韓雨陳晨王鑫峰張海陽陳俞許德瑋姚鐵翼邵曉云徐紹業(yè)

(1.桂林醫(yī)學院基礎醫(yī)學院,廣西 桂林 541004;2.桂林醫(yī)學院科學實驗中心,廣西 桂林 541004;3.桂林醫(yī)學院腦與認知神經(jīng)重點實驗室,廣西 桂林 541004;4.桂林醫(yī)學院臨床醫(yī)學院,廣西 桂林 541004)

香煙煙霧中含有大量尼古丁等有害化合物,長期處于此環(huán)境中的孕期哺乳類動物可導致胎兒流產(chǎn)、死胎、畸形等現(xiàn)象,同時吸煙對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能的影響也是其眾多影響之一,其中煙草對神經(jīng)傳遞和認知功能的發(fā)育有顯著的負面影響[1]。但香煙煙霧暴露對子代神經(jīng)系統(tǒng)的影響及相關分子機理尚不清楚。坍塌反應調(diào)節(jié)蛋白(Collapsing response mediator proteins,CRMPs) 家族包含CRMP1、2、3、4、5 共5 個成員,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中高度表達,是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的主要磷酸化蛋白之一[2]。研究顯示CRMP1 能夠調(diào)節(jié)微管的組裝和微絲肌動蛋白的重組,介導神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導神經(jīng)元突起的延伸,而CRMP1 表達的減少同時影響微管的裝配導致神經(jīng)元軸突的穩(wěn)定性下降和胞漿的運輸障礙,直接導致神經(jīng)元功能異常和退化,并促進神經(jīng)元死亡。另外CRMP1 和CRMP2 能通過不同的信號通路調(diào)節(jié)樹突棘成熟,促進/增加海馬神經(jīng)元突起的生長、脊柱的形成和樹突棘的密度[3]。CRMP1 和CRMP4 是發(fā)育中的小鼠大腦錐體神經(jīng)元樹突正確定向所必需的[4]。CRMP5 對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞有著神經(jīng)保護和神經(jīng)再生作用[5]。死亡相關蛋白激酶1(Death-associated protein kinase 1,DAPK1)是一種鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[6],在機體中廣泛參與由多種信號介導的細胞死亡過程[7],同時在大腦中高度表達[8]。研究表明,它與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關的多種神經(jīng)元損傷有關[9]。DAPK1 作為細胞凋亡正調(diào)控因子,可通過上調(diào)p53 基因的表達而促使細胞進入Ⅰ型細胞凋亡程序,也可與非p53 依賴的經(jīng)典凋亡途徑發(fā)生關聯(lián)[10]。另有研究發(fā)現(xiàn),DAPK1 亦可誘導一種不需要半胱天冬酶參與的Ⅱ型細胞死亡或稱自體吞噬性細胞死亡[9]。

實驗前期研究初步證明了香煙煙霧暴露對胎兒多器官發(fā)育均有一定影響[11]。本實驗進一步研究親代雌鼠香煙煙霧暴露對子代大鼠行為學的影響,通過曠場實驗、轉(zhuǎn)棒疲勞實驗和Morris 水迷宮實驗從整體水平檢測大鼠的焦慮、運動耐受能力、以及對空間位置和方向的學習記憶能力的影響。同時,在分子水平通過Western Blot 檢測親代雌鼠香煙煙霧暴露對子代大鼠大腦皮層組織中DAPK1 和CRMP1 蛋白表達的影響。旨在闡明親代雌鼠香煙煙霧暴露對子代神經(jīng)系統(tǒng)行為學的影響及其機制,為預防和治療香煙煙霧暴露引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選用18 只7～8 周齡SPF 級SD 雌性大鼠,體重200～220 g,雄性9 只,體重220～240 g,均購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2019-0004】。大鼠飼養(yǎng)提供標準飼料,飲用高壓滅菌水,光照和黑暗各12 h 輪流交替,濕度保持在60%左右,溫度控制在22℃左右,飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學院實驗動物中心【SYXK(桂)2020-0005】。動物實驗經(jīng)桂林醫(yī)學院實驗動物倫理委員會審查,符合動物福利倫理相關要求(GLMC-IACUC-2021006)。

1.1.2 主要試劑與儀器

廣西某品牌香煙(20 支/包);RIPA 裂解液(Beyotime Biotechnology,上海,中國);PMSF 苯甲基磺酰氟(Solarbio Life Sciences,北京,中國);磷酸酶抑制劑(MCE,Monmouth Junction,NJ,美國);兔源CRMP1 多克隆抗體(Proteintech Rosemont,IL,美國);兔源 DAPK1 多克隆抗體(Proteintech Rosemont,IL,美國);鼠源GAPDH 單克隆抗體(Proteintech Rosemont,IL,美國);Protein marker(Thermo Waltham,MA,美國);BCA 試劑盒(Beyotime Biotechnology,上海,中國);ECL 發(fā)光試劑盒(Thermo Waltham,MA,美國)。

自制半封閉式煙熏染毒箱(150 cm × 60 cm ×60 cm);曠場裝置(型號XR-XZ301)、轉(zhuǎn)棒疲勞儀(型號XR1514-RZPM)、Morris 水迷宮(型號XRXM101),均由上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 煙熏大鼠模型的建立及分組

參照徐紹業(yè)等[12]使用的自制半封閉式煙熏染毒箱(150 cm × 60 cm × 60 cm),以飼養(yǎng)箱為骨架,分為上下兩層,箱兩邊預留1 cm × 1 cm 通氣孔各3個。參照陳茜等[13]煙熏模型方法并改進,在箱內(nèi)上下層各設置一個燃煙點,每個燃煙點每次連續(xù)自燃香煙10 支,煙熏維持約60 min,每天2 次(9:00,15:00)。將親代雌鼠隨機分為煙熏組和對照組各9只,煙熏組雌鼠置于半封閉式煙熏染毒箱,對照組雌鼠于同環(huán)境、同飼料喂養(yǎng),但不給予煙霧吸入;用于合籠交配的雄鼠9 只不作處理,正常飼養(yǎng)。煙熏1 個月后,將煙熏組和對照組雌鼠分別以2∶1 比例與雄鼠合籠(每晚19:00),次日晨分籠,反復數(shù)日,直至確定雌鼠懷孕則停止合籠。待孕鼠分娩出子代大鼠后則停止煙熏處理,煙熏持續(xù)兩個月左右。隨后在煙熏組和對照組中不同親代大鼠繁育的后代中篩選出體重相當?shù)? 窩仔鼠(每窩分別為11只、12 只、13 只),待成年(約4 周齡)進行曠場實驗、轉(zhuǎn)棒疲勞實驗、Morris 水迷宮實驗。同時,收集不同發(fā)育階段(0、7、21 d 和4 周)煙熏組和對照組子代大鼠的大腦皮層腦組織,Western Blot 檢測CRMP1 和DAPK1 蛋白的表達情況。實驗使用戊巴比妥鈉過量麻醉對大鼠進行安樂死處理。

1.2.2 曠場實驗

曠場實驗檢測大鼠自發(fā)探索能力、活動能力和焦慮情緒。SD 大鼠選用曠場裝置(50 cm × 50 cm ×50 cm)為底部和側壁均為黑色有機板的自發(fā)活動箱,應用自發(fā)活動視頻分析系統(tǒng)將自發(fā)活動箱平均分為25 格,設定周邊16 格為外周區(qū),中間9 格為中央?yún)^(qū)。實驗前將待測大鼠置于曠場裝置自由停留5 min 進行環(huán)境適應,每天1 次,連續(xù)2 d。正式實驗時間盡量與環(huán)境適應時間一致。正式實驗即將待測大鼠放入曠場裝置底板中心,隨后使其自由活動300 s,記錄子代大鼠全程運動總距離、平均運動速度,以及進入中央?yún)^(qū)和外周區(qū)的次數(shù)、在中央?yún)^(qū)和外周區(qū)的運動距離和停留時間,子代大鼠運動路徑圖見圖1A。

1.2.3 轉(zhuǎn)棒疲勞實驗

轉(zhuǎn)棒疲勞實驗檢測大鼠的運動耐受能力。預先將待測大鼠置于轉(zhuǎn)棒疲勞儀(轉(zhuǎn)棒直徑60 mm,跑道寬度80 mm)進行訓練,每次以40 r/min 轉(zhuǎn)速持續(xù)5 min,每只大鼠每天訓練3 次,期間間隔15 min,共訓練2 d。2 d 后進行正式測試,每只鼠測試3 次,方法與訓練期相同,記錄大鼠在轉(zhuǎn)棒疲勞儀上的持續(xù)運動時間及運動距離,取平均值。

1.2.4 Morris 水迷宮實驗

Morris 水迷宮實驗檢測大鼠對位置和方向的空間學習記憶能力。水迷宮水池直160 cm,將水池均分為4 個象限,設置隱匿逃生平臺(直徑8 cm)于其中1 個象限的中央,根據(jù)4 個象限分別以A、B、C、D標記為大鼠4 個入水點。注水深度50 cm,注水后使平臺沒入水面以下1 cm,實驗時向水池內(nèi)注入黑色墨水使之與池水混勻。測試期間迷宮外部各參照物保持不變,水溫維持(25 ± 2)℃。首先進行獲得性訓練(即定位航行實驗),隨機選擇一個入水點將大鼠面向池壁輕輕放入水中,若2 min 內(nèi)四肢登上隱匿平臺,則使其在平臺上停留15 s;若2 min 內(nèi)尚未找到平臺,則人為引導其尋找平臺并停留15 s,每只大鼠每天訓練4 次,分別從4 個不同的入水點入水,每次訓練間隔15～20 min,連續(xù)5 d,記錄大鼠的逃避潛伏期、到達平臺的游泳路程、以及平均游泳速度。第6 天進行空間探索實驗,即在定位航行實驗基礎上撤除逃生平臺,將待測大鼠從原平臺象限(目標象限)的對側入水,計時2 min,記錄大鼠到達目標象限的時間、進入目標象限的次數(shù)、在目標象限停留時間、平均游泳速度、總游泳路程。

1.2.5 Western Blot

取煙熏組和對照組子代大鼠不同生長階段的大腦皮層組織,用RIPA 裂解液(臨用時添加蛋白酶抑制劑PMSF 和磷酸酶抑制劑)完全裂解腦組織,提取大腦皮層組織總蛋白,采用BCA 試劑盒法測定蛋白濃度。將各組蛋白樣品按一定順序加入上樣孔,進行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉2 h 后,選擇目的抗體在4℃冰箱旋轉(zhuǎn)孵育過夜,次日用1 × TBST 洗膜后進行室溫二抗孵育1 h,再次洗膜后應用ECL化學發(fā)光液對目的蛋白條帶進行曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 親代雌鼠香煙煙霧暴露增強了子代大鼠的焦慮感

曠場實驗結果顯示,煙熏組子代大鼠在總區(qū)域較對照組的運動總距離(P<0.05,圖1B)和平均運動速度(P<0.05,圖1C)明顯增加;子代大鼠在中央?yún)^(qū)的運動情況顯示,煙熏組子代大鼠進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)(P<0.05,圖1D)、在中央?yún)^(qū)的運動距離(P<0.05,圖1E)、以及在中央?yún)^(qū)的停留時間(P<0.05,圖1F)明顯增加。同時,子代大鼠在外周區(qū)的運動情況表現(xiàn)為,煙熏組較對照組子代大鼠進入外周區(qū)的次數(shù)(P<0.05,圖1G)和在外周區(qū)運動的距離(P<0.05,圖1H)明顯增加,但煙熏組子代大鼠在外周區(qū)停留時間有所減少(P<0.05,圖1I)。上述結果推測,親代雌鼠香煙煙霧暴露可能促使子代大鼠運動亢奮激發(fā)其探索新知的能力,同時也增加了子代大鼠的焦慮情緒(見圖1)。

圖1 煙熏組和對照組子代大鼠的曠場實驗結果(n=11)Note.A.Movement path map of offspring rats on the open field device.B.The total movement distance of offspring rats in the total area.C.Average movement speed of offspring rats in the total area.D.The number of offspring rats entering the central region.E.Movement distance of offspring rats in the central region.F.Residence time of offspring rats in central region.G.The number of offspring rats entering the peripheral area.H.Movement distance of offspring rats in peripheral area.I.Residence time of offspring rats in peripheral area.Compared with the control group,?P <0.05.Figure 1 Open field test results of offspring rats in the smoked group and the control group(n=11)

2.2 親代雌鼠香煙煙霧暴露降低子代大鼠的運動耐受能力

轉(zhuǎn)棒疲勞實驗結果顯示,煙熏組子代大鼠在轉(zhuǎn)棒疲勞儀上的持續(xù)運動時間(P<0.001,圖2A)和運動的距離(P<0.001,圖2B)較對照組子代大鼠顯著減少。表明親代雌鼠香煙煙霧暴露會導致子代大鼠運動耐受能力顯著下降(見圖2)。

圖2 煙熏組和對照組子代大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞實驗結果(n=12)Note.A.Exercise time of offspring rats.B.Movement distance of offspring rats.Compared with the control group,???P <0.001.Figure 2 Results of rod-rotating fatigue test of offspring rats in the smoked group and control group(n=12)

2.3 親代雌鼠香煙煙霧暴露對子代大鼠空間學習和記憶能力的影響

Morris 水迷宮實驗結果顯示,在獲得性訓練的定位航行實驗中,煙熏組子代大鼠的逃避潛伏期(P>0.05,圖3A)和抵達平臺的運動路程(P>0.05,圖3B)與對照組無顯著性差異。隨著訓練天數(shù)的增加,子代大鼠逃避潛伏期和抵達平臺的運動路程均逐漸縮小,表明親代雌鼠香煙煙霧暴露并沒有影響子代大鼠的學習能力,但煙熏組子代大鼠的游泳速度較對照組明顯下降(P<0.001,圖3C)。

在撤除平臺后進行的空間探索實驗中,煙熏組子代大鼠較對照組在目標象限停留的時間占比下降(P<0.05,圖3D),進入目標象限的次數(shù)明顯減少(P<0.05,圖3E)。整個游泳過程中煙熏組子代大鼠的平均游泳速度明顯降低(P<0.01,圖3F),總游泳路程也較對照組顯著減少(P<0.01,圖1G)。這表明親代雌鼠香煙煙霧暴露會導致其子代大鼠的空間記憶能力減退,且運動能力也明顯減弱(見圖3)。

圖3 煙熏組和對照組子代大鼠Morris 水迷宮實驗結果(n=13)Note.The positioning navigation experiment.A.Escape latency of offspring rats.B.The swimming distance of offspring rats reaching the platform.C.Average swimming speed of offspring rats.The space exploration experiment.D.Proportion of residence time of offspring rats in target quadrant.E.The number of offspring rats entering the target quadrant.F.Average swimming speed of offspring rats.G.Total swimming distance of offspring rats.Compared with the control group,?P <0.05,??P <0.01,???P <0.001.(The same in the following figures)Figure 3 Morris water maze test results of offspring rats in the smoking group and control group(n=13)

2.4 不同發(fā)育階段子代大鼠大腦皮層中CRMP1、DAPK1 的蛋白表達情況

Western Blot 結果顯示,煙熏組子代CRMP1 蛋白在0 d(P<0.001,圖4A,4B)、7 d(P<0.05,圖4C,4D)、21 d(P<0.05,圖4E,4F)的表達水平均顯著低于對照組。而在4 周(P>0.05,圖4G,4H)時,兩組間CRMP1 蛋白表達無明顯差異。DAPK1蛋白的表達水平在各個檢測階段0 d(P<0.001,圖4A,4B)、7 d(P<0.01,圖4C,4D)、21 d(P<0.05,圖4E、4F)、4 周(P<0.001,圖4G,4H)均具有顯著性差異,尤其是在發(fā)育早期。表明親代雌鼠香煙煙霧暴露可影響子代大鼠大腦皮層中CRMP1 和DAPK1 的表達(見圖4)。

圖4 Western Blot 檢測煙熏組和對照組子代大鼠不同發(fā)育階段大腦皮層CRMP1、DAPK1 蛋白表達情況Note.A,B.Progeny rats were born 0 d.C,D.Progeny rats were born for 7 d.E,F.Progeny rats were born for 21 d.G,H.The progeny rats were born 4 weeks.Figure 4 Western Blot analysis of CRMP1 and DAPK1 protein expression in cerebral cortex of offspring rats at different developmental stages in the smoking group and the control group

3 討論

眾所周知,中國是一個煙草生產(chǎn)和消費大國。雖然中國女性有吸煙習慣者較歐美女性少,但是中國男性吸煙者眾多,由此導致的女性被動吸入二手煙的幾率亦隨之增加。香煙煙霧中含有的大量尼古丁等有害化合物被母體吸收后將導致孕婦妊娠期并發(fā)癥[14],也可能通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)影響胎兒大腦發(fā)育[15],懷孕期間長期處于此環(huán)境可導致胎盤早剝、流產(chǎn)、死產(chǎn)、早產(chǎn)(<37 周妊娠)和低出生體重(<2500 g)[16]等,并且會導致胎兒神經(jīng)發(fā)育不良及后代多指(趾)畸形等有害影響。

到目前為止,孕婦香煙煙霧暴露對后代大腦神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響及相關分子機理尚不清楚。為了探究香煙煙霧暴露對其子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響,本研究通過香煙煙霧暴露對親代雌鼠進行煙熏處理,并通過動物行為學檢測子代大鼠在情緒、運動能力及學習記憶等方面的變化。煙熏組和對照組親代雌鼠分別娩出53 只和72 只子代大鼠,其中對部分成年期子代大鼠(4 周)進行動物行為學檢測,部分發(fā)育期(0 d,7 d,21 d,4 周)子代大鼠進行Western Blot 檢測。

曠場實驗結果顯示,煙熏組子代大鼠進入曠場中央?yún)^(qū)的頻率更高,且其在總區(qū)域的運動總路程和平均運動速度均較對照組明顯增加,這可能與親代雌鼠香煙煙霧暴露導致其子代大鼠過度活躍有關。有研究比較了在親代雄鼠和雌鼠中尼古丁暴露對其子代大鼠的行為學影響,結果發(fā)現(xiàn)尼古丁暴露的雌鼠其子代大鼠表現(xiàn)為過度活躍和沖動性行為增加[17]。Liu 等[18]曾報道親代雌性接觸尼古丁可能會導致子代大鼠產(chǎn)生神經(jīng)生物學障礙,如多動癥、學習和記憶問題等。同時,本研究結果還顯示,煙熏組子代大鼠在外周區(qū)和中央?yún)^(qū)之間的穿越次數(shù)亦較對照組明顯增多,由此表明,親代雌鼠香煙煙霧暴露后將導致其子代更強烈的焦慮感,這與Zhou等[19]的研究結果一致,即母體尼古丁暴露的子代在幼年期表現(xiàn)出身體和神經(jīng)行為發(fā)育遲緩,增加焦慮水平。

二手煙暴露將會引起哮喘、呼吸道感染、肺生長和功能受損、運動耐受性下降、認知障礙、行為問題等多種不良健康風險。多項研究表明,香煙煙霧暴露可減緩小鼠的生長發(fā)育,并使小鼠的運動能力明顯減弱[20-21]。但目前關于親代香煙煙霧暴露后對子代運動能力影響的報道甚少。本研究轉(zhuǎn)棒疲勞實驗結果顯示,親代煙熏組的子代大鼠運動耐受能力顯著下降,與對照組存在極顯著性差異(P<0.001)。由此可見,親代香煙煙霧暴露也可影響其子代的運動耐受能力。

Morris 水迷宮主要用于檢測實驗動物的學習和記憶能力。本研究在Morris 水迷宮前5 d 的獲得性訓練中表現(xiàn)為,子代大鼠的逃避潛伏期和尋找平臺的總路程在煙熏組和對照組之間無明顯的差異;隨著訓練天數(shù)的延長,二者潛伏時間和尋找路程均隨之縮短,且二者幾乎趨于一致。上述研究表明,親代大鼠香煙煙霧暴露并不影響子代大鼠的學習能力。這與Alzoubi 等[22]在水煙暴露對大鼠學習能力影響的研究結果相一致。但是,煙熏組子代大鼠的平均游泳速度卻較對照組明顯降低,這進一步說明親代雌鼠香煙煙霧暴露會對子代大鼠的運動能力產(chǎn)生不良影響,這與轉(zhuǎn)棒疲勞實驗結果一致。在后續(xù)的空間探索實驗中,煙熏組子代大鼠在目標象限停留的時間以及進入目標象限的次數(shù)都明顯減少,由此表明,親代雌鼠香煙煙霧暴露后會影響子代大鼠的空間記憶能力。此前一項關于水煙環(huán)境對大鼠學習記憶影響的研究發(fā)現(xiàn),接觸水煙環(huán)境的大鼠會導致短期和長期記憶受損[22]。而且,據(jù)報道,圍產(chǎn)期尼古丁暴露會導致子代小鼠的注意力和記憶力的顯著缺陷,有趣的是,這一缺陷具有性別依賴性,雄性后代而非雌性后代更明顯[23]。同時,在空間探索實驗中,親代煙熏組雌鼠的子代大鼠的平均游泳速度以及總游泳路程也明顯減少,同樣表明,親代雌鼠香煙煙霧暴露會減弱子代大鼠的運動能力。

有研究表明,香煙煙霧暴露會誘發(fā)腦部炎癥和氧化應激[24],在子代小鼠大腦皮層產(chǎn)生炎癥反應,如壞死和細胞質(zhì)空泡化,還觀察到大量的凋亡細胞和死亡的神經(jīng)元,對大腦的功能產(chǎn)生負面影響,從而導致子代小鼠記憶功能的異常[25]。為了探究親代香煙煙霧暴露對子代生長發(fā)育及凋亡的影響,本研究分別收集子代大鼠出生后不同階段(0 d、7 d、21 d、4 周)的大腦皮層組織,并選擇與發(fā)育和凋亡相關的靶分子CRMP1 和DAPK1 進行蛋白水平檢測,從結果可以看出,煙熏組子代大鼠較正常組子代大鼠腦組織中CRMP1 和DAPK1 蛋白表達水平均顯著降低。由于CRMP1 具有調(diào)節(jié)樹突棘成熟、促進/增加海馬神經(jīng)元突起的生長、脊柱的形成以及增加樹突棘密度的功能[3],推測親代大鼠香煙煙霧暴露導致CRMP1 顯著下降,可能造成樹突棘的成熟障礙,并導致神經(jīng)元突起生長受限,從而影響了腦細胞的正常生理功能;同時,DAPK1 作為細胞凋亡正調(diào)控因子,促進細胞凋亡[6],廣泛參與由多種信號介導的細胞死亡過程[7],而親代大鼠香煙煙霧暴露致使子代大鼠腦組織中DAPK1 的表達降低,可能打破了腦組織中正常細胞凋亡和發(fā)育的平衡。但親代雌鼠香煙煙霧暴露后導致其子代大鼠產(chǎn)生的一系列行為學改變(焦慮、運動耐受能力減退、空間記憶能力減退等)是否與CRMP1、DAPK1相關聯(lián),該靶分子調(diào)節(jié)子代大鼠行為學改變的機制如何則仍需進一步探討。

本研究結果表明親代雌鼠香煙煙霧暴露可增強子代大鼠的焦慮感、降低其運動耐受能力,并導致子代大鼠的記憶力減退,這可能與CRMP1 和DAPK1 的調(diào)節(jié)有關。于此,我們認為有必要以多種形式開展反吸煙宣傳活動,提高公眾對二手煙危害的認識以及保護女性及兒童們免受其害,并從分子生物學角度進一步探索香煙煙霧暴露導致神經(jīng)系統(tǒng)損害的治療靶點。