李 濤，陳 廣，溫貴蘭，劉蔓蔓，張小波，曾熙雯

(1.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025 ；3. 貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550016)

緩慢葡萄球菌(Staphylococcuslentus)屬于微球菌科、葡萄球菌屬，是一種凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negativeStaphylococci,CNS)，最早由Kloos等[1]命名。目前，緩慢葡萄球菌使動(dòng)物致病的報(bào)道越來越多[2-6]，但關(guān)于禽源緩慢葡萄球菌的報(bào)道較為罕見。2019年12月，貴州省某養(yǎng)殖場(chǎng)麻黃雞出現(xiàn)死亡，病雞臨床癥狀表現(xiàn)為面部腫脹，剖檢主要病變?yōu)樾呐K纖維素性滲出、心包積液等。本試驗(yàn)從病雞中分離出1株革蘭陽性球菌，經(jīng)病原形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)和16S rRNA鑒定為緩慢葡萄球菌，并對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、耐藥基因檢測(cè)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)，為臨床禽類防控緩慢葡萄球菌病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及試驗(yàn)動(dòng)物 2只患病麻黃雞源自貴州某養(yǎng)殖場(chǎng)；16只SPF級(jí)昆明小鼠，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；16只1日齡麻黃雞，購自貴州大學(xué)科研雞場(chǎng)。

1.2 主要試劑 固體瓊脂培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染料、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；2×EsTaqDNA聚合酶，購自康為世紀(jì)有限公司；DL-2 000 Marker、DL-5 000 Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照參考文獻(xiàn)[7-10]合成細(xì)菌16S rRNA引物和耐藥基因引物，檢測(cè)的耐藥基因包括大環(huán)內(nèi)酯類erm(B)、erm(C)，喹諾酮類oqx(A)，四環(huán)素類tet(B)，磺胺類sul1，β-內(nèi)酰胺類blaTEM、blaVIM。引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察 無菌環(huán)境下取病雞的肝臟、心臟、眶下窩和腹腔積液在鮮血瓊脂平板上進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，將血平板分成2個(gè)組，分別置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h和37 ℃燭缸培養(yǎng)12 h。染色鏡檢后進(jìn)行純化，純化后取單個(gè)菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。

1.5 生化試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)后的單菌落接種于16種常見生化管(表2)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后記錄結(jié)果。血漿凝固酶試驗(yàn)：在2塊玻片上均加100 μL的新鮮兔血漿，然后分別加入等量的待測(cè)菌液和PBS，混合1 min后記錄結(jié)果。

1.6 16S rRNA序列分析 使用1.3中16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.7 藥敏試驗(yàn) 挑取分離純化后單菌落于37 ℃搖菌12～16 h，取100 μL菌液用無菌涂布棒均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基中，用紙片法將藥敏紙片緊貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄藥敏紙片的抑菌圈直徑，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (CLSI 2016) 抗微生物藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分離菌藥物敏感性判斷。

1.8 耐藥基因檢測(cè) 使用1.3中合成的耐藥基因引物對(duì)分離菌進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 挑取純化后的單菌落搖菌24 h，使用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算出原始菌液中所含菌落總數(shù)為5.8×108CFU/mL。將小鼠分為4個(gè)組，每組4只，將菌液用滅菌PBS稀釋成5.8×108、5.8×107CFU/mL和5.8×106CFU/mL，分別注射于3個(gè)試驗(yàn)組的小鼠，每只腹腔注射0.5 mL菌液，對(duì)照組腹腔注射等體積的滅菌PBS。連續(xù)觀察7 d，記錄對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠情況。雛雞致病性試驗(yàn)同小鼠致病性試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離純化及形態(tài)觀察 從病雞內(nèi)臟分離到形態(tài)均一菌落，且需氧培養(yǎng)比厭氧培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)好，鮮血瓊脂平板上可見乳白色、表面凸起、邊緣整齊的菌落。革蘭染色鏡檢可見葡萄串狀的球菌，將分離菌株命名為GZSL20191203。

2.2 生化試驗(yàn) GZSL20191203尿素等12種反應(yīng)陽性，木糖醇等4種反應(yīng)陰性，血漿凝固酶試驗(yàn)陰性，結(jié)果如表2所示。

表2 GZSL20191203生化試驗(yàn)

2.3 16S rRNA序列分析 對(duì)分離菌進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，結(jié)果在1 450 bp左右出現(xiàn)條帶(圖1)。經(jīng)測(cè)序獲得大小為1 439 bp的序列，將序列與GenBank下載的參考菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GZSL20191203與下載的6株緩慢葡萄球菌的16S rRNA同源性均≥99.8%，與黑龍江分離株CICCHLJ Q29親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，為99.8%，與伊朗分離株HM17親緣關(guān)系較近，為100%(圖2)。用生物學(xué)軟件Megalign對(duì)測(cè)序所得16S rRNA序列繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示GZSL20191203與緩慢葡萄球菌處于同一分支(圖3)。

圖1 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

圖2 GZSL20191203 16S rRNA基因序列核苷酸同源性分析

圖3 GZSL20191203 16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 藥敏試驗(yàn) 選取28種藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，GZSL20191203對(duì)羧芐西林等21種抗菌藥耐藥，對(duì)頭孢氨芐等5種抗菌藥中度敏感，對(duì)頭孢哌酮和頭孢唑啉敏感(表3)。結(jié)果表明GZSL20191203耐藥性較高。

表3 GZSL20191203藥敏試驗(yàn)

續(xù)表

2.5 耐藥基因檢測(cè) GZSL20191203耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果見圖4，大環(huán)內(nèi)酯類erm(B)、erm(C),β-內(nèi)酰胺類blaVIM、blaTEM,四環(huán)素類tet(B),磺胺類sul1耐藥基因呈陽性。

圖4 GZSL20191203耐藥基因的PCR擴(kuò)增

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 攻毒12 h后試驗(yàn)組小鼠精神沉郁、呆立不動(dòng)、畏寒、腹式呼吸，這與蘇接瑜等[5]緩慢葡萄球菌小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果一致，而對(duì)照組小鼠精神相對(duì)較好；之后試驗(yàn)組小鼠精神逐漸好轉(zhuǎn)，攻毒后7 d，精神恢復(fù)正常。雛雞按同樣方法同等劑量腹腔接種緩慢葡萄球菌，同樣觀察7 d，試驗(yàn)組雛雞也未發(fā)生死亡。但試驗(yàn)組雛雞生長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照組相比體重差異明顯，其中5.8×108CFU/mL接種量的雛雞差異最為明顯。結(jié)果表明GZSL20191203正常情況對(duì)小鼠和雛雞無致病性。

3 討論

目前，CSN被認(rèn)為與人類和動(dòng)物各種機(jī)會(huì)性感染有關(guān)[11]。緩慢葡萄球菌作為CSN的一種，隨著致病的報(bào)道增多而備受關(guān)注。2010—2019年，先后報(bào)道了緩慢葡萄球菌致倉鼠[3]、豬[4]、眼鏡蛇[5]、水貂[6]發(fā)病。但雞感染緩慢葡萄球菌的報(bào)道罕見，本試驗(yàn)從病雞的心臟、肝臟、腎臟、眶下窩和腹腔積液分離到緩慢葡萄球菌，證實(shí)病雞確有緩慢葡萄球菌感染。Wos-Oxley等[12]發(fā)現(xiàn)，人的前鼻孔經(jīng)常被凝固酶陰性葡萄球菌定殖，眼結(jié)膜表面也常常被CNS定殖[13-14]。本試驗(yàn)中病雞頭面部腫脹也與緩慢葡萄球菌定殖于動(dòng)物眼結(jié)膜和鼻孔有關(guān)。

GZSL20191203對(duì)紅霉素等耐藥，能檢測(cè)到erm(B)等耐藥基因。雖然大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類藥敏試驗(yàn)與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果一致；但喹諾酮類藥敏試驗(yàn)與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果不同，說明耐藥表型與耐藥基因型沒有嚴(yán)格的一一對(duì)應(yīng)的聯(lián)系。這可能與基因的表達(dá)狀態(tài)以及在抗菌藥的選擇壓力下細(xì)菌產(chǎn)生抗性機(jī)制的多樣性等多種因素有關(guān)[15]。魏文娟等[16]研究也表明，一些耐藥菌株不攜帶耐藥基因可能是因?yàn)榇嬖谄渌退帣C(jī)制。已有文獻(xiàn)表明，葡萄球菌可以共享許多抗藥性基因[17-18]，因此GZSL20191203攜帶的耐藥基因可能會(huì)在環(huán)境中擴(kuò)散，造成其他物種耐藥性增加。細(xì)菌耐藥機(jī)制有很多，包括耐藥基因和整合子介導(dǎo)的耐藥機(jī)制[19]，GZSL20191203檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaVIM，說明該菌株能夠使β-內(nèi)酰胺類抗菌藥失活或產(chǎn)生低親和力而耐藥。Bhargava等[20]從牛、山羊、綿羊、豬和雞分離的緩慢葡萄球菌中檢測(cè)出大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm(A)、erm(B)、erm(C)，GZSL20191203也與此相符。這些研究都表明緩慢葡萄球菌有較高的耐藥性，并且可以作為貯存庫傳播給其他葡萄球菌，使得其他葡萄球菌耐藥性升高。本試驗(yàn)成功分離到1株緩慢葡萄球菌，并對(duì)其進(jìn)行耐藥基因PCR檢測(cè)、小鼠和雛雞致病性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離株GZSL20191203是1株多重耐藥的條件致病性緩慢葡萄球菌。