左琴,魏杰,付瑞,劉佐民,王洪,岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

KM 小鼠是我國特有的應(yīng)用最廣泛的封閉群小鼠,有抗病力和適應(yīng)力強(qiáng),繁殖率和成活率高等特點(diǎn)。追溯其歷史,1926 年美國Rockfeller 研究所從瑞士引入白化小鼠培育成瑞士種小鼠。1944 年從印度Haffkine 研究所引入我國云南昆明,1950 年由昆明引入北京天壇(衛(wèi)生部生物制品檢定所現(xiàn)址),1955 年由北京生物制品研究所擴(kuò)種生產(chǎn),推廣到全國使用的一種封閉群小鼠[1]。1961 年引入到衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所(中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所)[2],在中檢院封閉飼養(yǎng)到至今。廣泛用于藥理、毒理、病毒和細(xì)菌引起的傳染病的研究,以及生物制品的檢定工作中[3]。KM 小鼠的遺傳質(zhì)量對(duì)種群維持及檢定工作至關(guān)重要,有必要定期對(duì)封閉群KM 小鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測(cè)和分析。

封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量保證有賴于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)繁育方式和完善的檢測(cè)技術(shù)手段,二者相互影響,促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育和檢測(cè)的良性循環(huán)。KM 小鼠種群在中檢院封閉飼養(yǎng)了60 余年,中檢院長期對(duì)該種群遺傳監(jiān)測(cè),并致力于封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法的研究和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定,應(yīng)用國家標(biāo)準(zhǔn)的生化標(biāo)記檢測(cè)法的14 個(gè)位點(diǎn)分別在1990 年和2010 年對(duì)本單位的KM 小鼠種群進(jìn)行了遺傳質(zhì)量檢測(cè),1990 年種群的平均雜合度是0.2625,多態(tài)性信息含量是0.2065,2010 年群體的平均雜合度是0.1615,多態(tài)性信息含量是0.1307,此研究同時(shí)表明有效位點(diǎn)為7～9 個(gè),在位點(diǎn)數(shù)量少的情況,不能客觀反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)特征[4]。由于生化標(biāo)記方法的有效位點(diǎn)較少的局限性,1990 年和2010 年的檢測(cè)結(jié)果未能準(zhǔn)確描述中檢院KM 小鼠種子群體的遺傳結(jié)構(gòu)信息。

2010 年國家標(biāo)準(zhǔn)“GB14923-2010 哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制”更新發(fā)布,要求對(duì)封閉群的動(dòng)物進(jìn)行遺傳檢測(cè),推薦生化標(biāo)記檢測(cè)法、下頜骨測(cè)量法、DNA 檢測(cè)法等檢測(cè)方法。2017 年中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行業(yè)協(xié)會(huì)頒布實(shí)施了行業(yè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《T/CALAS 21-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠、大鼠微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)方法》,彌補(bǔ)了生化標(biāo)記檢測(cè)法的局限性,微衛(wèi)星方法的位點(diǎn)數(shù)量多且多態(tài)性豐富,位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了全基因組覆蓋[5]。

本研究應(yīng)用團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的微衛(wèi)星技術(shù),對(duì)同一種群的封閉群KM 小鼠種子群體進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測(cè),比較2013 年和2020 年KM 小鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)變化,監(jiān)測(cè)種群遺傳質(zhì)量,完善種群遺傳背景資料,探討封閉群種群維持的重要性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在2013 年和2020 年,分別從中國食品藥品檢定研究院KM 小鼠種子群體基礎(chǔ)群中隨機(jī)選擇30只,10 周齡以上,雌雄各半,剪取尾尖組織1 cm 凍存,用于DNA 提取。所有動(dòng)物均為SPF 級(jí)【SCXK(京)2017-0008】。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度22～26℃,濕度40%～70%,光照12 h 明12 h 暗的屏障環(huán)境中,自由采食、自由飲水,飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院【SYXK(京)2017-0013】。實(shí)驗(yàn)操作符合中國食品藥品檢定研究院動(dòng)物福利倫理要求(中檢動(dòng)(福)第2019(A)001 號(hào))。

1.1.2 主要試劑與儀器

PCR 擴(kuò)增試劑(TaKaKa,R007A),瓊脂糖(Sigma,V900510);PCR 儀(伯樂,Bio-rad MyCycler,美國),離心機(jī)(賽默飛,Thermo MULTIFUGE X1R,美國),Bio-Rad 電泳儀(伯樂,Bio-Rad PowerPar,美國),微量分光光度計(jì)(賽默飛,Thermo MULTIFUGE X1R,美國)等。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA 的提取制備

用氯仿/異戊醇法提取基因組DNA,用瓊脂糖電泳和NanoDrop 微量分光光度計(jì)對(duì)DNA 完整性、濃度和純度進(jìn)行測(cè)定。所有樣本的A260/280 為1.8～2.0,濃度調(diào)整為40～80 ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物及擴(kuò)增程序

按照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)合成30 對(duì)熒光引物,并按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[5]。序列詳見T/CALAS 21-2017 表1(http://www.lascn.com/uploadfiles/zlbz/2018/6/201806081412336328.pdf)。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物分型

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異性后進(jìn)行微衛(wèi)星基因型分型。微衛(wèi)星基因型分型均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。經(jīng)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化特異性差或不能進(jìn)行有效測(cè)序分型的位點(diǎn)不計(jì)入有效位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將有效測(cè)序分型結(jié)果導(dǎo)入Popgen 1.32 軟件中,計(jì)算兩個(gè)代次KM 小鼠在各微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因頻率、平均有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、平均雜合度,同時(shí)利用和Littleprogram 0.6 軟件計(jì)算位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。

參照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn),對(duì)兩個(gè)代次群體的遺傳構(gòu)成進(jìn)行評(píng)價(jià),比較分析不同代次的群體遺傳概貌。同時(shí)也通過PIC 等結(jié)果對(duì)標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)的適用性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 2013 年KM 小鼠的遺傳分型結(jié)果

2013 年該群體共檢測(cè)到98 個(gè)等位基因,平均等位基因數(shù)是3.2667,平均觀測(cè)雜合度為0.4445,平均期望雜合度為0.4953,平均雜合度為0.4864,30 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,1 個(gè)位點(diǎn)(D12Nds11)是單態(tài)性,高度多態(tài)性位點(diǎn)有13 個(gè)(PIC >0.5),中度多態(tài)性位點(diǎn)有13 個(gè)(0.25

表1 2013 年KM 小鼠30 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Table 1 Genetic parameters of 30 STR loci of KM mice in 2013

2.2 2020 年KM 小鼠的遺傳分型結(jié)果

2020 年該群體共檢測(cè)到126 個(gè)等位基因,平均等位基因數(shù)4.2,平均觀測(cè)雜合度為0.4489,平均期望雜合度為0.5239,平均雜合度為0.5150,30 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,單態(tài)性位點(diǎn)有1 個(gè)(D15 Mit5),高度多態(tài)性位點(diǎn)有15 個(gè)(PIC >0.5),中度多態(tài)性位點(diǎn)有10 個(gè)(0.25

表2 2020 年KM 小鼠30 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Table 2 Genetic parameters of 30 STR loci of KM mice in 2020

2.3 2013 年和2020 年KM 小鼠群體遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

2013 年種群的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)和2020 年種群的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析比較,7 個(gè)參數(shù)中除了有效等位基因有顯著性差異外,其余6 個(gè)參數(shù)無顯著性差異,各參數(shù)及P值見表3。

表3 2013 年種群和2020 年種群遺傳參數(shù)的比較Table 3 Comparison of genetic parameters of colony in 2013 and colony in 2020

3 討論

本研究應(yīng)用微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記檢測(cè)法的30 個(gè)位點(diǎn)對(duì)2013 年和2020 年的同一KM 小鼠種群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,對(duì)同一種群相隔15 個(gè)世代進(jìn)行遺傳監(jiān)測(cè)。2013 年種群的平均雜合度是0.4864,觀測(cè)雜合度和期望雜合度間檢驗(yàn)無差異,2020 年種群的平均雜合度是0.5150,觀測(cè)雜合度和期望雜合度間檢驗(yàn)無差異。按照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CALAS 21-2017,封閉群平均雜合度在0.5～0.7,期望雜合度和觀測(cè)雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)無差異,可認(rèn)定為合格的封閉群群體[5],2020 年的研究結(jié)果表明該種群是遺傳質(zhì)量合格的封閉群。比較2013 年和2020 年的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù),除在有效等位基因上有顯著性差異,其余6 項(xiàng)參數(shù)無顯著性差異,與此同時(shí),2020 的參數(shù)均高于2013 的參數(shù)。同一種群在沒有引入外來血緣的影響條件下,其原因可能是2013 年的種群樣本選擇沒有避開同窩個(gè)體隨機(jī)選取,2013 年之后,根據(jù)微衛(wèi)星檢測(cè)結(jié)果的反饋,調(diào)整繁育方式,從而提升了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量。研究結(jié)果表明對(duì)于群體遺傳多樣性的評(píng)價(jià),其可靠性主要取決于采用樣本對(duì)與總體的代表性和遺傳標(biāo)記對(duì)基因組的代表性[6]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為一種特殊的實(shí)驗(yàn)材料,其標(biāo)準(zhǔn)化一直受到行業(yè)內(nèi)的高度重視。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特殊性在于,作為有生命的實(shí)驗(yàn)材料,其微生物質(zhì)量和遺傳質(zhì)量一直處于動(dòng)態(tài)平衡之中。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的目的就是將動(dòng)態(tài)平衡保持在可控范圍內(nèi),進(jìn)而保證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和科研結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。保持封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳特征和遺傳質(zhì)量的穩(wěn)定性,科學(xué)的飼養(yǎng)管理是基礎(chǔ),遺傳監(jiān)測(cè)是有效手段。國家標(biāo)準(zhǔn)GB14923-2010 哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制附錄B 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群的繁殖方法中說明,根據(jù)種群大小,建議了3 種繁殖交配方式,分別是最佳避免近親法,循環(huán)交配法和隨選交配法。1994 年陳國強(qiáng)等[7]通過凈化建立KM 小鼠種群,通過循環(huán)交配法和隨選交配法交配繁殖維持,比較了9 個(gè)生化標(biāo)記位點(diǎn),得到了循環(huán)交配法比隨選交配法更能保持封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳特征。中檢院在2011 年以前,種群以隨選交配法維持傳代保種,從2011 年開始建立保種群和生產(chǎn)群,保種群采用循環(huán)交配法維持傳代保種,從2013 年和2020 年的遺傳監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,目前種群是合格種群。

理論上封閉群的種群數(shù)量無限,在種群內(nèi)隨選交配,種群可以達(dá)到Hardy-Weinberg 平衡,種群的基因頻率和基因型頻率會(huì)保持不變,但實(shí)踐中動(dòng)物種群的數(shù)量都是有限的,即使采用避免近親交配的方法維系種群,隨著傳代世代數(shù)的增加,種群的近交系數(shù)上升,不可避免的發(fā)生遺傳漂變,不符合Hardy-Weinberg 定律。要想建立穩(wěn)定的封閉群種群,必須保持種群遺傳多樣性,防止近交系數(shù)的上升。在2009 年,商海濤等[8]提出建立標(biāo)準(zhǔn)化的KM 小鼠種群,是KM 小鼠亟待解決的問題,嘗試進(jìn)行種群融合,并提示種群融合的過程中要足夠的雜交樣本數(shù),并采取適當(dāng)措施才能使小鼠的遺傳多樣性得到保持。

本研究對(duì)KM 小鼠種子群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,提供了KM 小鼠遺傳背景數(shù)據(jù),為封閉群實(shí)驗(yàn)小鼠的研究應(yīng)用提供借鑒,提升動(dòng)物種子資源的質(zhì)量,為進(jìn)行KM 的種群融合研究打基礎(chǔ),以期建立標(biāo)準(zhǔn)化種群。