王 靜 李 敏 何立明 張志佳 檀增桓

(邯鄲市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，邯鄲，056000)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病患者微血管病變常見并發(fā)癥之一，是導致終末期腎功能衰竭的最主要原因[1]。高血糖引起的氧化應激和炎癥反應，以及細胞凋亡是導致糖尿病慢性腎病的關鍵因素[2-5]。因此，DN的主要治療策略是通過控制血糖、高血壓和血脂異常，以預防微量白蛋白尿，降低病死率[6]。但目前的臨床藥物不但可能引起不良反應，而且多數(shù)患者仍然無可避免地發(fā)展成終末期腎臟疾病[7]。

燈盞花素(Breviscapine)是從燈盞花[Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.]中提取的一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗高血脂和降血糖特性，其顯著的抗氧化作用已在多種疾病模型被證實，包括逆轉(zhuǎn)視神經(jīng)損傷，抑制炎癥反應和細胞凋亡對四氯化碳誘導急性肝損傷小鼠顯示出肝臟保護作用，增強H9c2細胞中蛋白激酶B和內(nèi)皮型一氧化氮合酶的磷酸化逆轉(zhuǎn)缺血再灌注損傷[8-11]。因此，被廣泛用于治療各種心血管疾病，包括高血壓、冠心病和心絞痛等[12]。然而，燈盞花素對糖尿病腎臟損傷的作用及其潛在分子機制的研究仍然有限。

本研究旨在通過大鼠模型確定燈盞花素干預是否可以改善糖尿病腎臟侵害，并闡明其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 24只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～280 g，購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004]。飼喂AIN93標準飼料，保證飲用水連續(xù)不間斷，每周換水3～5次，每周更換墊料清洗鼠籠1～2次，飼養(yǎng)室保證安靜通風，光暗周期12/12 h(光照時間8:00～20:00)，恒濕度50%±5%，恒溫(24±2)℃。本研究已通過邯鄲市中心醫(yī)院科研倫理委員會審查(倫理審批號：2019080163)。

1.1.2 藥物 燈盞花素粉末(上海源葉生物科技有限公司，批號：116122-36-2)。

1.1.3 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(上海源葉生物科技有限公司，貨號：18883-66-4)；2-硫代巴比妥酸(TBA)(上海源葉生物科技有限公司，貨號：504-17-6)；血清胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(聯(lián)邁生物公司，貨號：LM-12573-ES)；脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，貨號：SBJ-R0701)；游離脂肪酸(Free Fatty Acid，F(xiàn)FA)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒[上海邦景實業(yè)有限公司，貨號：BJ-(elisa)-2520]；白蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(艾美捷科技有限公司，貨號：589801-96)；肌酐酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(上海圻明生物科技有限公司，貨號：R31871)；超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒(上海研生生化試劑有限公司，貨號：XGH4891)；PRO-PREPTM蛋白提取液(英文特生物技術北京有限公司，貨號：SD-001/SN-002)；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜(Immobilon Millipore)(上海益啟生物科技有限公司，貨號：IEVH00005)；抗p-AMP活化蛋白激酶抗體(賽默飛世爾科技，美國，貨號：700241)、抗AMP活化蛋白激酶抗體(賽默飛世爾科技，美國，貨號：MA5-15815)，抗磷乙酰輔酶A羧化酶(Phospho-acetyl-CoA Carboxylase，p-ACC)抗體(賽默飛世爾科技，美國，貨號：PA5-17725)，抗β-actin(賽默飛世爾科技，美國，貨號：MA5-15739-1MG)、抗核因子E2相關因子2(Nuclear Factor erythroid 2[NF-E2]-related Factor 2，Nrf2)(賽默飛世爾科技，美國，貨號：PA5-27882)、抗Keap1(賽默飛世爾科技，美國，貨號：MA5-17106)、抗血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)(賽默飛世爾科技，美國，貨號：MA1-112)、抗血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)(賽默飛世爾科技，美國，貨號：36-0900)、抗腫瘤特異性生長因子-β1(Tumor-specific Growth Factor-β1，TSGF-β1)[Abcam中國-艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，貨號：ab215715]、抗固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol Regulatory Element-binding Protein,SREBP)1(賽默飛世爾科技，美國，貨號：MA5-11685)、抗SREBP2(賽默飛世爾科技，美國，貨號：PA1-338)，抗脂肪分化相關蛋白(Adipose Differentiation-related Protein,ADRP)抗體(亞諾法生技股份有限公司，貨號：MAB14484)；抗P-GSK-3β抗體(亞諾法生技股份有限公司，貨號：MAB1373)，抗BAX(BCL-2-相關X蛋白)抗體[Abcam中國-艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，貨號：ab32503]，抗裂解胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體[Abcam中國-艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，貨號：ab32042]，蛋白酶K(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：ST532)；ACCU-CHEK血糖儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，愛爾蘭，型號：ACCU-CHEK? Active]；熒光檢測器(湖北捷島科學儀器有限公司，型號：Prominence RF-20A/20Axs)；光學顯微鏡[尼康映像儀器銷售(中國)有限公司，日本，型號：Nikon Eclipse E600 Ti2-U]；透射電子顯微鏡[日本電子株式會社(JEOL)捷歐路(北京)科貿(mào)有限公司，日本，型號：JEM-1200EX II]；圖像分析儀(天津西納國際貿(mào)易有限公司，德國，型號：Gerix 1015)；X射線膠片處理器(Taixing Suxing Company，型號：SX380-E)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將24只Wistar大鼠分為對照組(n=6)、模型組(n=9)和燈盞花素干預組(n=9)。除對照組外，其余大鼠均建立1型糖尿病模型，方法：將4 g燈盞花素粉末溶于700 mL 0.1% EDTA-2Na。然后加入少量NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，再加水定容至1 000 mL，最后溶液過濾、滅菌，封裝在安瓿瓶中備用。使用鏈脲佐菌素按65 mg/kg劑量一次腹腔注射誘導1型糖尿病大鼠模型。注射1周后，連續(xù)2 d上午同一時間尾靜脈取血測隨機血糖，第3天空腹8 h，尾靜脈取血測空腹血糖。連續(xù)2次隨機血糖>16.7 mmol/L，且第3天空腹血糖>11.0 mmol/L即判定為建模成功。

1.2.2 給藥方法 燈盞花素干預組大鼠每日按照80 mg/kg的劑量給予腹腔注射燈盞花素，1次/d，連續(xù)干預8周；對照組和模型組大鼠每日同一時間點給予腹腔注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)干預8周。在干預實驗結(jié)束后，使用3%異氟烷麻醉大鼠。收集血液、尿液和腎臟。其中一個腎臟在液氮中冷凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。另一個腎臟經(jīng)磷酸鹽緩沖液和10%甲醛灌注，用于后續(xù)組織病理學研究。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 尿液中丙二醛含量檢測 尿液樣品用40 mL 2-硫代巴比妥酸預處理，再97 ℃加熱反應1 h。然后將溶液在冰上放置20 min以終止反應。加入甲醇和20%三氯乙酸緩沖液混勻，13 000×g離心6 min。熒光高效液相色譜法測定上清液丙二醛含量，將熒光檢測器設置為525 nm激發(fā)波長，運行時間2 min，流速1 mL/min。

1.2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定血清胰島素、脂聯(lián)素、游離脂肪酸，以及尿液白蛋白、肌酐和SOD水平 按照試劑盒使用說明書，采用血清胰島素、脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒，游離脂肪酸酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒，白蛋白、肌酐酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒，以及SOD酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測試劑盒進行各種因子的含量測定。

1.2.3.3 組織病理學分析 將石蠟包埋腎臟組織制備成5 μm厚切片，使用蘇木精-伊紅染色。在光學顯微鏡下以100、200、400和1 000放大倍數(shù)檢查組織切片。隨后通過圖像分析系統(tǒng)測量每只大鼠40個腎小球的面積，并通過Weibel和Gomez公式計算腎小球體積[13]。

1.2.3.4 電子顯微鏡測量腎小球基底膜厚度及足細胞足突間狹縫孔密度 每個腎臟超薄切片在透射電子顯微鏡下隨機拍攝5～10個30 000×腎小球電子顯微照片，腎小球基底膜厚度為從內(nèi)皮細胞邊界到周圍基底膜上皮細胞邊界的垂直距離(mm)，使用圖像分析儀對腎小球基底膜上足細胞足突之間狹縫孔的數(shù)目進行計數(shù)，再除以腎小球基底膜厚度，來確定狹縫孔密度。

1.2.3.5 蛋白質(zhì)印跡法分析 使用PRO-PREPTM蛋白提取液提取腎皮質(zhì)總蛋白，通過Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測試劑盒進行定量。30 μg蛋白質(zhì)樣品通過12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，在280 mA條件下轉(zhuǎn)移至PVDF膜。然后將膜與5%脫脂牛奶于室溫下在PBS-T緩沖液中孵育1 h封閉。將膜與抗體p-AMP活化蛋白激酶(1∶1 000)、AMP活化蛋白激酶(1∶1 000)和p-ACC(1∶1 000)，或β-actin(肌動蛋白)(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)、Keap1(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000)、TSGF-β1(1∶1 000)、SREBP1(1∶1 000)、SREBP2(1∶1 000)和ADRP(1∶1 000)在封閉緩沖液中于4 ℃孵育過夜。用1×PBST洗滌3次后，再將膜與對應辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標記的山羊抗小鼠二抗在室溫下孵育1 h。使用電化學發(fā)光溶液檢測印跡。使用X射線膠片處理器拍照記錄。經(jīng)NIH成像程序(ImageJ)分析每種蛋白質(zhì)OD值。

1.2.3.6 免疫組織化學染色 腎臟組織切片在0.01%檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中微波處理10～15 min。冷卻后用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)洗滌3次，將組織切片浸入0.1% Triton X-100孵育15 min。為阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，所有組織切片與3%過氧化氫在黑暗中孵育10 min。再將組織切片與10%山羊血清37 ℃孵育60 min，然后與對應一抗P-GSK-3β(1∶200)、BAX(1∶100)和Cleaved Caspase-3(1∶100)在4 ℃孵育過夜。陰性對照切片用PBS代替一抗孵育。將所有切片與HRP標記的山羊抗小鼠二抗在37 ℃下孵育60 min，然后用DAB和蘇木精染色。通過光學顯微鏡分析染色的載玻片，褐色區(qū)域判定為陽性。使用Image-Pro Plus 5.0進行半定量分析。

1.2.3.7 TUNEL染色 腎臟組織切片經(jīng)梯度乙醇脫水后，與蛋白酶K在37 ℃下溫育15 min，用PBS洗滌5 min；模型組和燈盞花素干預組用50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液；而對照組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液。加蓋玻片后于37 ℃下反應60 min。用PBS洗滌3次，再用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色10 min，中性樹膠封片，置于Nikon Eclipse E600 Ti2顯微鏡觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對1型糖尿病大鼠血糖和糖化血紅蛋白水平的影響與對照組比較 模型組大鼠血糖及糖化血紅蛋白含量明顯升高(P<0.05)；燈盞花素干預組大鼠血糖及糖化血紅蛋白水平與模型組比較顯著降低(P<0.05)，接近對照組水平。見圖1。

圖1 各組大鼠血糖和糖化血紅蛋白檢測結(jié)果

2.2 大鼠腎臟組織病理學分析 腎小球HE染色分析結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠有明顯腎小球肥大，腎小球體積顯著增加(P<0.05)，伴有腎小管空泡化，足細胞足突消失；而燈盞花素干預組大鼠腎小球損傷與模型組比較顯著減少，并且腎臟形態(tài)恢復到與對照組相似(P<0.05)。鏡檢結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)節(jié)段性足突融合，腎小球基底膜厚度明顯增加(P<0.05)，足細胞足突之間狹縫孔密度明顯下降(P<0.05)；燈盞花素干預組大鼠腎臟組織病變顯著減輕。見圖2。

圖2 燈盞花素對大鼠腎臟組織形態(tài)變化的影響

2.3 氧化應激水平分析 大鼠尿液中SOD和丙二醛水平檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，燈盞花素干預組大鼠尿液中SOD水平顯著升高，丙二醛水平顯著降低(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠中Nrf2/Keap1蛋白比值和HO-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，燈盞花素干預組大鼠中Nrf2/Keap1蛋白比值和HO-1蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 燈盞花素對大鼠SOD、丙二醛、Nrf2/Keap1和HO-1蛋白表達的影響

2.4 燈盞花素對糖尿病大鼠腎臟脂質(zhì)代謝的影響 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明，與對照組比較，模型組大鼠腎皮質(zhì)組織中AMP活化蛋白激酶和ACC蛋白磷酸化水平均明顯下調(diào)，SREBP-1、SREBP-2和ADRP蛋白表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型組比較，燈盞花素干預組大鼠腎皮質(zhì)組織中AMP活化蛋白激酶和ACC蛋白磷酸化水平顯著上調(diào)，SREBP-1、SREBP-2和ADRP蛋白表達水平均顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖4。

圖4 燈盞花素對糖尿病大鼠腎臟脂質(zhì)代謝的影響

2.5 燈盞花素下調(diào)P-GSK-3β、BAX和Cleaved Caspase-3蛋白表達以抑制糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡 與對照組大鼠比較，模型組大鼠凋亡細胞數(shù)更多，燈盞花素干預組大鼠相較于模型組TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)模型組大鼠腎臟組織P-GSK-3β、BAX和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；燈盞花素干預組大鼠腎臟組織P-GSK-3β、BAX和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著低于模型組(P<0.05)。見圖5。

圖5 大鼠腎臟組織切片原位TUNEL和免疫組織化學(B)檢測

3 討論

隨著研究不斷深入，越來越多的證據(jù)表明氧化應激和細胞凋亡與糖尿病引起的腎功能損害緊密關聯(lián)[14-15]。高血糖會導致腎功能不全，包括尿素氮和血清肌酐升高，尿蛋白增加[16]。腎小球系膜擴張，腎小球基底膜增厚和腎小管損傷是DN的主要組織形態(tài)學改變，這些病理改變均與氧化應激和細胞凋亡有關[17]。因此，抑制氧化應激和細胞凋亡可能是治療DN的潛在機制。SOD活性和丙二醛水平是氧化應激的典型標志[15,18]，本研究結(jié)果表明燈盞花素可以通過增加SOD活性和抑制丙二醛水平來減輕腎臟組織的氧化應激。

越來越多的證據(jù)將腎組織的病理變化與高糖刺激聯(lián)系起來，但其潛在機制尚未闡述清楚[16,19]。本研究采用HE染色和透射電子顯微鏡觀察了燈盞花素干預對糖尿病大鼠模型腎臟形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，燈盞花素能夠逆轉(zhuǎn)糖尿病引發(fā)的腎小球系膜擴增、腎小球基底膜厚度增加、足細胞足突消失，以及足突狹縫孔密度明顯下降的病理損傷。這表明，燈盞花素可保護糖尿病大鼠腎臟組織免受高血糖損害。

盡管DN通常以高血糖引起的代謝和血流動力學變化為特征，但也有證據(jù)指出，脂質(zhì)代謝紊亂在DN的發(fā)展進程中發(fā)揮著至關重要的作用[20-21]。在糖尿病腎小管上皮細胞中游離脂肪酸的積累，脂肪酸作為重要能源來源，表明DN存在能量過剩狀態(tài)[22]。脂肪酸代謝產(chǎn)物(例如二酰基甘油和神經(jīng)酰胺)在非脂肪器官中的積累，會導致細胞毒性和細胞死亡[23-24]。先前研究表明，在DN模型中檢測到激活脂肪酸合成的SREBP-1，以及激活膽固醇生物合成的SREBP-2蛋白表達顯著上調(diào)[25]；Soetikno等[26]報道，提高AMP活化蛋白激酶磷酸化和下調(diào)SREBP-1蛋白表達，可減少腎臟三酰甘油積累。燈盞花素在本研究中可顯著下調(diào)糖尿病大鼠腎臟SREBP-1和SREBP-2蛋白表達水平。ACC磷酸化是AMP活化蛋白激酶調(diào)控脂肪酸氧化的重要效應靶點。ACC將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，阻止脂肪酸氧化[27]。因此，ACC是一種促進脂肪合成的限速酶。本實驗結(jié)果顯示，燈盞花素能逆轉(zhuǎn)糖尿病誘導的ACC磷酸化抑制。

高血糖誘導細胞凋亡是導致腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷的重要誘因，而這種損傷和功能障礙的潛在機制仍不清楚[28-29]。蛋白激酶B磷酸化可以提高糖尿病模型的抗凋亡和抗氧化能力，但氧化應激也能抑制蛋白激酶B磷酸化[30-31]。當?shù)鞍准っ窧磷酸化降低時，其下游因子GSK-3β被磷酸化激活，其他凋亡相關因子如BAX和Cleaved Caspase-3表達增加[32-34]。原位TUNEL細胞凋亡測定結(jié)果表明，高糖誘導大鼠腎臟細胞TUNEL陽性率明顯升高；免疫組織化學分析結(jié)果顯示，燈盞花素干預組p-GSK-3β、BAX和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，燈盞花素改善糖尿病腎損傷與激活AKT信號通路有關。

綜上所述，燈盞花素通過AMPK信號轉(zhuǎn)導通路降低腎臟脂質(zhì)積累，提高SOD活性，激活Nrf2信號通路降低糖尿病大鼠腎臟氧化應激，激活AKT信號通路抑制高血糖刺激誘導的細胞凋亡，以改善腎小球的病理損傷，從而發(fā)揮腎臟保護作用。