何夢(mèng)如 王 昊 劉雅潔 黃躍平 吳嘉威 趙百孝

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，102488； 2 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心針灸科，北京，100048； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京，100007)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以記憶障礙、認(rèn)知功能障礙以及其他神經(jīng)精神癥狀和行為障礙為主要臨床表現(xiàn)[1]。AD具有發(fā)病率高、危害性大的特點(diǎn)，是全球第7大死亡原因，也是社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本最高的疾病之一[2-3]。AD的2個(gè)核心病理特征是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白異常沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化引發(fā)的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary Tangle，NFT)[4]。有研究認(rèn)為大腦中持續(xù)免疫反應(yīng)的存在已經(jīng)成為AD的第3個(gè)核心病理特征，除了β-淀粉樣蛋白異常沉積形成的老年斑和NFT外，AD患者的大腦還表現(xiàn)出持續(xù)的炎癥反應(yīng)[5]。神經(jīng)炎癥與β-淀粉樣蛋白、NFT相互作用，共同參與AD的發(fā)病機(jī)制，加速AD病變發(fā)展[6-7]。

研究表明，空氣顆粒物污染與AD發(fā)病正相關(guān)[8]。香煙煙霧作為一種常見的空氣污染物，其與AD的關(guān)系一直備受爭(zhēng)議[9-12]。而艾煙作為艾灸療法起效過程中的關(guān)鍵因素之一，具有抗衰老、抗炎、抗氧化等作用及多種生物活性[13-14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一定濃度(5～15 mg/m3)的艾煙可以提高AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能，減少β-淀粉樣蛋白沉積，改善腦內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而延緩AD病理進(jìn)程[15-17]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比觀察艾煙和香煙2種不同的煙霧干預(yù)方式對(duì)APP(β-淀粉樣前體蛋白)/PS1(衰老蛋白1)模型小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積及血清炎癥介質(zhì)的影響，以期探索艾煙對(duì)AD神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制，并驗(yàn)證香煙對(duì)AD的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級(jí)24周齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD動(dòng)物模型，采用同齡相同遺傳背景的雄性C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照，體質(zhì)量28～32 g。小鼠均購(gòu)于北京唯尚立拓生物科技有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0009]，所有小鼠均飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，均自由進(jìn)食飲水，并采用常規(guī)小鼠飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，環(huán)境濕度為(50±5)%，采用半自動(dòng)電路控制飼養(yǎng)室內(nèi)照明，保持12 h光照(8:00～20:00)和黑暗(20:00～次日8:00)交替循環(huán)。實(shí)驗(yàn)過程均遵循2006年國(guó)家科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：BUCM-4-2020011401-1010)。

1.1.2 試劑與儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C反應(yīng)蛋白(CRP)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20210909.60080M;60024M;60199M;60197M)，無水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10009257)，二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10023418)。酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：Multiskan MK3)，石蠟切片機(jī)(LEICA，德國(guó)，型號(hào)：RM2235)，高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：ST16)，光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本，型號(hào)：Eclipse E200)，超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：Forma902GP-ULTS)，訂制小鼠灸用細(xì)艾條(湖北蘄春李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)，規(guī)格φ8 mm×150 mm)，香煙(上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠有限公司，混合型，焦油含量11 mg，尼古丁含量1.1 mg，CO含量12 mg)，玻璃缸(自制，規(guī)格80 cm×80 cm×60 cm)，光散射式數(shù)字微電腦粉塵儀(北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司，型號(hào)：P-5L2C)，小鼠固定器(北京健力園有限公司，規(guī)格150 mm×65 mm×50 mm)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將36只24周齡雄性APP/PS1小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、艾煙組和香煙組，每組12只，12只具有相同遺傳背景的C57BL/6小鼠作為空白組。

1.2.2 干預(yù)方法 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進(jìn)行干預(yù)。將艾煙組小鼠置于小鼠固定器內(nèi)，然后將固定器放入自制玻璃缸中，玻璃缸內(nèi)放置已調(diào)試好的激光粉塵測(cè)試儀。點(diǎn)燃艾條后將艾條放置在玻璃缸角落處，使用USB(通用串行總線)電源驅(qū)動(dòng)小型風(fēng)扇令艾煙均勻地充滿整個(gè)玻璃缸。每隔3 min用粉塵測(cè)試儀測(cè)試其煙霧濃度，使玻璃缸中的艾煙濃度控制在5～15 mg/m3之間。香煙組使用香煙煙霧進(jìn)行干預(yù)，操作同艾煙組。模型組和空白組每天行抓取固定，不做其他干預(yù)。干預(yù)20 min/d，6次/周，共計(jì)8周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 各組干預(yù)結(jié)束后1 d，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)溶液麻醉小鼠，眼球摘除法取血，經(jīng)心臟灌注后取出腦組織，待切片觀察。嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)程序操作，使用剛果紅染色法比較不同組小鼠海馬的β-淀粉樣蛋白沉積變化，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定血清中TNF-α、IL-8、SAA、CRP含量。剛果紅染色：小鼠海馬組織切片后貼在載玻片上，然后依次放置于乙醇氯化鈉溶液中5 min和剛果紅乙醇氯化鈉溶液中30 min，自來水沖洗。隨即進(jìn)行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封固。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，剛果紅染色陽(yáng)性表現(xiàn)為橘紅色顆粒。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法：使用眼球摘除法取血1.0～2.0 mL，置于離心管中靜置1 h左右，離心15 min(4 ℃，2 500 r/min，離心半徑10 cm)。離心后取上層血清放入凍存管中，-80 ℃冰箱中保存待檢測(cè)。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值(A值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值，以A值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上分別計(jì)算出血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP的含量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積情況 空白組小鼠海馬未見明顯橘紅色物質(zhì)沉積，細(xì)胞排列整齊；模型組小鼠海馬可見明顯橘紅色β-淀粉樣蛋白沉積(箭頭所指)，呈點(diǎn)斑片狀，大小不一，細(xì)胞排列散亂、稀疏；香煙組小鼠見大量橘紅色β-淀粉樣蛋白沉積，細(xì)胞排列不整，見較多空隙，細(xì)胞凋亡壞死較嚴(yán)重；艾煙組小鼠海馬見散在橘紅色β-淀粉樣蛋白沉積，細(xì)胞排列整齊，偶見神經(jīng)元缺失造成的空隙。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積情況(剛果紅染色)

2.2 各組小鼠血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP表達(dá)情況

2.2.1 各組小鼠血清TNF-α含量比較 各組小鼠血清中TNF-α的含量由高到低依次是香煙組>模型組>艾煙組>空白組。與空白組比較，模型組、香煙組小鼠血清TNF-α明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，艾煙組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，香煙組小鼠血清TNF-α含量有升高趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，艾煙組小鼠血清TNF-α含量有下降趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與香煙組比較，艾煙組小鼠血清TNF-α含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2.2 各組小鼠血清IL-8含量比較 各組小鼠血清中IL-8的含量由高到低依次是香煙組>模型組>艾煙組>空白組。與空白組比較，模型組、香煙組和艾煙組小鼠血清IL-8均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，香煙組小鼠血清IL-8含量有升高趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，艾煙組小鼠血清IL-8含量明顯下降(P<0.05)；與香煙組比較，艾煙組小鼠血清IL-8含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-8含量比較

2.2.3 各組小鼠血清SAA含量比較 各組小鼠血清中SAA的含量由高到低依次是香煙組>艾煙組>模型組>空白組。與空白組比較，香煙組小鼠血清SAA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均均P>0.05)。見表2。

2.2.4 各組小鼠血清CRP含量比較 各組小鼠血清中CRP的含量由高到低依次是香煙組>模型組>艾煙組>空白組，與空白組比較，模型組、香煙組小鼠血清CRP含量均明顯升高(P<0.05)，艾煙組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，香煙組小鼠血清CRP含量有升高趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，艾煙組小鼠血清CRP含量有下降趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與香煙組比較，艾煙組小鼠血清CRP含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清SAA、CRP含量比較

3 討論

AD的核心病理特征之一是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白異常沉積，而β-淀粉樣蛋白是由APP裂解而來[18]。在正常情況下，APP的產(chǎn)生和降解處于一種動(dòng)態(tài)平衡。然而，當(dāng)APP在體內(nèi)的代謝出現(xiàn)異常時(shí)，β-淀粉樣蛋白生成增多而清除率下降，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白在腦內(nèi)大量沉積，誘發(fā)神經(jīng)毒性[19-20]。因此，抑制β-淀粉樣蛋白聚集和促進(jìn)其降解是治療AD的關(guān)鍵途徑。有研究報(bào)道，以調(diào)節(jié)β-淀粉樣蛋白生成和清除失衡為主要作用的抗β-淀粉樣蛋白藥物未能顯著改善AD患者學(xué)習(xí)認(rèn)知功能，且不良反應(yīng)明顯[21-22]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，艾灸督脈可改善APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能，加速β-淀粉樣蛋白1-42清除，進(jìn)而減少β-淀粉樣蛋白1-42沉積。本課題組前期以載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)-/-小鼠為研究對(duì)象，觀察發(fā)現(xiàn)艾煙能夠發(fā)揮ApoE-/-小鼠的海馬CA3區(qū)保護(hù)作用，減少β-淀粉樣蛋白沉積進(jìn)而提高ApoE-/-小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[23-25]。本研究通過剛果紅染色法和電鏡觀察小鼠海馬的組織形態(tài)，說明艾煙的確能夠有效減少β-淀粉樣蛋白在APP/PS1小鼠腦內(nèi)的沉積，香煙則加重β-淀粉樣蛋白的沉積，可能與艾煙的芳香氣味作用于嗅覺傳導(dǎo)通路的神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

神經(jīng)炎癥是目前比較公認(rèn)的神經(jīng)退行性疾病的重要生理病理特征。由β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)機(jī)制介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia，MG)活化、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，MG活化后不斷分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥介質(zhì)和活性氮簇、活性氧簇等氧化因子，促炎與抗炎穩(wěn)態(tài)平衡被打破進(jìn)而造成腦內(nèi)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，加劇β-淀粉樣蛋白的病理學(xué)沉積，造成神經(jīng)元損傷和大腦記憶認(rèn)知功能障礙，導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的惡性循環(huán)[26-29]。TNF-α是AD最主要的炎癥介質(zhì)之一，與炎癥反應(yīng)過程中的神經(jīng)元毒性、腦細(xì)胞凋亡及認(rèn)知功能減退密切相關(guān)[30]。IL-8是多源性的炎癥介質(zhì)，對(duì)中性粒細(xì)胞有趨化作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其水平可作為跟蹤AD進(jìn)展的有效生物標(biāo)志物[31]。SAA和CRP是機(jī)體急性反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的高度敏感蛋白，主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生，由炎癥介質(zhì)IL-6誘導(dǎo),可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞炎癥反應(yīng)，在AD的神經(jīng)炎癥中起著至關(guān)重要的作用，二者水平具有顯著的相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)可提高炎癥反應(yīng)的檢出率[32-35]。近期的一項(xiàng)尸檢研究顯示，與對(duì)照組比較，AD合并全身性感染患者腦內(nèi)TNF-α和IL-8水平顯著升高[36]。除了中樞系統(tǒng)的變化外，在AD患者中還觀察到外周免疫的促炎變化[37]，實(shí)驗(yàn)表明，在APP/PS1小鼠中也觀察到外周和中樞炎癥反應(yīng)的變化，提示AD外周和中樞的炎癥反應(yīng)之間存在重要的免疫相關(guān)通信[38-39]。因此，檢測(cè)血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP的表達(dá)情況可直接反映AD機(jī)體的炎癥反應(yīng)程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清TNF-α、IL-8、CRP含量明顯增高，艾煙能顯著降低APP/PS1小鼠血清中TNF-α、IL-8和CRP的含量，香煙的作用則完全相反。本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)ApoE-/-小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，艾煙可以降低血清中IL-1、IL-6等炎癥介質(zhì)的含量，減輕炎癥反應(yīng)[40]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。說明艾煙能夠有效抑制炎癥反應(yīng)，可能通過神經(jīng)炎癥機(jī)制在一定程度上改善AD的病理癥狀。

空氣顆粒物污染已日益成為危害人體健康的高風(fēng)險(xiǎn)因素，研究表明暴露于空氣污染物與AD等神經(jīng)退行性疾病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[41]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在中國(guó)，吸煙是許多省死亡率和傷殘調(diào)整壽命年的首要危險(xiǎn)因素[42]。吸煙已被多數(shù)研究證明對(duì)AD具有危害性，香煙煙霧的主要成分包括焦油和尼古丁，有部分學(xué)者認(rèn)為尼古丁能夠抗炎抗氧化進(jìn)而改善AD患者的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力[43]。然而，本研究結(jié)果顯示香煙會(huì)加劇APP/PS1模型小鼠海馬的β-淀粉樣蛋白沉積，促進(jìn)神經(jīng)炎癥的發(fā)生，表明吸煙可能是影響AD發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素?，F(xiàn)代研究通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)艾煙煙霧進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)艾煙中含有多種復(fù)雜成分，其揮發(fā)性成分有氨、醇類(乙二醇、戊基丁醇)、脂肪烴、芳香烴、萜類化合物及其氧化物等[44]。有臨床調(diào)查顯示艾煙的暴露對(duì)針灸師的呼吸健康無明顯影響[45]。從中醫(yī)的角度來說，“煙熏火燎為之灸”“無煙不成艾，無火不成灸”。表明在中醫(yī)艾灸療法過程中，一定濃度的艾煙具備安全性，并且其作用值得重視。本實(shí)驗(yàn)中艾煙作為一種獨(dú)立的干預(yù)因素，能夠在一定程度上減少AD小鼠海馬的β-淀粉樣蛋白沉積，抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而延緩AD病情發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)艾煙能夠有效減少APP/PS1模型小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積，抑制炎癥反應(yīng)，提示可能與AD神經(jīng)炎癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)。艾煙煙霧成分作用于AD相關(guān)的起效機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究和探索。