靈芝多糖進(jìn)行后續(xù)研究。如圖1-A、B所示，靈芝多糖顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖（＜0.01）。如圖1-C、D所示，靈芝多糖顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡（＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，給予靈芝多糖后，乳腺癌細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率明顯升高（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

3.2 靈芝多糖誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS生成

如圖3所示，靈芝多糖顯著誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS生成（＜0.05、0.01），表明靈芝多糖可能通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞ROS生成促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 靈芝多糖促進(jìn)MCF-7 (A) 和MDA-MB-231 (B) 細(xì)胞凋亡(, n = 3)

圖3 靈芝多糖誘導(dǎo)MCF-7 (A) 和MDA-MB-231 (B) 細(xì)胞內(nèi)ROS生成(, n = 3)

3.3 靈芝多糖抑制乳腺癌細(xì)胞內(nèi)GSH水平

GSH是廣泛存在于生物體內(nèi)的生物活性非蛋白硫醇化合物。研究表明，腫瘤細(xì)胞GSH水平升高可及時(shí)清除過(guò)多的ROS，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。推測(cè)靈芝多糖是否通過(guò)抑制GSH合成誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞ROS生成。如圖4所示，靈芝多糖顯著抑制乳腺癌細(xì)胞內(nèi)GSH合成（＜0.01）。

3.4 靈芝多糖抑制抗氧化因子基因和蛋白表達(dá)

為了進(jìn)一步探究靈芝多糖抑制GSH合成的作用機(jī)制，對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞抗氧化因子的基因及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。如圖5、6所示，靈芝多糖顯著抑制MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞、、和mRNA表達(dá)（＜0.05、0.01），顯著抑制MCF-7細(xì)胞mRNA表達(dá)（＜0.05），而靈芝多糖高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞中mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.01）。Western blotting實(shí)驗(yàn)也證實(shí)靈芝多糖可顯著抑制GSH合成關(guān)鍵酶GCLM蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01）。TXNRD可以通過(guò)活性中心二硫醇可逆氧化成二硫化物，作為氧化還原反應(yīng)中的氫供體，發(fā)揮抗氧化功能。結(jié)果顯示，靈芝多糖可顯著抑制TXNRD蛋白表達(dá)（＜0.01）。

圖4 靈芝多糖抑制MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)GSH合成(, n = 3)

圖5 靈芝多糖抑制MCF-7細(xì)胞抗氧化相關(guān)因子表達(dá)(, n = 3)

圖6 靈芝多糖抑制MDA-MB-231細(xì)胞抗氧化相關(guān)因子表達(dá)(, n = 3)

4 討論

2020年我國(guó)乳腺癌新發(fā)病例約33.2萬(wàn)，發(fā)病病例高居全球第1位；死亡人數(shù)約為11.7萬(wàn)，位居女性惡性腫瘤死亡首位[10]。在過(guò)去10年，乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療方面取得了重大進(jìn)展[11]。目前乳腺癌的治療選擇包括手術(shù)干預(yù)、放療、新化療和輔助化療、激素療法或分子靶向療法，可根據(jù)患者的身體狀況和癌癥狀態(tài)，制定個(gè)性化治療方案[12]。盡管這些治療延長(zhǎng)了患者的生存周期，但是晚期乳腺癌患者死亡率高。與此同時(shí)，三陰性乳腺癌具有惡性度高、侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差等特征，患者對(duì)內(nèi)分泌治療和靶向治療不敏感。因此進(jìn)一步研究乳腺癌惡性進(jìn)展分子機(jī)制，尋求一種不良反應(yīng)小的輔助治療方法具有重要意義。

靈芝被譽(yù)為“仙草”“瑞草”，是我國(guó)傳統(tǒng)著名中藥。靈芝具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗炎、抗腫瘤等多種藥理作用[13]，靈芝多糖是靈芝的主要成分，可抑制結(jié)腸癌[14]、肺癌[15]、前列腺癌[16]、肝癌[17]等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究顯示，靈芝多糖通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能，進(jìn)而抑制肝癌發(fā)生發(fā)展[17]；靈芝多糖可通過(guò)改善腸道菌群，激活腹膜巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)自噬體形成抑制結(jié)腸癌惡性進(jìn)展[14]；靈芝水提物通過(guò)抑制尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，uPA）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性，抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖與遷移[18]；靈芝孢子多糖與紫杉醇聯(lián)合用藥可通過(guò)調(diào)控腫瘤代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善腸道菌群失調(diào)，從而顯示出更好的抗乳腺癌活性[19]。本研究通過(guò)MTS增殖法、TUNEL染色及Annexin V-FITC雙染確定靈芝多糖可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

ROS是細(xì)胞線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生的性質(zhì)活潑的含氧物質(zhì)。因線粒體功能障礙、代謝改變、基因突變，癌細(xì)胞中ROS產(chǎn)量明顯增加[20]。適度提高ROS的水平可激活p38有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）等多條信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[21]，可通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白降解促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[22]。然而，過(guò)度的ROS積累可導(dǎo)致大分子物質(zhì)氧化損傷，從而引起細(xì)胞死亡[23]。補(bǔ)骨脂乙素、冬凌草甲素等能夠通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS升高誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[7,24]。靈芝提取物可通過(guò)促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞ROS生成誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[16]。本研究以H2DCFDA為細(xì)胞內(nèi)ROS探針，發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可升高M(jìn)CF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)ROS水平。MCF-7細(xì)胞中，靈芝多糖高劑量組ROS水平最高；而MDA-MB-231細(xì)胞中，靈芝多糖中劑量組ROS水平最高，其原因可能為①凋亡影響：流式結(jié)果中，對(duì)于MCF-7細(xì)胞，靈芝多糖高劑量組細(xì)胞凋亡率約為41%；而對(duì)于MDA-MB-231細(xì)胞，靈芝多糖高劑量組細(xì)胞凋亡率約為76.7%；相較于MCF-7細(xì)胞，靈芝多糖高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率更高。H2DCFDA為探針檢測(cè)ROS主要針對(duì)活細(xì)胞，由于靈芝多糖高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率過(guò)高，因此靈芝多糖中劑量組MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)ROS水平最高。②細(xì)胞背景不同：MCF-7細(xì)胞是雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞（ER＋，野生型p53），MDA-MB-231細(xì)胞是三陰性乳腺癌細(xì)胞（ER?，突變型p53），由于細(xì)胞背景及代謝不同，也可能導(dǎo)致此差異。

由于腫瘤細(xì)胞具有高負(fù)荷的ROS特征，其細(xì)胞進(jìn)化出多種防御機(jī)制降低ROS的不利影響，其中一種重要機(jī)制是激活抗氧化系統(tǒng)。抗氧化系統(tǒng)主要有2類，第1類是抗氧化酶類，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等，第2類是含巰基的小分子蛋白質(zhì)，包括硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）和GSH等。GSH是一種由-谷氨酸、-半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。GSH是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸在胞質(zhì)中通過(guò)兩步反應(yīng)合成，第1步反應(yīng)是由GCLC和催化亞基GCLM催化下形成γ-谷氨酰半胱氨酸；第二步反應(yīng)是谷胱甘肽合成酶將甘氨酸添加到γ-谷氨酰半胱氨酸中并產(chǎn)生GSH。其中GCLM是GSH合成關(guān)鍵限速酶[25]。研究顯示，HIF-1可在缺氧條件下激活GCL表達(dá)和促進(jìn)GSH合成，從而促進(jìn)化療后乳腺癌干細(xì)胞增殖[26]。本研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可抑制MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)GSH生成，推測(cè)靈芝多糖通過(guò)抑制GSH生成誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞ROS生成。結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞中，靈芝多糖中劑量組GSH水平高于低劑量組，推測(cè)可能是由于癌細(xì)胞除合成GSH等含巰基的小分子物質(zhì)，還可通過(guò)表達(dá)抗氧化酶消除ROS所帶來(lái)的不利影響，因此低劑量的靈芝多糖在MDA-MB-231細(xì)胞中可能通過(guò)其他保護(hù)機(jī)制減少氧化應(yīng)激損傷。MDA-MB-231細(xì)胞中，靈芝多糖中劑量組、等mRNA與蛋白表達(dá)水平均高于高劑量組；GCLM與GCLC為谷胱甘肽生物合成過(guò)程的限速酶，因此靈芝多糖中劑量組細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著高于高劑量組。

作為GSH合成關(guān)鍵限速酶的修飾亞基，GCLM在腫瘤發(fā)生發(fā)展有著重要作用。GCLM缺失導(dǎo)致乳腺癌小鼠模型中的腫瘤延遲發(fā)病[25]；此外，GCLM高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的治療抗性有關(guān)[27]。Western blotting及qRT-PCR結(jié)果顯示，靈芝多糖可通過(guò)抑制TXNRD1、GCLM多種抗氧化因子表達(dá)抑制GSH生成，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成。推測(cè)靈芝多糖可能夠通過(guò)抑制多種抗氧化基因表達(dá)誘導(dǎo)ROS生成，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制乳腺癌惡性進(jìn)展（圖7）。

圖7 靈芝多糖誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

綜上所述，本研究初步探討了靈芝多糖在乳腺癌氧化應(yīng)激中的功能及其相關(guān)分子機(jī)制，驗(yàn)證了靈芝多糖通過(guò)抑制GCLM抑制GSH合成，從而誘導(dǎo)ROS在細(xì)胞內(nèi)大量累積，最終誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞凋亡。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 謝溢坤, 張靜, 余茜, 等. 靈芝多糖類成分及其生物活性研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(17): 5414-5429.

[2] Ahmad M F.: A rational pharmacological approach to surmount cancer [J]., 2020, 260: 113047.

[3] 宋·陳自明原著, 明·薛已校注, 許潤(rùn)三注釋. 《校注婦人良方》注釋 [M]. 南昌: 江西人民出版社, 1983: 449-450.

[4] Sung H, Ferlay J, Siegel R L,. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries [J]., 2021, 71(3): 209-249.

[5] Cheung E C, Vousden K H. The role of ROS in tumour development and progression [J]., 2022, 22(5): 280-297.

[6] Gorrini C, Harris I S, Mak T W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy [J]., 2013, 12(12): 931-947.

[7] Zhao Y, Xiao W W, Peng W Q,. Oridonin-loaded nanoparticles inhibit breast cancer progression through regulation of ROS-related Nrf2 signaling pathway [J]., 2021, 9: 600579.

[8] 左舒婷. 松蘿酸通過(guò)ROS誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究 [D]. 長(zhǎng)春: 吉林大學(xué), 2016.

[9] Niu B Y, Liao K X, Zhou Y X,. Application of glutathione depletion in cancer therapy: Enhanced ROS-based therapy, ferroptosis, and chemotherapy [J]., 2021, 277: 121110.

[10] 閔淑慧, 胡依, 郭芮綺, 等. 1990—2019年中國(guó)女性乳腺癌疾病負(fù)擔(dān)及變化趨勢(shì)分析 [J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2021, 48(16): 2941-2945.

[11] DiNardo D, McNeil M A. Update in breast cancer screening, prevention, and treatment [J]., 2021, 30(8): 1074-1077.

[12] Fan L, Strasser-Weippl K, Li J J,. Breast cancer in China [J]., 2014, 15(7): e279-e289.

[13] 方雅玲, 張玉琴, 吳長(zhǎng)輝, 等. 靈芝孢子油、破壁靈芝孢子粉及靈芝孢子提取物對(duì)小鼠急性胃潰瘍的保護(hù)作用[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2022, 45(2): 308-313.

[14] Guo C L, Guo D D, Fang L,.polysaccharide modulates gut microbiota and immune cell function to inhibit inflammation and tumorigenesis in colon [J]., 2021, 267: 118231.

[15] Hsu W H, Qiu W L, Tsao S M,. Effects of WSG, a polysaccharide from, on suppressing cell growth and mobility of lung cancer [J]., 2020, 165(Pt A): 1604-1613.

[16] Wu K K, Na K, Chen D,. Effects of non-steroidal anti-inflammatory drug-activated gene-1 onpolysaccharides-induced apoptosis of human prostate cancer PC-3 cells [J]., 2018, 53(6): 2356-2368.

[17] Li A M, Shuai X Y, Jia Z J,.polysaccharide extract inhibits hepatocellular carcinoma growth by downregulating regulatory T cells accumulation and function by inducing microRNA-125b [J]., 2015, 13: 100.

[18] Sliva D, Labarrere C, Slivova V,.suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer cells [J]., 2002, 298(4): 603-612.

[19] Li D, Gao L, Li M X,. Polysaccharide from spore ofameliorates paclitaxel-induced intestinal barrier injury: Apoptosis inhibition by reversing microtubule polymerization [J]., 2020, 130: 110539.

[20] Moloney J N, Cotter T G. ROS signalling in the biology of cancer [J]., 2018, 80: 50-64.

[21] Shi Y, Xu S F, Ngoi N Y L,. PRL-3 dephosphorylates p38 MAPK to promote cell survival under stress [J]., 2021, 177: 72-87.

[22] Wang Y W, Qi H, Liu Y,. The double-edged roles of ROS in cancer prevention and therapy [J]., 2021, 11(10): 4839-4857.

[23] 牟伊, 文帥, 高新星, 等. 基于活性氧調(diào)控的抗腫瘤藥物研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 55(7): 1453-1465.

[24] 張玉心, 高美佳, 朱美林, 等. 補(bǔ)骨脂乙素通過(guò)多途徑誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞死亡 [J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 42(6): 878-885.

[25] Lu S C. Regulation of glutathione synthesis [J]., 2009, 30(1/2): 42-59.

[26] Lu H Q, Samanta D, Xiang L S,. Chemotherapy triggers HIF-1-dependent glutathione synthesis and copper chelation that induces the breast cancer stem cell phenotype [J]., 2015, 112(33): E4600-E4609.

[27] Fujimori S, Abe Y, Nishi M,. The subunits of glutamate cysteine ligase enhance cisplatin resistance in human non-small cell lung cancer xenografts[J]., 2004, 25(2): 413-418.

polysaccharide inhibits malignant phenotype of breast cancer via regulation of antioxidant factor expressions

PAN Yun-xia1, JIAO Zhuo-ya1, PENG Can2, 4, 5, SONG Hang1, 3, LIU Jun-qing1, CHEN Feng-yuan1, 3

1. School of Integrated Chinese and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2. School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 3. Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 4. Anhui Province Key Laboratory of Pharmaceutical Preparation Technology and Application, Hefei 230012, China 5. MOE-Anhui Joint Collaborative Innovation Center for Quality Improvement of Anhui Genuine Chinese Medicinal Materials, Hefei 230012, China

To study the effect and mechanism ofpolysaccharide (GLP) on apoptosis of MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells.MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells were treated with GLP (25, 50, 75 mg/mL), MTS method was used to detect the effect of GLP on the proliferation of breast cancer cells; TUNEL staining and flow cytometry were used to detect the effect of GLP on apoptosis of breast cancer cells; The level of reactive oxygen species (ROS) in cells was detected by flow cytometry; The intracellular glutathione (GSH) level was detected; The mRNA expressions of antioxidant related genes glutamate cysteine ligase regulatory subunit (), glutamate cysteine ligase catalytic subunit (), human thioredoxin reductase 1 (), malic enzyme 1 () and thioredoxin () were detected by qRT-PCR technique; Western blotting was used to detect the expressions of GCLM and TXNRD1 proteins.After GLP intervention, activities of MCF-7 and MDA MB-231 cells were significantly decreased (< 0.01), apoptosis rate was increased (< 0.05, 0.01), intracellular ROS level was increased (< 0.05, 0.01), and GSH level was decreased (< 0.01); mRNA and protein expressions of antioxidant factors were significantly decreased (< 0.05, 0.01).GLP can induce ROS production by inhibiting the expression of antioxidant genes such as GCLM, promote the apoptosis of breast cancer cells, and then inhibit the malignant progress of breast cancer.

polysaccharide; breast cancer; reactive oxygen species; glutathione; glutamate-cysteine ligase regulatory subunit

R285.5

A

0253 - 2670(2022)23 - 7440 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.014

2022-08-26

安徽省教育廳重點(diǎn)研究項(xiàng)目（KJ2021A0603）；安徽省留學(xué)回國(guó)人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)扶持計(jì)劃（2020LXC009）；安徽中醫(yī)藥大學(xué)青年科技英才培育項(xiàng)目（2021qnyc03）；安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KFZZ202205）；安徽高校協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目（GXXT-2020-025）；安徽省科技重大專項(xiàng)（202103a07020001）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（S202110369084）

潘云霞（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治腫瘤。Tel: 15855192321 E-mail: yunxiapan@sina.com

通信作者：陳峰遠(yuǎn)（1989—），女，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治腫瘤。Tel: 19810698616 E-mail: isobellachen@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]