劉孟奇，回成程，陳隨清，郭 濤, 2*，王海波，辛海量

艾葉及其腺毛顯微鑒定研究

劉孟奇1，回成程1，陳隨清1，郭 濤1, 2*，王海波3，辛海量2, 4*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046 2. 仲景中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究院，河南 南陽(yáng) 473001 3. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450018 4. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433

為艾葉及腺毛的顯微鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。利用熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)艾葉進(jìn)行顯微和組織化學(xué)研究。艾葉上、下表面均分布有腺毛和非腺毛。腺毛由2列細(xì)胞構(gòu)成，其頭部由4或6個(gè)細(xì)胞對(duì)疊而成，柄部和基部各由2個(gè)細(xì)胞構(gòu)成；非腺毛均為T(mén)形，柄由2～5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，按照頂細(xì)胞特點(diǎn)將T形非腺毛分為2種：一種頂細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形而彎曲（I型）；另一種頂細(xì)胞呈細(xì)絲狀，極長(zhǎng)、扁平且扭曲（II型）。草酸鈣簇晶直徑3～40 μm，多存在于葉肉細(xì)胞中；上表面氣孔稀少，下表面氣孔多，氣孔為不定式；上、下表皮細(xì)胞的垂周壁均為波狀彎曲。常見(jiàn)螺紋導(dǎo)管，偶見(jiàn)環(huán)紋、梯紋、網(wǎng)紋和孔紋導(dǎo)管。組織化學(xué)研究顯示，腺毛有揮發(fā)油、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等成分。為下一版《中國(guó)藥典》艾葉顯微鑒定相關(guān)內(nèi)容的修訂和完善提供了重要參考依據(jù)。

艾；顯微鑒定；腺毛；非腺毛；組織化學(xué)

艾Lévi. et Vant.為菊科蒿屬植物，中藥艾葉為其干燥葉，具溫經(jīng)止血、散寒止痛、祛濕止癢之功效[1]。我國(guó)大部分地區(qū)都有分布，多地有栽培，資源豐富。艾葉具有特殊氣味，上表面有稀疏柔毛和腺點(diǎn)，下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛。艾葉在我國(guó)民間有悠久的使用歷史，其大多經(jīng)曬干搗碎得“艾絨”，制成艾條供灸用。我國(guó)歷代本草記載的艾葉原植物包括艾的野生種及同屬多種近緣種[2]，同屬多種植物（代用品或易混品）在不同地區(qū)被用作艾葉或混于艾葉中。由于艾及同屬多種植物葉形變化都非常大，僅從性狀方面鑒定艾葉仍然存在一定困難。

艾葉含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)和多糖等成分[3]。揮發(fā)油含量的高低被認(rèn)為可反映艾葉品質(zhì)的優(yōu)劣[4-6]，而腺毛是揮發(fā)油合成和貯存的場(chǎng)所[7-8]，因此，揮發(fā)油的含量可能與腺毛密切相關(guān)。研究者對(duì)艾、臭蒿Ostenf. et Pauls.和黃花蒿L(fēng). 3種蒿屬植物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明揮發(fā)油含量與其葉表面腺毛密度正相關(guān)[9]。楊珂等[10]報(bào)道艾葉表面腺毛大小、飽滿(mǎn)程度等形態(tài)特點(diǎn)也與揮發(fā)油含量正相關(guān)；另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道非腺毛為高純度艾絨的主要成分[11]。可見(jiàn)，對(duì)艾葉腺毛和非腺毛的顯微特征進(jìn)行深入研究，對(duì)于艾葉及艾絨的質(zhì)量評(píng)價(jià)都有重要價(jià)值。

《中國(guó)藥典》1977～2020年版中艾葉顯微鑒定項(xiàng)內(nèi)容未發(fā)生任何改變，其所載艾葉顯微特征都包括腺毛、非腺毛和草酸鈣簇晶3項(xiàng)，并指出非腺毛有2種：一種為T(mén)形毛，另一種為單列性非腺毛，由3～5細(xì)胞構(gòu)成，頂端細(xì)胞特長(zhǎng)而扭曲，常斷落[12-19, 1]。盡管之前不乏有艾葉相關(guān)的顯微研究[20-29]；然而，由于艾葉下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛，給其顯微觀察帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)；同時(shí)，由于過(guò)去很長(zhǎng)一段時(shí)間顯微制片技術(shù)和觀察手段不夠全面，一定程度上也影響了艾葉顯微研究的進(jìn)展。值得指出的是，對(duì)于艾葉非腺毛研究，在大多文獻(xiàn)報(bào)道中并未提及單列性非腺毛[25, 27-32]，或雖提及單列性非腺毛而無(wú)可信的圖片[26, 33]。此外，當(dāng)前對(duì)于艾葉草酸鈣晶體類(lèi)型、導(dǎo)管類(lèi)型、葉表皮細(xì)胞特點(diǎn)、氣孔類(lèi)型及其分布特點(diǎn)等顯微特征仍缺少較為全面的研究。

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，顯微儀器和制片技術(shù)的不斷進(jìn)步，給中草藥深入的顯微鑒定創(chuàng)造了新的條件。本研究以艾葉為研究材料，在采用多種制片技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合光學(xué)顯微和掃描電子顯微技術(shù)對(duì)艾葉進(jìn)行顯微及組織化學(xué)研究，旨在為艾葉和艾絨的顯微鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠的參考資料。

1 儀器和材料

1.1 材料

2021年5月，分別于湖北蘄春縣、河南南陽(yáng)、河南湯陰縣、浙江寧波和河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥植物園等地采集新鮮艾葉，共計(jì)100多個(gè)批次，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蘇秀紅教授鑒定均為蒿屬植物艾Lévi. et Vant.的葉，其中來(lái)源于河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥植物園艾的原植物及不同發(fā)育時(shí)期的葉如圖1所示。

1.2 儀器與試劑

Canon EOS R6xin型數(shù)碼相機(jī)（日本佳能株式會(huì)社）；Leica RM 2016型石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），Leica CM1860型冰凍切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），Olympus SZX16型熒光體視顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Olympus BX53型正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Quorum K850型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀（英國(guó)Quorum公司）；Quorum SC7620型離子濺射鍍膜儀（英國(guó)Quorum公司）；Zeiss EVO10鎢燈絲掃描電子顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）。

A-原植物 B-不同發(fā)育時(shí)期葉的上、下表面

鹽酸、酒精、二甲苯、甲苯胺藍(lán)O、水合氯醛、氫氧化鈉、次氯酸鈉、稀甘油、FAA（70%酒精∶冰乙酸∶甲醛＝90∶5∶5）、石蠟、4-對(duì)亞硝基苯酚、濃硫酸、NADI（1%二甲基對(duì)苯二胺磷酸鹽緩沖劑溶液＋1%的α-萘酚酒精溶液1∶1等量混合），蘇丹III、蘇丹IV、二苯基硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2 方法

2.1 艾葉外觀性狀及顯微觀察

2.1.1 數(shù)碼相機(jī)拍照 使用數(shù)碼相機(jī)對(duì)艾原植物拍照，取發(fā)育程度不同的艾葉，對(duì)其上、下表面分別拍照。

2.1.2 體式顯微鏡觀察 取新鮮艾葉，用刀片將其切成8～10 mm小塊，制成水封片后，用熒光體視顯微鏡對(duì)上、下表面分別觀察并拍照。

2.1.3 熒光顯微鏡觀察 取新鮮艾葉，用清水漂洗后，切成8～10 mm小塊，制成水封片后，用熒光顯微鏡對(duì)上、下表面分別觀察并拍照。另取新鮮艾葉，用刀片輕刮下表面以除去非腺毛，然后用刀片將葉片切成8～10 mm小塊，一部分材料制成水封片后，直接用熒光顯微鏡觀察并拍照，一部分材料先用濃鹽酸浸泡5～15 min，再制成水封片后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.1.4 透明葉制片觀察 取新鮮艾葉在95%酒精中浸泡過(guò)夜以除去葉綠素，再轉(zhuǎn)入10%的氫氧化鈉中，浸泡至其變褐色后，轉(zhuǎn)入20%的次氯酸鈉中漂白至無(wú)色，然后用水合氯醛溶液透明，用稀甘油封片后，再用熒光顯微鏡在明視野下對(duì)上、下表面分別觀察并拍照。

2.1.5 石蠟切片觀察 取新鮮艾葉，在中脈中段切取8～10 mm小塊，用FAA固定24 h，采用梯度酒精（70%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片，切片厚度10～15 μm，經(jīng)0.5%的甲苯胺藍(lán)O染色，用中性樹(shù)膠封片后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.1.6 冰凍切片觀察 取新鮮艾葉，在葉柄端部取一段材料，然后在葉片中脈中段處切取8～10 mm小塊，分別用冰凍切片機(jī)切片，用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.1.7 掃描電子顯微鏡觀察 選取不同發(fā)育時(shí)期的艾葉，切成小塊，用FAA固定，采用梯度酒精（70%、85%、95%、100%）脫水，轉(zhuǎn)入乙酸異戊酯，使用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀干燥后，用導(dǎo)電膠帶將材料粘貼于樣品臺(tái)上，用離子濺射鍍膜儀鍍金后，用掃描電子顯微鏡觀察葉表面特征并拍照。

計(jì)算腺毛的長(zhǎng)度和寬度、非腺毛密度和氣孔密度等數(shù)值，隨機(jī)測(cè)20個(gè)數(shù)值，取其平均值。

2.2 組織化學(xué)分析

取新鮮艾葉，一部分材料用刀片切成8～10 mm小塊，一部分材料用冰凍切片機(jī)切片，切片厚度30～50 μm；用不同的化學(xué)試劑染色：（1）檢測(cè)單萜用4-對(duì)亞硝基苯酚[34]；（2）檢測(cè)倍半萜用濃硫酸[35-36]；（3）檢測(cè)萜類(lèi)（揮發(fā)油）用NADI[37]；（4）檢測(cè)脂類(lèi)用蘇丹III[38]、蘇丹IV[39]；（5）檢測(cè)黃酮類(lèi)用香草醛-濃鹽酸[40]、二苯基硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）[41]；染色后分別用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.3 粉末顯微觀察

艾葉制成粉末，取少量艾葉粉末，經(jīng)水合氯醛透化后，稀甘油封片，用熒光顯微鏡觀察并采用藍(lán)色或綠色濾光片以獲取清晰圖像并拍照，觀察草酸鈣晶體時(shí)在明視野或偏振光下觀察拍照。

3 結(jié)果與分析

3.1 艾葉的外觀性狀及顯微觀察

艾為多年生草本或略成半灌木狀（圖1-A），幼嫩期艾葉上表面為黃綠色（圖1-B，1的上表面），被白色絨毛，隨著葉的發(fā)育，上表面顏色逐漸變深，成熟期為深綠色（圖1-B，2-4的上表面）；從幼嫩期到成熟期，艾葉下表面始終覆蓋灰白色蛛絲狀絨毛（圖1-B，1-4的下表面）。

使用熒光體視顯微鏡觀察成熟艾葉，在藍(lán)光激發(fā)下可見(jiàn)上表面分布有黃色的腺點(diǎn)（即腺毛）和非腺毛（圖2-A）；在明視野下可見(jiàn)下表面密被灰白色蛛絲狀絨毛（圖2-B）。用熒光顯微鏡觀察成熟艾葉，在藍(lán)光激發(fā)下可見(jiàn)上表面有許多腺毛發(fā)出明亮的黃色或白色光；腺毛頂面觀呈橢圓形，腺毛的密度約（40±5）個(gè)/mm2；同時(shí)可觀察到上表面有許多 T形非腺毛發(fā)出黃綠色光，其柄較短，頂細(xì)胞長(zhǎng)梭形而彎曲，兩臂不等長(zhǎng)，臂長(zhǎng)多在300～500 μm（圖2-C）。在藍(lán)光激發(fā)下，下表面的腺毛和非腺毛也分別發(fā)出明亮的黃色（或白色）和黃綠色光，其中在葉脈處的T形非腺毛最為清晰，其柄較短，而頂細(xì)胞比上表面的長(zhǎng)，臂長(zhǎng)多在500～800 μm，這種頂細(xì)胞較長(zhǎng)的T形非腺毛在葉脈間也有稀疏分布（圖2-D）。上述上、下表面的這種T形非腺毛，其頂細(xì)胞都為長(zhǎng)梭形彎曲，兩臂不等長(zhǎng)，本文將其稱(chēng)為I型T形非腺毛。

艾葉下表面葉脈間密集分布有蛛絲狀的非腺毛，下表面的腺毛通常為其覆蓋，因此用體視顯微鏡在明視野下觀察難以被發(fā)現(xiàn)（圖2-B），而在熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下由于這些腺毛能發(fā)出明亮的黃色或白色光，因而可清晰觀察到（圖2-D），下表面的腺毛密度顯著低于上表面（圖2-C）。用熒光顯微鏡在紫外光激發(fā)下，可觀察到上表面的T形非腺毛（I型）柄由2～5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，柄或柄脫落后留下的脫落痕都均可發(fā)出明亮的藍(lán)色光（圖2-E）。上、下表面腺毛大小并無(wú)明顯區(qū)別，長(zhǎng)度都約為（56±4）μm，寬度約（45±3）μm，頂面觀都呈橢圓形（圖2-F）。

A, B-熒光體視顯微鏡下葉表面觀察：A為上表面（藍(lán)光激發(fā)），B為下表面（明視野） C, D-熒光顯微鏡下葉表面觀察（藍(lán)光激發(fā)）：C為上表面 D為下表面（白箭頭示I型T形非腺毛） E-上表面（白箭頭示I型T形非腺毛的柄，紅箭頭示其柄脫落留下的脫落痕，橢圓形藍(lán)斑為腺毛） F-腺毛（藍(lán)光激發(fā)）

用熒光顯微鏡在20倍物鏡下，用藍(lán)光激發(fā)，可觀察到艾葉下表面葉脈間的T形非腺毛發(fā)出黃色光，柄尤為顯著，其頂細(xì)胞由此向兩側(cè)逐漸變細(xì)（圖3-A）；而在紫外光激發(fā)下，T形非腺毛發(fā)出藍(lán)色光，柄最為顯著，其頂細(xì)胞極為細(xì)長(zhǎng)、扁平而扭曲，細(xì)胞壁薄，為另一種T形非腺毛（圖3-B），本研究稱(chēng)其為II型T形非腺毛。用刀片刮去艾葉下表面的非腺毛，紫外光激發(fā)并在10倍物鏡下觀察，下表面的I型和II型T形非腺毛柄的脫落痕或殘余柄都呈現(xiàn)為藍(lán)色“斑點(diǎn)”，而腺毛呈現(xiàn)為橢圓形“黑斑”，因此可以清晰觀察到腺毛和非腺毛的分布并方便計(jì)數(shù)，成熟艾葉下表面腺毛的密度約（21±3）個(gè)/mm2，T形非腺毛（含I型和II型）密度達(dá)到（146±10）個(gè)/mm2（圖3-C），透明葉制片在紫外光激發(fā)下觀察，發(fā)現(xiàn)柄一般由2～5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成（圖3-D）。

A-藍(lán)光激發(fā)下觀察到的II型T形非腺毛（白箭頭示柄）和腺毛（紅箭頭） B-紫外光激發(fā)下觀察到的II型T形非腺毛（白箭頭示柄） C-下表面去除T形非腺毛后紫外光激發(fā)觀察（白箭頭示T形非腺毛柄的脫落痕或殘余柄，黑斑處為腺毛） D-下表面紫外光激發(fā)下觀察（紅箭頭示T形非腺毛的柄，白箭頭示腺毛）

觀察成熟艾葉橫切面，可見(jiàn)上表面T形非腺毛（I型）柄由2～5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，頂細(xì)胞長(zhǎng)梭形而彎曲，兩臂不等長(zhǎng)；下表面 T形非腺毛（II型）頂細(xì)胞極為細(xì)長(zhǎng)而扭曲，在橫切制片中易被切斷，因而難以觀察到完整的頂細(xì)胞，其柄也多由2～5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成（圖4-A）。艾葉上、表皮都由單層細(xì)胞構(gòu)成，上表皮細(xì)胞明顯比下表皮細(xì)胞厚，腺毛位于上、下表面的凹陷處；艾葉為異面葉，柵欄組織由一層細(xì)胞構(gòu)成，海綿組織細(xì)胞排列疏松（圖4-B），其中分布有大小不等的草酸鈣簇晶（圖4-C）。

艾葉在幼嫩期（圖1-B的1），即可觀察到其腺毛已由2列細(xì)胞構(gòu)成，其中腺毛基部由2個(gè)較小的細(xì)胞構(gòu)成，柄部（由2細(xì)胞構(gòu)成）和頭部（3層6細(xì)胞或2層4細(xì)胞構(gòu)成）細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃，染色重，此時(shí)腺毛體積較小，尚未產(chǎn)生分泌物（圖4-D）。腺毛發(fā)育成熟時(shí)，頭部的細(xì)胞（4或6個(gè)）被共同的角質(zhì)層包圍，分泌物儲(chǔ)存在角質(zhì)層和細(xì)胞壁之間的間隙（即角質(zhì)層下間隙）中，成熟腺毛柄部較短，由兩個(gè)較小細(xì)胞構(gòu)成，基部由兩個(gè)更小的細(xì)胞構(gòu)成（圖4-E）。艾葉上表面氣孔稀少，分布不均勻，下表面氣孔較多，氣孔密度高達(dá)（300±25）個(gè)/mm2，氣孔都呈橢圓形，為不定式，氣孔周?chē)?～5個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞，氣孔長(zhǎng)軸長(zhǎng)（26±4）μm，短軸長(zhǎng)（20±2）μm，成熟艾葉上、下表面的表皮細(xì)胞形狀均為無(wú)規(guī)則形，垂周壁式樣均為波狀彎曲（圖4-F，G）。上、下表面T形非腺毛（含I型和II型）自柄完全脫落后均留下圓形的脫落痕，脫落痕一般位于表皮細(xì)胞的近中央位置，也有少數(shù)位于兩個(gè)表皮細(xì)胞的交界處，脫落痕直徑（10±1）μm（圖4-H）。腺毛的頂面觀呈橢圓形（圖4-G），其基部呈近圓形，直徑（15±2）μm，由2個(gè)細(xì)胞構(gòu)成（圖4-H、I）。

掃描電鏡觀察到艾葉在幼嫩期（圖1-B的1）上表面密被I型T形非腺毛（圖5-A），下表面葉脈密集，葉脈上密被I型T形非腺毛，葉脈間I型T形非腺毛也較多，覆蓋其下方未發(fā)育成熟的II型T形非腺毛（圖5-B）。葉片成熟時(shí)，上表面的I型T非腺毛隨著葉片發(fā)育成熟而變得稀疏，腺毛頂面觀為橢圓形（圖5-C）。成熟艾葉下表面的葉脈間密被II型T形非腺毛，I型T形非腺毛則變得稀疏，但是仍位于II型T形非腺毛上方，由于II型T形非腺毛非常密集，頂細(xì)胞極長(zhǎng)又相互交錯(cuò)盤(pán)結(jié)，覆蓋了絕大多數(shù)腺毛，只在少數(shù)地方可以觀察到露出的腺毛（圖5-D）。

在艾葉的幼嫩期（圖1-B的1），可以觀察到腺毛已形成頭部的各層細(xì)胞（圖6-A）。隨著葉的生長(zhǎng)，腺毛體積有所增大，最頂端兩細(xì)胞界限明顯，中間有明顯縊縮（圖6-B），后來(lái)腺毛明顯膨大，開(kāi)始具分泌作用，分泌物貯存在角質(zhì)層下間隙中，位于頂部?jī)杉?xì)胞界限處角質(zhì)層上有時(shí)可見(jiàn)小裂孔，但未見(jiàn)分泌物溢出（圖6-C），當(dāng)腺毛完全發(fā)育成熟時(shí)，在角質(zhì)層下間隙中充滿(mǎn)分泌物，腺毛體積達(dá)到最大，頂面觀呈現(xiàn)橢圓形（圖6-D），角質(zhì)層破裂后可以看到腺毛最頂端的兩個(gè)細(xì)胞（圖6-E）。

A-橫切觀察（黑箭頭和紅箭頭分別示I型和II型T形非腺毛） B-橫切制片高倍物鏡下觀察 C-橫切制片觀察到葉肉細(xì)胞中的草酸鈣簇晶（白箭頭） D-未具分泌功能的腺毛（白箭頭示基部） E-成熟具分泌功能的腺毛（白箭頭和紅箭頭分別示基部和柄部） F-上表面的氣孔和表皮細(xì)胞（白箭頭示I型T形非腺毛的柄） G-下表面的氣孔（白箭頭和紅箭頭分別示腺毛和T形非腺毛的脫落痕） H-上表面（白箭頭和紅箭頭分別示腺毛的基部和T形非腺毛的脫落痕） I-上表面腺毛的基部放大觀察（白箭頭）

A-幼嫩葉上表面（白箭示頭腺毛，紅箭頭示I型T形非腺毛） B-幼嫩葉下表面（白箭頭示I型T形非腺毛） C-成熟葉上表面 D-成熟葉下表面（白箭頭腺毛，紅箭頭示I型T形非腺毛）

A-幼嫩葉上表面的腺毛（白箭頭） B-未具分泌功能的腺毛（白箭頭示T形非腺毛的柄） C-具有分泌功能的腺毛（白箭頭示裂孔） D-充滿(mǎn)分泌物的成熟腺毛（白箭頭示裂孔） E-角質(zhì)層破裂后的腺毛（白箭頭示頂部?jī)杉?xì)胞間的界限） F-上表面的I型T形非腺毛 G-下表面（白箭頭示II型T形非腺毛的柄，紅箭頭示腺毛） H-下表面上的II型T形非腺毛（白箭頭示柄） I-下表面上T形非腺毛的脫落痕（白箭頭） J-下表面上的氣孔（白箭頭）

艾葉樣品前期處理良好時(shí)，可以觀察到I型T形非腺毛的柄和頂細(xì)胞都形態(tài)飽滿(mǎn)、表面光滑（圖6-F）。下表面的II型T形非腺毛頂細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)、扁平且扭曲、兩臂向兩側(cè)延伸并逐漸變細(xì)（圖6-G），柄由2～5個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，少數(shù)柄的下端細(xì)胞膨大（圖6-H），艾葉的兩種T形非腺毛的柄脫落后在表皮細(xì)胞上都會(huì)留下圓形的脫落痕（圖6-I）。艾葉上表面氣孔稀少，下表面氣孔密集，這些氣孔的2個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞都略高出表面，外拱蓋光滑，氣孔周?chē)?～5個(gè)表皮細(xì)胞，為不定式氣孔（圖6-J）。

葉柄橫切制片可觀察到5～7個(gè)大小不等的外韌維管束，中間的最大；韌皮纖維和木纖維被甲苯胺藍(lán)O染成深藍(lán)色（圖7-A）。葉柄上分布I型T形非腺毛和少量的腺毛，I型T形非腺毛頂細(xì)胞長(zhǎng)度較短，臂長(zhǎng)小于300 μm。葉柄表皮由一層細(xì)胞構(gòu)成，表皮細(xì)胞下有一些厚角組織細(xì)胞（圖7-B），而葉的中脈只有一個(gè)外韌維管束（圖7-C）。葉柄中的一些薄壁細(xì)胞中分布有草酸鈣簇晶，最大可達(dá)40 μm，還有少量的草酸鈣方晶（圖7-D），在中脈橫切片中也發(fā)現(xiàn)有較大的草酸鈣簇晶，偏振光下觀察非常顯著（圖7-E）。對(duì)葉柄和中脈縱切制片觀察發(fā)現(xiàn)韌皮纖維的細(xì)胞壁較厚，有明顯的單紋孔（圖7-F），葉柄和中脈中有梯紋（圖7-G）、網(wǎng)紋（圖7-H）、孔紋和螺紋導(dǎo)管（圖7-I）。

3.2 組織化學(xué)分析

組織化學(xué)研究顯示：4-對(duì)亞硝基苯酚處理艾葉后，腺毛顯示棕紅色（圖8-A），表明存在單萜類(lèi)物質(zhì)；濃硫酸染色處理后，腺毛顯示黃色（圖8-B），表明存在倍半萜類(lèi)物質(zhì)；NADI處理腺毛后，顯示藍(lán)色（圖8-C），表明有萜類(lèi)物質(zhì)存在；蘇丹IV處理后，腺毛顯示紅色（圖8-D），表明有脂類(lèi)物質(zhì)存在；香草醛-濃鹽酸處理后，腺毛顯示紅色（圖8-E），經(jīng)過(guò)DPBA處理后藍(lán)光激發(fā)后腺毛發(fā)出黃色熒光（圖8-F），表明有黃酮類(lèi)物質(zhì)存在。

3.3 粉末顯微觀察

艾葉粉末顏色為綠褐色。腺毛頂面觀為橢圓形，可見(jiàn)頭部最頂端細(xì)胞的2細(xì)胞相對(duì)而生（圖9-A），腺毛側(cè)面觀也呈橢圓形，由4或6細(xì)胞（更常見(jiàn)）相對(duì)疊合而成，腺毛柄部常脫落（圖9-B）。非腺毛均為T(mén)形，柄由2～5細(xì)胞構(gòu)成，常部分或全部脫落，頂細(xì)胞有兩種類(lèi)型：一種頂細(xì)胞長(zhǎng)梭形彎曲，細(xì)胞腔狹小，表面較光滑，兩臂不等長(zhǎng)（I型T形非腺毛，圖9-C）；另一種頂細(xì)胞兩臂呈細(xì)絲狀極長(zhǎng)、扁平且扭曲（II型T形非腺毛），柄易脫落，常見(jiàn)長(zhǎng)而扁平、扭曲的頂細(xì)胞部分（圖9-D）。成熟艾葉上、下表皮細(xì)胞垂周壁均為波狀彎曲（圖9-E，F(xiàn)）。上表面氣孔稀少，下表面氣孔多，氣孔類(lèi)型為不定式（圖9-F）。螺紋導(dǎo)管最為常見(jiàn)（圖9-G），偶見(jiàn)環(huán)紋、梯紋、網(wǎng)紋和孔紋導(dǎo)管。常見(jiàn)草酸鈣簇晶，直徑在3～40 μm（圖9-H），偶見(jiàn)方晶（圖9-I）。

A-葉柄的橫切（黑箭頭示韌皮纖維，紅箭頭示木纖維） B-葉柄中的厚角組織 C-中脈橫切（黑箭頭示韌皮部，紅箭頭示木質(zhì)部） D-葉柄薄壁細(xì)胞中的草酸鈣方晶（黑箭頭） E-中脈薄壁細(xì)胞中的草酸鈣簇晶（偏振光下） F-葉柄中的韌皮纖維（黑箭頭） G-葉柄中的梯紋導(dǎo)管（黑箭頭） H-葉柄中的網(wǎng)紋導(dǎo)管（黑箭頭） I-中脈中的螺紋導(dǎo)管（紅箭頭）和孔紋導(dǎo)管（黑箭頭）

A-4-對(duì)亞硝基苯酚染色 B-濃硫酸處理 C-NADI染色 D-蘇丹Ⅳ染色 E-香草醛-濃鹽酸處理 F-DPBA處理

4 討論

熒光顯微鏡下可觀察到艾葉的上、下表面都分布有大小、形態(tài)及結(jié)構(gòu)相同的腺毛，上表面的腺毛密度顯著高于下表面。艾葉腺毛的柄部和基部都由2個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，其頭部由2層4個(gè)或3層6個(gè)細(xì)胞構(gòu)成，被共同的角質(zhì)層包圍，角質(zhì)層下的間隙可以積累大量的分泌物。艾葉腺毛頂面觀呈橢圓形，腺毛柄部較短，為短柄的頭狀腺毛。由于艾葉短柄的頭狀腺毛生長(zhǎng)于葉表面凹陷處，掃描電鏡下觀察到腺毛的頂面觀往往只看到其最頂端的細(xì)胞。在艾葉粉末中，腺毛的柄部常脫落，只留下頭部，頂面觀呈橢圓形，側(cè)面觀可看到頭部的6（更常見(jiàn)）或4個(gè)細(xì)胞，并可觀察到角質(zhì)層下間隙充滿(mǎn)分泌物。艾葉的腺毛類(lèi)型和黃花蒿[42]的腺毛特點(diǎn)相同，都為2列性。最近Cui等[27-28]研究指出艾葉腺毛除了2列性（10細(xì)胞，其中頭部6細(xì)胞，柄部和基部各2個(gè)細(xì)胞）腺毛外，還存在單列性（5細(xì)胞）腺毛，而其他關(guān)于包括艾Lévi. et Vant.、野艾蒿Candolle、五月艾Willd.等蒿屬植物的研究均未發(fā)現(xiàn)單列性腺毛[20-26]。本研究采用多種顯微手段觀察證實(shí)艾葉不存在單列性腺毛，并認(rèn)為CUI等所述單列性（5細(xì)胞）腺毛是由于2列性（10細(xì)胞）腺毛在與其頂面觀長(zhǎng)軸垂直方向進(jìn)行切片所致，由于制片原因造成的假象在顯微研究中是較為常見(jiàn)的。1977至2020年，各版《中國(guó)藥典》中艾葉腺毛的頂面觀均被描述成“鞋底狀”[1,12-19]，是對(duì)頭部最頂端對(duì)疊而生的2個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞壁輪廓而言，筆者認(rèn)為腺毛頭部角質(zhì)層下間隙中的分泌物也是腺毛不可分割的重要組成部分，在粉末觀察中，腺毛的柄部較短，又常脫落，頂面觀和側(cè)面觀均呈橢圓形，因此，腺毛的頂面觀和側(cè)面觀都描述為橢圓形比較合適。

A-腺毛的頂面觀 B-腺毛的側(cè)面觀 C-I型T形非腺毛 D-II型T形非腺毛（白箭頭和紅箭頭分別示柄和頂細(xì)胞上柄的脫落痕） E-上表皮 F-下表皮 G-螺紋導(dǎo)管 H-草酸鈣簇晶 I-偏振光下的草酸鈣方晶

A-top view of glandular trichome B-side view of glandular trichome C-Type I T-shaped non- glandular trichome D-Type II T-shaped non- glandular trichome( (white arrow head and red arrow head show the handle and handle's abscission mark on the apical cell respectively ) E-upper epidermis

F-lower epidermis G-spiral vessel H-calcium oxalate cluster crystal I-calcium oxalate square crystal under polarized light

圖9 艾葉粉末顯微特征圖（均放大400×）

Fig. 9 Microscopic features ofpowder(400× for all)

艾葉葉柄，以及上、下表面葉脈處的非腺毛都為I型T形非腺毛（下表面的葉脈間也分布有少量），頂細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形而彎曲、表面光滑、兩臂不等長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)與1977年以來(lái)各版《中國(guó)藥典》描述的T形非腺毛形態(tài)學(xué)特征基本相同。然而，艾葉下表面葉脈間除了少量的I型T形非腺毛外，更多的是大量密集分布的II型T形非腺毛。II型T形非腺毛最顯著的特點(diǎn)在于：頂細(xì)胞極長(zhǎng)、扁平且扭曲，且這些II型T形非腺毛的頂細(xì)胞相互纏繞。和上表面的I型T形非腺毛的密度（32±5）個(gè)/mm2相比，下表面II型T形非腺毛的密度高達(dá)（146±10）個(gè)/mm2，加上其頂細(xì)胞臂極細(xì)長(zhǎng)，因此就有“上表面有稀疏柔毛”、“下表面密被灰白色絨毛”[1]的性狀。

《中國(guó)藥典》2020年版載艾葉：“另一種為單列性非腺毛，3～5細(xì)胞，頂端細(xì)胞特長(zhǎng)而扭曲，常斷落”[1]。然而，徐國(guó)鈞院士等編撰的《中藥材粉末顯微鑒定》描述艾葉：“T形毛，常纏結(jié)。頂細(xì)胞橫生，大多極細(xì)長(zhǎng)而扭曲……，胞腔線(xiàn)形或不明顯”[43]。其并未發(fā)現(xiàn)有“單列性非腺毛”，與歷版《中國(guó)藥典》不一致。1988年，劉訓(xùn)紅等[27]研究認(rèn)為艾葉的非腺毛都為T(mén)形，其并根據(jù)頂細(xì)胞特點(diǎn)將T形非腺毛分為2種，一種頂端細(xì)胞長(zhǎng)而彎曲，兩臂不等長(zhǎng)；另一種頂端細(xì)胞特長(zhǎng)而扭曲（密布于下表皮）。同樣也并未提及“單列性非腺毛”。宋平順等[44]對(duì)艾、野艾蒿等12種蒿屬植物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這些植物的葉表面均分布有腺毛和T形非腺毛，而未發(fā)現(xiàn)存在“單列性非腺毛”，并明確指出艾葉T形非腺毛頂細(xì)胞存在兩種情況：“細(xì)胞壁厚、略彎曲、或細(xì)胞壁薄而成纏繞狀”，這一結(jié)論也與本研究結(jié)果十分相近。顯然，徐國(guó)鈞院士提到的“大多極細(xì)長(zhǎng)而扭曲”的非腺毛就是本研究中的II型T形非腺毛，而“胞腔線(xiàn)形或不明顯”則為I型T形非腺毛頂細(xì)胞的特點(diǎn)；其與本研究描述的區(qū)別在于：前者將T形非腺毛的特征作了簡(jiǎn)化而一并描述之；而本研究依據(jù)T形非腺毛頂細(xì)胞特點(diǎn)直接將其分為2類(lèi)，更加清晰、不易引起誤讀。需要特別指出的是：前期對(duì)1000多個(gè)批次的艾葉樣品進(jìn)行研究，從未發(fā)現(xiàn)頂端細(xì)胞特長(zhǎng)而扭曲的“單列性非腺毛”。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)粉末中II型T形非腺毛的柄易脫落，留下長(zhǎng)而扁平、扭曲的頂細(xì)胞。仔細(xì)分析，不難發(fā)現(xiàn)：粉末中柄脫落的II型T形非腺毛就是現(xiàn)版《中國(guó)藥典》所載具有“3～5細(xì)胞，頂端細(xì)胞特長(zhǎng)而扭曲，常斷落”特點(diǎn)的所謂“單列性非腺毛”。

顯微鑒定是中藥基原鑒定的重要依據(jù)，對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)也有重要意義。艾葉顯微特征的深入研究對(duì)于艾葉和艾絨的真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評(píng)價(jià)都具有重要參考價(jià)值，也為下一版《中國(guó)藥典》艾葉顯微鑒定相關(guān)內(nèi)容的修訂和完善提供了參考資料。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Microscopic identification and histochemical study of glandular trichomes inleaves

Liu Meng-qi1, Hui Cheng-cheng1, Chen Sui-qing1, Guo Tao1,2, Wang Hai-bo3, XIN Hai-liang2,4

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Zhongjing Chinese Medicine Industry Research Institute,Nanyang 473001, China 3. NMPA Key Laboratory for Quality Control of Traditional Chinese Medicine, Henan Institute for Food and Drug Control, Zhengzhou 450018, China 4. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To provide reliable reference for microscopic identification and quality evaluation ofleaves and moxa floss.The microstructure and histochemistry ofwere studied by fluorescence microscope and scanning electron microscope.Glandular trichomes and non- glandular trichomes were distributed on the upper and lower surfaces of. The glandular trichome was composed of two rows of cells, with four or six cells overlapping each other at the head, two cells at the stalk and two cells at the base. Non- glandular trichomes are characteristic of T shape, and their stalk was composed of 2－5 cells. According to the characteristics of apical cells, the T- shaped non- glandular trichomes can be divided into two types: One was apical cells with long spindle and curved shape (type I), and the other was filamentous, extremely long, flat, and twisted (type II). Calcium oxalate cluster crystals with diameters ranging from 3 to 40 μm were found mostly in mesophyll cells. There were few stomata on the upper surface and many stomata on the lower surface, and the stomata were amorphous. The vertical walls of upper and lower epidermal cells were wavy and curved. The spiral vessel was often found. While the scalariform, reticulate and pitted vessel are occasionally found. The results of histochemical study showed that glandular trichomes contained volatile oil, terpenoids, flavonoids and other components.The results of this study provide an important reference for the revision and improvement of the microscopic identification ofin the next edition of.

Lévi. et Vant.; microscopic identification; glandular trichomes; non-glandular trichomes; histochemistry

R286

A

0253 - 2670(2022)23 - 7532 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.025

2022-06-06

教育部產(chǎn)學(xué)研合作協(xié)同育人項(xiàng)目（202102294010）；河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目（222102310110）；科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專(zhuān)項(xiàng)子課題（2018FY100802-03）

劉孟奇（1971—），男，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定。E-mail: 2009liumq@163.com

通信作者：郭 濤（1976—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴庤b定與質(zhì)量控制。E-mail: gt010010@163.com

辛海量（1976—），男，教授，研究方向?yàn)橹兴庤b定、質(zhì)量評(píng)價(jià)及中藥藥理。E-mail: hailiangxin@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]