武振帥,紀(jì)鵬,魏彥明,徐譽(yù)彰,張曉松,武凡琳,任建明,李琛琛,華永麗,姚萬玲,袁子文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070)

畜禽肺炎發(fā)病率高、發(fā)病急且病死率高,嚴(yán)重危害養(yǎng)殖效益。如多殺性巴氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核桿菌等?？梢馉倥７窝譡1];鏈球菌、肺炎球菌、葡萄球菌等都可引起羊肺炎,對羊只剖檢發(fā)現(xiàn)其肺部有發(fā)炎及質(zhì)變的跡象[2]。脂多糖(LPS),又名內(nèi)毒素,是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜中的主要成分,當(dāng)濃度升高時(shí)會引發(fā)強(qiáng)烈炎癥反應(yīng),其在動物體內(nèi)可以誘發(fā)炎性細(xì)胞浸潤,TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的釋放[3],引起的炎癥機(jī)理與革蘭氏陰性菌感染相似,故采用LPS 建立急性肺炎動物模型屬于經(jīng)典方法之一[4]?？赏ㄟ^建立小鼠急性肺炎模型來篩選防治藥物。急性肺炎所致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是心肺功能衰竭、氧化應(yīng)激、急性炎癥性疾病等多種因素引起的一種嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病,可引起嚴(yán)重臨床并發(fā)癥和高死亡率,并可導(dǎo)致呼吸窘迫綜合征[5-7]。肺表面活性物質(zhì) (pulmonary surfactant,PS)是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelium cell Ⅱ,AECⅡ)分泌的一種脂蛋白,主要含有4 種蛋白,但只有表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(surfactant-associated protein C,SFTPC)是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)的活性蛋白[8]。阮玲瑛等[9]研究表明Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞與許多肺部疾病的發(fā)生及病理過程有關(guān)。中藥黃芩,是唇形科植物黃芩的干燥根[10],具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效,常用于治療肺熱咳嗽、黃疸等[11],其主要活性成分為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等。連翹為木犀科植物,具有清熱解毒、散結(jié)消腫、疏散風(fēng)熱功效,常用于治療肺炎、痢疾和瘡瘍等[12-13],其主要活性成分為連翹苷、連翹脂素、木犀草素與牛蒡子苷元等。黃芩和連翹配伍,遵循了中藥藥對相須為用的原則,是中(獸)醫(yī)臨床上防治溫?zé)岵〉某Ｓ盟帉χ籟14]。因此,本研究主要分析了黃芩-連翹不同配伍比例對小鼠急性肺炎的保護(hù)效果差異,旨在篩選出防治急性肺炎效果確切的最佳配伍比例,為后期開發(fā)畜禽肺炎防治藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

144 只4 周齡SPF 級雄性KM 小鼠,體重18～22 g,購自蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(甘)2020-0002】,飼養(yǎng)場地為甘肅省動物疾病防治藥物創(chuàng)制工程研究中心實(shí)驗(yàn)動物房【SYXK(甘)2019-0002】,12 h 光照,12 h 黑暗周期循環(huán),自由飲食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)獲得甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(GSAU-Eth-VMC-2021-013)。在小鼠飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中已做到按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R 原則給予人道主義的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器

黃芩、連翹飲片購自甘肅省蘭州市黃河藥材市場,經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)教研室魏彥明教授鑒定;地塞米松(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司,國藥準(zhǔn)字H44024469);LPS(索萊寶);TNF-α 試劑盒(上海酶聯(lián),貨號:ml002095)、IL-1β 試劑盒(上海酶聯(lián),貨號:ml063132)和IL-6 試劑盒(上海酶聯(lián),貨號:ml002293)、Rabbit Anti-SFTPC Polyclonal Antibody (bs-10067R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司、SFTPC Polyclonal Antibody 購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司等。

YP502N 電子天平(上海天美天平儀器有限公司);血常規(guī)分析儀(Boule Medical AB 公司);Olympus DP-71 顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus 公司);石蠟切片機(jī)(德國Leica 公司,型號:RM2245);KD-BM 組織包埋機(jī)(上海艾牧生物科技有限公司);DZ5-WS 多管架自動平衡離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);BSA224S-CW 分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);Spectra Max Plus384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物的制備

取黃芩、連翹飲片,粉碎后過60 目篩,備用。分別按照9 個黃芩-連翹不同比例(3∶2,3∶0,3∶1,2∶1,1∶1,2∶3,1∶2,1∶3,0∶3)制備不同混合物,各取6.00 g 于500 mL 圓底燒瓶中,加入120 mL蒸餾水,加熱回流1 h,3500 r/min 離心5 min,取上清液。余下藥渣再加入120 mL 蒸餾水,加熱回流30 min,3500 r/min 離心5 min,合并2 次取上清液,真空濃縮至48 mL。

1.2.2 動物實(shí)驗(yàn)與采樣

將144 只健康KM 小鼠隨機(jī)分為正常對照組(K)、模型組(M)、9 個黃芩-連翹不同比例(3∶2,3∶0,3∶1,2∶1,1∶1,2∶3,1∶2,1∶3,0∶3)配伍干預(yù)組、地塞米松陽性藥物組(Y)組,每組12 只。地塞米松陽性藥物組給予地塞米松2 mg/kg,9 個黃芩-連翹不同比例(3∶2,3∶0,3∶1,2∶1,1∶1,2∶3,1∶2,1∶3,0∶3)配伍干預(yù)組依次給予相應(yīng)藥物的提取液0.1 mL/10 g(相當(dāng)于生藥量1.2 mg/10 g),灌服,1 次/日,連續(xù)7 d,正常對照組和模型組給予等量生理鹽水。參考Ye 等[15]的方法,在實(shí)驗(yàn)第8 天,灌藥1 h 后,除正常對照組外,其他組均采用LPS(10 mg/kg 體重)滴鼻造模,造模前12 h 禁食不禁水。將小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉;然后用移液器精確吸取濃度為10 mg/mL 的LPS溶液,左手控制住小鼠的頭部,右手輕輕推移液器,槍頭可見吸取的小液滴,輕輕靠向小鼠右鼻孔,左手立刻快速有力度的向上提35 cm 左右,再緩慢輕輕回到左手起始位置,進(jìn)行來回10 次,然后同樣的操作向小鼠左鼻孔滴加小液滴,左右鼻孔依次滴加,直至液體滴注完成,最后松開小鼠,將小鼠置于鼠板,腹部朝上、頭部朝上傾斜的體位保持30 min以上,待小鼠復(fù)蘇,放回原籠飼養(yǎng)觀察。實(shí)驗(yàn)過程中記錄小鼠采食量與體重。觀察各組小鼠精神狀態(tài)、活動狀態(tài)等,并記錄。小鼠造模6 h 后,采取血液樣本后,用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,然后將小鼠固定在手術(shù)板上,采取心、肝、脾、肺、腎、胸腺。計(jì)算心、肝、脾、肺、腎、胸腺的器官指數(shù)。計(jì)算公式如下:臟器指數(shù)=器官質(zhì)量/動物體質(zhì)量。

1.2.3 血常規(guī)檢測與血清制備

各組小鼠采集全血首先進(jìn)行血常規(guī)檢測,然后將余下全血置于1.5 mL 離心管中,靜置后經(jīng)3500 r/min 離心15 min,取血清置于-80℃冰箱保存。

1.2.4 肺病理組織學(xué)觀察

將肺以4%的甲醛固定14 d 后,通過常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 及IHC 染色并觀察。

1.2.5 小鼠血清炎性因子測定按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作,測定各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,符合正態(tài)分布的定量資料以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差()來表示,多組資料之間比較采用單因素方差分析,事后比較采用LSD 法;非正態(tài)分布的定量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有顯著性,P<0.01 表示差異極具顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

正常對照組小鼠表現(xiàn)正常,毛發(fā)順滑、比較活潑、呼吸均勻、反應(yīng)靈敏;模型組小鼠精神狀態(tài)差,反應(yīng)遲鈍,毛發(fā)雜亂,蜷縮扎堆,聽診發(fā)現(xiàn)肺部有啰音等。不同給藥組較模型組比,整體情況較好,尤其黃芩-連翹配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)活動較頻繁,反應(yīng)較靈敏。

2.2 小鼠體重與采食量分析

如圖1 所示,各組小鼠的日均體重增長量及日均采食量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 小鼠日均體重增長量及采食量變化(,n=12)Figure 1 Changes in average daily weight gain and food intake of mice(,n=12)

2.3 臟器指數(shù)變化

如表1 所示,各組小鼠腎指數(shù)、肝指數(shù)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)差異均不顯著(P>0.05);與正常對照組相比,模型組的心臟指數(shù)差異不顯著(P>0.05);與模型組比,黃芩-連翹配伍組(3∶2)小鼠心臟指數(shù)顯著降低(P<0.05),黃芩-連翹藥對組(3∶1,2∶1,1∶3,3∶0,0∶3)的心臟指數(shù)極顯著降低(P<0.01);與正常對照組相比,模型組小鼠肺指數(shù)極顯著升高(P<0.01),表明急性肺炎造模成功,與模型組相比,黃芩-連翹配伍組(1∶2)的肺指數(shù)顯著降低(P<0.05),說明黃芩-連翹配伍組(1∶2)對LPS 誘導(dǎo)小鼠急性肺炎保護(hù)作用較好。

表1 小鼠臟器指數(shù)的變化(,n=12)Table 1 Changes of viscera index of mice(,n=12)

表1 小鼠臟器指數(shù)的變化(,n=12)Table 1 Changes of viscera index of mice(,n=12)

注:與對照組比較,##P <0.01;與模型組比較,※P <0.05,※※P <0.01。(下圖/表同)Note.Compared with normal control group,##P <0.01.Compared with model group,※P <0.05,※※P <0.01.(The same in the following figures and tables)

2.4 小鼠血常規(guī)指標(biāo)變化分析

如表2 所示,造模6 h 后,與正常對照組比較,模型組血液中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞總數(shù)顯著增加(P<0.01);與模型組比較,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)能顯著降低白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞總數(shù)(P<0.01),結(jié)果與地塞米松組一致;黃芩-連翹配伍組(2∶1,1∶3,3∶0)也能顯著降低白細(xì)胞總數(shù)(P<0.05);血液中血紅蛋白總數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);比較血液中平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度,與正常對照組比較,模型組血液中平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.01);與模型組比較,黃芩-連翹配伍組都能顯著降低血液中平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(P<0.01);比較血液中紅細(xì)胞總數(shù),與正常對照組比較,模型組血液中紅細(xì)胞總數(shù)顯著升高(P<0.01);與模型組比較,黃芩-連翹配伍組(2∶3)能顯著降低紅細(xì)胞總數(shù)(P<0.01),結(jié)果與地塞米松組一致;比較血液中血小板總數(shù),與對照組比較,模型組血液中血小板總數(shù)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,黃芩-連翹配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)血液中血小板總數(shù)顯著升高(P<0.05),結(jié)果與地塞米松組一致;結(jié)果表明,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)對LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎有明顯減輕作用。

表2 黃芩-連翹配伍對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響(,n=12)Table 2 Effect of compatibility of Scutellariae Radix-Forsythiae fructus on blood routine index of mice(,n=12)

表2 黃芩-連翹配伍對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響(,n=12)Table 2 Effect of compatibility of Scutellariae Radix-Forsythiae fructus on blood routine index of mice(,n=12)

2.5 各組小鼠肺組織切片病理學(xué)觀察

用同一顯微鏡觀察并拍照,對切片的肺損傷程度進(jìn)行評分。每個切片隨機(jī)選擇6 個視野。將炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁厚度變化、肺泡充血損傷程度作為肺組織損傷評分依據(jù)[16],具體見表3。

表3 小鼠肺病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring standard of lung histopathology in mice

如圖2,圖3 所示,通過HE 染色后組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示黃芩-連翹藥對LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎的保護(hù)作用。正常對照組小鼠肺部結(jié)構(gòu)正常,無滲出液,且沒有炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象;與正常對照組比較,模型組肺組織結(jié)構(gòu)松散,有大量炎性細(xì)胞浸潤,可觀察到肺泡壁間質(zhì)明顯增厚及出血等病理現(xiàn)象,并且其肺組織損傷評分均升高;與模型組比較,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)的肺組織有一定程度好轉(zhuǎn),肺組織充血減輕,出血減少、炎性細(xì)胞浸潤減少、肺泡壁間質(zhì)增厚減輕,黃芩-連翹配伍組(1∶3)也有一定的好轉(zhuǎn),并且黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2,1∶3)與地塞米松組肺組織損傷評分均降低。

圖2 小鼠肺組織損傷評分(,n=6)Figure 2 Lung tissue injury score of mice(,n=6)

圖3 各組小鼠肺組織病理形態(tài)變化Figure 3 Pathological changes of lung tissues in mice of each group

如圖4,圖5 所示,免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),滴加過Rabbit Anti-SFTPC Polyclonal Antibody(bs-10067R)工作液的小鼠肺組織切片均出現(xiàn)褐色區(qū)域,而陰性對照組未出現(xiàn),認(rèn)為褐色區(qū)域?yàn)殛栃员磉_(dá)。表明SFTPC 蛋白在肺組織中均有表達(dá)。與正常對照組比較,模型組SFTPC 蛋白在肺組織肺泡與肺泡間隔區(qū)域表達(dá)量顯著增加,大量陽性細(xì)胞表達(dá)SFTPC 蛋白;與模型組比較,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)SFTPC 蛋白在肺組織肺泡與肺泡間隔區(qū)域表達(dá)量顯著減少,陽性細(xì)胞的表達(dá)量較少。結(jié)果表明,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)對LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎有明顯減輕作用。

圖4 SFTPC 蛋白在小鼠肺組織中的分布(IHC)Figure 4 Distribution of SFTPC protein in lung tissue of mice(IHC)

圖5 SFTPC 蛋白在小鼠肺組織中的分布(陰性對照,IHC)Figure 5 Distribution of SFTPC protein in lung tissue of mice (Negative control,IHC)

2.6 小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量測定的結(jié)果分析

如表4 所示,與對照組比,模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量顯著升高(P<0.01);與模型組相比,黃芩-連翹配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量顯著降低(P<0.01),黃芩-連翹配伍組(3∶2)小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 的含量顯著降低(P<0.05);與模型組相比,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2) 小鼠血清中IL-6 的含量顯著降低(P<0.01),黃芩-連翹配伍組(2∶1)小鼠血清中IL-6的含量顯著降低(P<0.05),說明黃芩-連翹配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)在一定程度上抑制TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌。

表4 小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量(,n=6)Table 4 The contents of TNF-α,IL-1β and IL-6 in serum of mice (,n=6)

表4 小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量(,n=6)Table 4 The contents of TNF-α,IL-1β and IL-6 in serum of mice (,n=6)

3 討論

近年來,國內(nèi)外的肺炎動物模型建立方法很多,根據(jù)肺炎病原學(xué)可分為細(xì)菌性、真菌性、病毒性、支原體、脂多糖(LPS)誘導(dǎo)性、化學(xué)誘導(dǎo)性等多種類型[17]。其中脂多糖誘導(dǎo)的肺炎動物模型較為常用,此模型常用的建立方法包括全身給藥法、氣管內(nèi)給藥法、吸入法以及霧化法等。全身給藥法由于誘發(fā)全身免疫反應(yīng)較重,故用于建立急性呼吸窘迫呼吸綜合征模型;氣管內(nèi)給藥法由于小鼠操作較難及操作不當(dāng)會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗;霧化法由于需要專用的暴露塔,使用該方法的研究較少;本研究根據(jù)各種給藥方法優(yōu)缺點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)室的條件綜合考慮選擇吸入法中的滴鼻法,此方法操作簡單,能很好反映出小鼠肺部的炎癥狀況,具體操作步驟是將小鼠麻醉后,將配置好的一定濃度的LPS 溶液滴入小鼠鼻孔中使其全部吸入即可。

脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型,影響小鼠心、肺組織,血液中的炎性細(xì)胞以及血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平,提前攝入一定劑量的黃芩-連翹配伍組合物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎有較好的保護(hù)作用,主要從改善心臟功能、肺部炎癥反應(yīng)等方面促進(jìn)炎癥恢復(fù)。

急性肺炎所致急性肺損傷是由一些不可控制的炎癥反應(yīng)引起的肺部功能障礙綜合征,導(dǎo)致大量炎癥因子和效應(yīng)細(xì)胞相互激活和相互作用[18]。脂多糖稱為內(nèi)毒素(LPS),是比較常見的炎癥激發(fā)因素[19],可使小鼠肺出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,產(chǎn)生大量炎癥因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6 等[3],繼而從外周血中招募大量中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入肺中,誘導(dǎo)炎性細(xì)胞在肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)聚集,進(jìn)一步釋放炎癥因子,造成炎癥級聯(lián)式反應(yīng),引起細(xì)胞因子風(fēng)暴產(chǎn)生[20]。全血中的白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞為主)是誘導(dǎo)小鼠急性肺炎的重要細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)早期可發(fā)現(xiàn)其顯著性升高。LPS 進(jìn)入小鼠肺部,誘發(fā)肺間質(zhì)發(fā)生水腫進(jìn)而導(dǎo)致急性肺損傷,出現(xiàn)低氧血癥、呼吸困難等癥狀。本研究利用LPS 誘導(dǎo)小鼠急性肺炎模型,分析黃芩-連翹不同配伍的抗炎作用差異。通過給小鼠鼻腔滴入LPS 建立急性肺炎模型,同時(shí)使用生理鹽水作為對照,不同比例黃芩-連翹配伍作為給藥組,地塞米松作為陽性對照組,以模擬治療急性肺炎的過程。模型組小鼠精神狀態(tài)差、反應(yīng)遲鈍、活動減少、呼吸急促、聽診肺部有濕羅音等,正常對照組小鼠表現(xiàn)正常、活潑、呼吸均勻、反應(yīng)靈敏,初步判斷LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型復(fù)制成功;與模型組相比,各給藥組小鼠活動基本正常,整體情況較好。與正常對照組相比,模型組小鼠肺指數(shù)極顯著升高(P<0.01),與模型組相比,黃芩-連翹配伍組(1∶2)的肺指數(shù)顯著降低(P<0.05),說明黃芩-連翹配伍能預(yù)防小鼠急性肺炎的發(fā)生。與正常對照組比較,模型組血液中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞總數(shù)明顯升高(P<0.01),說明急性肺炎造模成功;與模型組比較,黃芩-連翹不同配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)能明顯降低白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞總數(shù)(P<0.01),說明黃芩-連翹不同配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)能降低炎性細(xì)胞浸潤。小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 是常見炎癥因子,通過不同炎癥通路誘導(dǎo)產(chǎn)生,進(jìn)而介導(dǎo)急性肺炎的發(fā)生。研究結(jié)果顯示,模型組小鼠血清中的炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量明顯高于正常對照組,說明急性肺炎造模成功,LPS 引起了小鼠肺部的炎癥;黃芩-連翹不同配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)可明顯降低小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的含量(P<0.01),說明黃芩-連翹配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)具有很好的抗炎作用。

在組織學(xué)方面,肺是動物體非常重要的器官之一。為研究肺組織的病理變化,本研究使用組織學(xué)染色與肺組織病理評分方法。肺上皮細(xì)胞包括肺泡I 型和肺泡II 型細(xì)胞。發(fā)生急性肺炎后,肺泡I型細(xì)胞可轉(zhuǎn)為肺泡II 型細(xì)胞,促進(jìn)肺泡的再生,并協(xié)調(diào)肺的穩(wěn)態(tài)[21];肺泡上皮完整性恢復(fù)對肺內(nèi)環(huán)境的恢復(fù)至關(guān)重要[22]。為研究肺泡上皮細(xì)胞的恢復(fù)情況,可以用典型標(biāo)志物SFTPC 來識別肺泡II 型細(xì)胞,通過免疫組織化學(xué)判斷肺泡II 型細(xì)胞在SFTPC蛋白上的表達(dá)量[23]。病理組織學(xué)結(jié)果顯示,LPS 誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎模型肺組織的病理表現(xiàn)為肺泡充血、炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁增厚等急性肺炎特征,說明通過鼻腔滴入LPS 成功建立了急性肺炎模型。而黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)小鼠肺組織肺泡充血、炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁增厚癥狀均較模型組減輕。與正常對照組相比較,模型組病理組織學(xué)評分均升高;與模型組相比,黃芩-連翹配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)和陽性給藥組評分均降低。免疫組化結(jié)果顯示,與正常對照組相比較,模型組SFTPC 蛋白在肺組織肺泡與肺泡間隔區(qū)域表達(dá)量明顯增加,有大量肺泡II 型細(xì)胞表達(dá)SFTPC 蛋白,而陰性對照組未加SFTPC 抗體,根據(jù)陰性對照組的結(jié)果來看其未出現(xiàn)SFTPC 蛋白陽性表達(dá),進(jìn)一步說明了結(jié)果的可靠性;與模型組相比較,黃芩-連翹配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2),SFTPC 蛋白在肺組織肺泡與肺泡間隔區(qū)域表達(dá)量明顯減少,推測肺泡II 型細(xì)胞數(shù)量下降,說明黃芩-連翹不同配伍組(3∶2,1∶1,2∶3,1∶2)可改善LPS 誘導(dǎo)的急性肺炎的發(fā)生,為初步闡明黃芩-連翹配伍干預(yù)急性肺炎模型機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ),后續(xù)將圍繞TNF-α、IL-1β 與IL-6 相關(guān)的上下游關(guān)鍵信號通路做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述,通過分析小鼠急性肺炎模型臨床癥狀、臟器指數(shù)、血清炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6含量、血常規(guī)、HE 及IHC 染色肺組織形態(tài)學(xué)觀察及肺組織損傷病理組織學(xué)評分等指標(biāo)變化的結(jié)果,將LPS 經(jīng)過鼻腔進(jìn)入小鼠肺部能成功建立小鼠急性肺炎模型。且綜合研究發(fā)現(xiàn)黃芩-連翹不同配伍組(1∶1,2∶3,1∶2)可顯著預(yù)防LPS 誘導(dǎo)的急性肺炎,為臨床畜禽急性肺炎的防治提供依據(jù)。