余小元 謝子健 曹月琴 孔維寶??

（1西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070 2重慶行知職業(yè)技術(shù)學(xué)校 重慶 401220）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細(xì)胞綠藻，隸屬于綠藻門、綠藻綱、團(tuán)藻目、紅球藻科、紅球藻屬，該藻能大量積累蝦青素（astaxanthin）而呈現(xiàn)紅色，故名紅球藻。雨生紅球藻是繼螺旋藻（Spirulin）、小球藻（Chlorella）研究開發(fā)之后發(fā)現(xiàn)的又一種富含營養(yǎng)價值和藥用價值的經(jīng)濟(jì)微藻，主要活性成分包括蝦青素、多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，2010年被我國批準(zhǔn)為新資源食品。雨生紅球藻被公認(rèn)為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最佳生物來源，其蝦青素含量約占細(xì)胞干重的2.7%～3.8%。蝦青素在清除自由基、抗衰老、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面都顯示出良好的生物學(xué)活性，被廣泛應(yīng)用于功能性食品、醫(yī)藥、化妝品和功能飼料等領(lǐng)域[1]。此外，雨生紅球藻含有的其他活性物質(zhì)，例如，微藻多糖、蛋白質(zhì)及富含不飽和脂肪酸的油脂等，也具有較高的研究和開發(fā)價值[2]。本文總結(jié)了雨生紅球藻的生物學(xué)特性、胞內(nèi)主要生物活性物質(zhì)及功能、培養(yǎng)技術(shù)及綜合應(yīng)用，旨在為雨生紅球藻生物資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 雨生紅球藻的生物學(xué)特征

1.1 生活史 雨生紅球藻是一種生長在淡水中的單細(xì)胞綠藻，其生長過程主要分為2個階段：綠色營養(yǎng)細(xì)胞階段和不動細(xì)胞階段（圖1）。前期在適宜的培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻的生長處于綠色營養(yǎng)細(xì)胞階段，主要特征為細(xì)胞表面有2條鞭毛，鞭毛可運動并幫助細(xì)胞進(jìn)行光合作用或營異養(yǎng)生活；隨著環(huán)境因素的變化，雨生紅球藻進(jìn)入不動細(xì)胞階段，鞭毛消失，并開始合成蝦青素。根據(jù)其顏色、形態(tài)又分為3個過程狀態(tài)：綠色不動細(xì)胞、桔黃色不動細(xì)胞和紅色孢囊，其中桔黃色不動細(xì)胞是積累蝦青素的最佳階段。最后隨著細(xì)胞變?yōu)殒吣业倪^程，紅色逐漸加深，這表示細(xì)胞已成熟，蝦青素已大量積累[3]。

1.2 環(huán)境因素 在適宜的環(huán)境條件下，雨生紅球藻細(xì)胞能健康生長，而不利的因素能有效促進(jìn)蝦青素和脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)的積累。影響雨生紅球藻生長代謝過程的主要環(huán)境因素包括光照、pH和溫度。

1.2.1 光照 光照對包括雨生紅球藻在內(nèi)的微藻的生長和代謝產(chǎn)物積累具有重要作用。雨生紅球藻生長所需的最適光照強(qiáng)度具有藻種特異性。一般來說，適宜于紅球藻生長的光照強(qiáng)度為50～100 μmol/(m2·s)。高光強(qiáng)是刺激蝦青素合成的重要誘導(dǎo)因素之一，高光脅迫能使藻細(xì)胞光合系統(tǒng)產(chǎn)生過量活性氧，進(jìn)而刺激蝦青素的合成，以減緩活性氧對藻細(xì)胞的光氧化損傷。此外，光質(zhì)也會影響雨生紅球藻細(xì)胞的生長和蝦青素的積累，紅光可促進(jìn)藻細(xì)胞的生長，而藍(lán)光更有利于蝦青素的積累[4]。綜上，高光照強(qiáng)度促進(jìn)蝦青素的積累是以犧牲藻細(xì)胞的生長為代價的，光照強(qiáng)度過大會導(dǎo)致紅球藻細(xì)胞大量死亡。因此，從保證藻細(xì)胞正常生長和蝦青素積累的雙重目的考慮，在培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞時可采用在不同培養(yǎng)階段提供不同光照強(qiáng)度和光質(zhì)的方式進(jìn)行。

1.2.2 pH pH是影響雨生紅球藻生長速度快慢的重要因素之一。綠色營養(yǎng)細(xì)胞階段對環(huán)境pH的改變尤其敏感，其生長狀況與培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定性關(guān)系密切。雨生紅球藻生長的最適pH一般為7～8。有研究發(fā)現(xiàn)，4株雨生紅球藻的光合放氧速率隨pH變化分為2種類型：一種是隨著藻液pH上升，光合放氧速率經(jīng)歷了上升—最大值—下降的變化；另一種趨勢是隨著藻液pH上升，光合放氧速率持續(xù)下降[5]。這說明，培養(yǎng)液的pH會影響雨生紅球藻的光合放氧速率，進(jìn)而影響其生長，而最適pH也因藻種不同而存在差異。從保證藻細(xì)胞生長的角度考慮，在培養(yǎng)過程中控制適宜的pH是獲得高生物量和代謝物的有效方法。

1.2.3 溫度 在光合自養(yǎng)條件下，雨生紅球藻生長的最適溫度一般為20～27℃。當(dāng)溫度升至27℃時，藻細(xì)胞生長開始逐漸變慢；28℃時藻細(xì)胞由游動又變?yōu)椴粍?，開始積累蝦青素。苗鳳萍等[6]發(fā)現(xiàn)在15～28℃的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，雨生紅球藻的生長和蝦青素的積累均經(jīng)歷了上升—最大—下降的趨勢，低溫和高溫均不利于藻細(xì)胞生長和蝦青素合成；在22℃和25℃時，藻細(xì)胞干重和蝦青素含量均較高，呈現(xiàn)較高的同步性。然而在混合營養(yǎng)或異養(yǎng)培養(yǎng)條件下，較高的溫度（例如，28℃）反而有利于雨生紅球藻利用有機(jī)碳源，此溫度下蝦青素的合成也更高效。

2 雨生紅球藻細(xì)胞中的活性物質(zhì)及其功能

2.1 蝦青素 蝦青素是一種酮式次級類胡蘿卜素，其分子由2個β-紫羅酮環(huán)通過多烯鏈相連構(gòu)成，分子式為C40H52O4，相對分子質(zhì)量為596.84。雨生紅球藻中合成、積累的蝦青素，其含量約占細(xì)胞干重的2.7%～3.8%，是天然蝦青素生產(chǎn)的理想生物來源。當(dāng)雨生紅球藻細(xì)胞生長處于脅迫條件（例如，強(qiáng)光、高鹽、高溫或添加外源誘導(dǎo)物等）時，開始大量積累蝦青素。蝦青素為脂溶性色素，分為游離態(tài)和酯化態(tài)2種存在形式。其中，雨生紅球藻95%的蝦青素以更穩(wěn)定的酯化態(tài)形式存在，主要通過與棕櫚酸、油酸或亞油酸等脂肪酸的羧基結(jié)合，形成蝦青素單酯和蝦青素二酯，并儲存在富含三酰甘油的胞質(zhì)脂質(zhì)體中[7]。

蝦青素的生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為較強(qiáng)的抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗衰老、抗糖尿病、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防和治療眼疲勞、增強(qiáng)免疫力和抗癌活性等。蝦青素分子結(jié)構(gòu)中含有多個共軛雙鍵，分子末端的不飽和酮基和羥基中含有大量活潑電子，可提供電子給自由基或吸引自由基的未配對電子，從而使自由基形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，生成新的化學(xué)物質(zhì)，起到抗氧化作用。蝦青素可穿過細(xì)胞膜，抑制磷脂雙分子層的過氧化，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其抗氧化活性是其他類胡蘿卜素的10倍，是維生素E的500多倍，被稱為“超級抗氧化劑”。

2.2 多糖 微藻多糖由于資源種類豐富、化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特等優(yōu)勢被廣泛關(guān)注，并顯示出良好的抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生物學(xué)活性。研究表明，雨生紅球藻多糖具有良好的清除自由基能力，以及促進(jìn)血栓溶解、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和減輕重金屬離子對機(jī)體的毒害作用等多種功能，在生物醫(yī)藥和化妝品開發(fā)行業(yè)均具有良好的開發(fā)利用空間。

劉涵等[8]對雨生紅球藻3種粗多糖的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，各組分單糖組成復(fù)雜，主要含有半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖胺和半乳糖胺，其中，半乳糖含量最高（大于20%）。此外，以提取蝦青素后的雨生紅球藻藻渣為原料，在體外免疫細(xì)胞模型活性跟蹤下，對超聲輔助提取的雨生紅球藻粗多糖（Haematococcus pluvialispolysaccharide，HPP）進(jìn)行分離純化和免疫活性測試，結(jié)果顯示，5個多糖組分中HPP-c3的免疫活性較好且含量較高。這表明，雨生紅球藻多糖具有良好的研究和開發(fā)價值。

2.3 蛋白質(zhì) 雨生紅球藻蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸種類豐富，是潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)來源。研究表明，雨生紅球藻中粗蛋白含量約為26%[9]。已檢測到雨生紅球藻蛋白質(zhì)中含有15種氨基酸，其中，含6種必需氨基酸（亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、異亮氨酸）和9種非必須氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、組氨酸）[10]。目前，對雨生紅球藻蛋白質(zhì)（例如，藻膽蛋白的結(jié)構(gòu)與功能）的研究還較為缺乏，但根據(jù)藻蛋白三維結(jié)構(gòu)的相似性，可推測雨生紅球藻蛋白質(zhì)具有與螺旋藻藻蛋白相似甚至更高的抗高血壓、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性，在食品、保健品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有研究、開發(fā)潛力。

2.4 油脂 由于生物柴油和功能性食用油脂開發(fā)的市場需求，一直以來，對微藻油脂的研究、開發(fā)是微藻研究領(lǐng)域持續(xù)攻關(guān)的熱點和重點內(nèi)容。雨生紅球藻在產(chǎn)生蝦青素、多糖和蛋白質(zhì)的同時，也能積累不同含量的油脂，其油脂含量因藻種品系和培養(yǎng)條件不同而存在差異。季曉敏等[11]采用超臨界CO2流體從破壁的雨生紅球藻藻粉中萃取油脂，經(jīng)甲酯化后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析脂肪酸組成，共鑒定出23種脂肪酸，其中，不飽和脂肪酸占總脂肪酸的71.53%，主要脂肪酸組成為棕櫚酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，組成與植物油脂組成相似。另有研究表明，在正常培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻細(xì)胞中的總脂含量為細(xì)胞干重的12.01%，但在高光、缺氮、高光及缺氮3種脅迫條件下油脂含量顯著提高，分別占細(xì)胞干重的56.92%、46.71%和46.87%；而脂肪酸成分在脅迫條件下無明顯變化，主要的脂肪酸成分為棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸，與此同時，脅迫條件也提高了蝦青素的合成量?？紤]到雨生紅球藻具有混合營養(yǎng)能力，因此，可通過在培養(yǎng)基中添加有機(jī)碳源，實現(xiàn)雨生紅球藻細(xì)胞在高密度生長的同時，獲得較高的油脂和蝦青素產(chǎn)量。相比于光合自養(yǎng)模式，混養(yǎng)培養(yǎng)具有促進(jìn)細(xì)胞生長、聯(lián)產(chǎn)油脂與蝦青素的顯著優(yōu)勢。

3 雨生紅球藻的營養(yǎng)方式與規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)比較

3.1 營養(yǎng)方式 作為一種真核微藻，雨生紅球藻除了能利用CO2、碳酸鹽或碳酸氫鹽為主要碳源進(jìn)行光合自養(yǎng)生長外，還能在有機(jī)碳源存在的條件下進(jìn)行混合營養(yǎng)或異養(yǎng)生長。雨生紅球藻在3種營養(yǎng)方式下生長特性的比較如表1所示[12-13]。與傳統(tǒng)的光合自養(yǎng)生長模式相比，在微藻基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適宜濃度的有機(jī)碳源（例如，乙酸鈉或葡萄糖）可使藻細(xì)胞處于混合營養(yǎng)模式，即光合作用和有機(jī)碳的氧化代謝同時存在，可顯著促進(jìn)雨生紅球藻細(xì)胞的生長，并能促進(jìn)脂質(zhì)和蝦青素的合成，是一種較為理想的培養(yǎng)模式。當(dāng)然，雨生紅球藻是否具備混合營養(yǎng)或異養(yǎng)生長能力，與藻株品種本身的遺傳特性直接相關(guān)，對不同有機(jī)碳源種類的利用及其濃度耐受性也存在較大的種間差異。

表1 2種營養(yǎng)方式下雨生紅球藻的生長特性比較

3.2 規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù) 雨生紅球藻規(guī)模化培養(yǎng)系統(tǒng)可分為開放式和封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)2種類型。其中開放式培養(yǎng)系統(tǒng)主要有開放池或跑道池；封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)主要包括立柱式、管道式、薄膜式、平板式、半球體式光生物反應(yīng)器和貼壁培養(yǎng)技術(shù)等。對雨生紅球藻不同規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)的優(yōu)、缺點比較總結(jié)如表2[13]。不同的培養(yǎng)技術(shù)需要不同的培養(yǎng)設(shè)備、材料和操作參數(shù)，不同技術(shù)也有各自的優(yōu)勢和不足，在實際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)藻種生長特性、培養(yǎng)規(guī)模和產(chǎn)品質(zhì)量要求選擇適宜的技術(shù)。

表2 雨生紅球藻規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)比較

4 雨生紅球藻綜合利用思路及其應(yīng)用

雨生紅球藻具有極高的綜合利用價值。從資源利用價值最大化的角度考慮，應(yīng)依據(jù)生物煉制理念，對雨生紅球藻的胞內(nèi)、外活性物質(zhì)進(jìn)行集成化、全鏈條開發(fā)利用，實現(xiàn)其經(jīng)濟(jì)價值最大化。對雨生紅球藻綜合開發(fā)利用的建議技術(shù)路線如圖2所示。采用光合自養(yǎng)或光合自養(yǎng)與混合營養(yǎng)相結(jié)合的營養(yǎng)模式，通過2步培養(yǎng)法（綠色營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)—刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色孢囊）可獲得藻細(xì)胞密度、蝦青素和其他生物活性物質(zhì)含量較高的雨生紅球藻細(xì)胞[14-15]。藻細(xì)胞經(jīng)過采收、破壁、干燥后可直接作為原輔料，開發(fā)制成功能飼料添加劑、化妝品輔料、畜禽或水產(chǎn)飼料添加劑等；此外，也可用雨生紅球藻藻粉為提取原料，通過集成分離純化技術(shù)，分別制得高純度的蝦青素、脂質(zhì)、藻蛋白和多糖，用于生產(chǎn)保健食品、特效藥品、護(hù)膚品、生物柴油和其他生物制劑，應(yīng)用于醫(yī)藥保健、功能食品、化妝品、功能飼料和生物能源等行業(yè)，實現(xiàn)雨生紅球藻資源的最大化、高值化利用。

5 展望

雨生紅球藻由于富含天然蝦青素、不飽和脂肪酸、優(yōu)質(zhì)蛋白和多糖，具有很高的研究和開發(fā)利用價值。尤其是國內(nèi)、外市場對天然蝦青素的需求旺盛，開發(fā)潛力巨大。但在雨生紅球藻的研究和開發(fā)進(jìn)程中，還存在以下幾個方面的問題需要進(jìn)一步探索解決，為雨生紅球藻資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究支撐：1）雨生紅球藻合成蝦青素、蝦青素酯和脂肪酸的生物合成途徑、中間代謝物轉(zhuǎn)化、合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)與調(diào)控，以及三者之間的相互關(guān)系需要進(jìn)一步深入探究；2）雨生紅球藻培養(yǎng)與蝦青素積累的研究還主要停留在實驗室小試水平，中試和大規(guī)模生產(chǎn)的研究工作相對較少；3）雨生紅球藻蝦青素的研究比較廣泛、深入，但對藻多糖、藻蛋白和油脂的研究尚不全面；4）目前市場上雖有雨生紅球藻藻粉和蝦青素提取物，但市場化開發(fā)的雨生紅球藻產(chǎn)品種類尚不豐富，市場占有率較低。希望通過微藻領(lǐng)域科技產(chǎn)業(yè)技術(shù)人員的通力攻關(guān)，使雨生紅球藻資源能成為造福人民生命健康，助推微藻產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的又一“明星微藻”。