葉彩云 高翠玲 張 藝 張 繼

河南省鄭州市第七人民醫(yī)院(450000)

與同一配偶連續(xù)發(fā)生≥2次自然流產(chǎn)被定義為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)。RSA對育齡女性造成生育困擾，由于RSA的致病機(jī)制尚不明確，其治療一直是臨床難題[1]。隨著醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步，miRNA被證實(shí)參與各種生理及病理過程，與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等多種生理活動(dòng)密切相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與不育癥[3]、子宮內(nèi)膜異位癥[4]等生殖系統(tǒng)性疾病之間存在聯(lián)系。Zhao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，原因不明性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)患者蛻膜組織內(nèi)MicroRNA-146a-5p水平異常下調(diào)，且可能通過增強(qiáng)IFN-γ活性，參與URSA；Wen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MicroRNA-515-5p可降低細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。血管生成在妊娠中發(fā)揮重要作用，而血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管生成的主要作用因子，在維持妊娠中具有重要作用[7]。目前關(guān)于RSA患者絨毛組織內(nèi)MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p表達(dá)水平，及其與新生血管間關(guān)系尚不明確，基于以上背景開展本研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

將2018年1月～2020年12月本院收治的RSA 84例(RSA組)以及自愿行流產(chǎn)手術(shù)的正常妊娠婦女60例(對照組)納為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①RSA患者既往自然流產(chǎn)史≥1次；此次妊娠亦診斷為自然流產(chǎn)；孕周7～10周；B超未見胎心搏動(dòng)；絨毛、蛻膜病檢提示絨毛形態(tài)正常。②對照組年齡、孕周與RSA組匹配；既往無不良孕史；此次妊娠無先兆流產(chǎn)癥狀；B超檢查可見胎芽及胎心搏動(dòng)；絨毛、蛻膜病檢提示絨毛形態(tài)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：平時(shí)月經(jīng)紊亂者；本次妊娠期間有急慢性感染史；合并自身免疫性疾??；生殖道畸形；內(nèi)分泌異常；酗酒、吸煙、吸毒等不良習(xí)慣。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，納入對象均簽署知情同意書。

1.2 絨毛標(biāo)本采集

流產(chǎn)手術(shù)均由資歷相當(dāng)?shù)尼t(yī)務(wù)人員完成，術(shù)后收集絨毛組織投入已進(jìn)行DEPC處理的凍存管內(nèi)，-80℃保存待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

①試驗(yàn)儀器：熒光定量PCR儀(美國ABI)、-80℃超低溫冰箱(日本松下)、紫外線分光光度儀(美國Beckman)、低溫臺(tái)式離心機(jī)(德國Eppedorf)、電泳儀(北京六一儀器)、垂直平板電泳槽(美國Bio-Rad)。②實(shí)驗(yàn)試劑：MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p、VEGF逆轉(zhuǎn)錄引物由廣州銳博生物科技有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司，qPT-PCR引物購自廣州銳博，VEGF抗體、U6抗體、β-actin抗兔二抗均購自美國Bioworld公司，DBA顯色試劑盒購自長沙艾杰生物技術(shù)有限公司。BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量法(PCR)

①提取絨毛組織總RNA并檢測純度，取1μl樣本，微量紫外分光光度計(jì)在260nm與280nm波長處測量其OD值，若OD值在1.8～2.0為合格。②逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶oligo(dT)引物，按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit 說明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模型行qPCR。③MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p、VEGF及U6的正向引物序列分別為：5’-TGAGAACTGAATTCCATGGGTT-3’、5'-TTCTCCAAAAGAAAGCACTTTCTG-3',5’-ATGACGAGGGCCTGGAGTGTG-3’、5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物為通用反向引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。④PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系20μl，包括2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，F(xiàn)orward primer 0.7μl，Reverse primer 0.7μl，cDNA 3.0μl，RNase-free H2O 5.6μl，95℃ 3min預(yù)變性，每個(gè)循環(huán)變性95℃ 10s，引物58℃退火延伸，35個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT法對RNA表達(dá)進(jìn)行相對定量。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

絨毛組織研磨為粉末，根據(jù)組織大小加入一定體積裂解液充分裂解，95℃5min使蛋白變性。根據(jù)相關(guān)步驟制作10%SDS-PAGE膠，取24μg總蛋白含上樣緩沖液，總體積30μl，90V電泳30min，待至分離膠時(shí)，120V電泳60～90min，90V，轉(zhuǎn)膜后添加脫脂奶粉封閉1h，TBS液清洗，滴加一抗(MicroRNA-146a-5p 1：200，MicroRNA-515-5p 1：200，VEGF 1:400，β-actin1:5000)，4℃過夜；添加二抗，室溫孵育1～2h，化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影、定影，凝膠成像掃描系統(tǒng)掃描，ImageJ圖像軟件分析，得出各條帶所對應(yīng)的灰度值計(jì)算相關(guān)灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

RSA組年齡(28.4±2.1)歲(25～31歲)，孕周(8.7±1.5)周(7～10周)，流產(chǎn)史(1.7±0.4)次(1～7次)；對照組年齡(29.5±3.3)歲(22～33歲)，孕周(9.0±0.4)周(7～10周)。兩組年齡及孕周無差異(P>0.05)。

2.2 PCR檢測

RSA組MicroRNA-146a-5p(0.48±0.16)及VEGF mRNA(0.31±0.08)表達(dá)量均低于對照組MicroRNA-146a-5p(1.03±0.17)和VEGF mRNA(1.03±0.18)，MicroRNA-515-5p mRNA表達(dá)量(1.29±0.26)高于對照組(0.47±0.15)(均P<0.05)。

2.3 Western Blot檢測

Western Blot檢測結(jié)果見圖1。RSA組患者絨毛組織內(nèi)MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p蛋白表達(dá)量均高于對照組，VEGF蛋白表達(dá)量低于對照組(P<0.05)。

圖1 絨毛組織內(nèi)MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p及VEGF蛋白表達(dá)

2.4 不同流產(chǎn)次數(shù)RSA患者M(jìn)icroRNA-146a-5p及MicroRNA-515-5p表達(dá)水平

隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，RSA患者M(jìn)icroRNA-146a-5p(0.69±0.20)、VEGF mRNA(0.56±0.11)表達(dá)量依次下降為MicroRNA-146a-5p(0.36±0.09)、VEGF mRNA(0.16±0.04)，MicroRNA-515-5p mRNA表達(dá)量(1.02±0.23)上升為(1.57±0.29)(均P<0.05)。見圖2。

圖2 不同流產(chǎn)次數(shù)RSA患者絨毛組織內(nèi)MicroRNA-146a-5p、MicroRNA-515-5p及VEGF蛋白表達(dá)

2.5 RSA組MicroRNA-146a-5p及MicroRNA-515-5p與VEGF關(guān)系

RSA組MicroRNA-146a-5p表達(dá)量與VEGF呈正相關(guān)(r=0.53,P<0.05)，MicroRNA-515-5p與VEGF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.49,P<0.05)。

3 討論

有80%的RSA患者在妊娠12周前發(fā)生流產(chǎn)，RSA給育齡女性帶來極大身心痛苦。引起RSA的因素較多，除染色體異常、生殖器畸形、自身免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病外，還有50%的RSA原因不明[8-9]。積極探索RSA的可能機(jī)制，是臨床治療RSA的基礎(chǔ)。

miRNA是一類長度較短的非編碼RNA，被證實(shí)與多種疾病密切相關(guān)，其中也包括女性生殖性疾病。Zhao L等[6]研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者蛻膜組織中Micr-146a-5p水平低于健康女性，Micr-146a-5p mRNA表達(dá)水平與IRAK1及TRAF6呈負(fù)相關(guān)，Micr-146a-5p可能通過增強(qiáng)IFN-γ活性導(dǎo)致胎盤免疫不耐受，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康婦女組相比，RSA患者絨毛組織內(nèi)Micr-146a-5p mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低，提示Micr-146a-5p可能參與了RSA發(fā)生。

MicroRNA-515-5p被證實(shí)與乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種癌變密切相關(guān)[10-12]。張榮枝[13]等研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的MicroRNA-515-5p能促進(jìn)直腸癌細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率。提示MicroRNA-515-5p可能參與了細(xì)胞的增殖和凋亡。RSA與滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛組織內(nèi)MicroRNA-515-5pmRNA及蛋白表達(dá)水平高于對照組，說明MicroRNA-515-5p可能也參與了RSA發(fā)生。

血管生成是妊娠重要的生理機(jī)制，受精卵著床及胎盤循環(huán)建立均與生理機(jī)制密切相關(guān)。VEGF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生與血管增生，增強(qiáng)血管通透性，改變細(xì)胞外基質(zhì)[14]。有研究表明[15]，VEGF表達(dá)異常將造成胚胎血管生成障礙，最終導(dǎo)致血供不足，胚胎停止發(fā)育與自然流產(chǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RSA組患者絨毛組織內(nèi)VEGF mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯下降。提示VEGF水平下降可能是引起RSA的一個(gè)原因。

此外，本文發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛組織Micr-146a-5p與VEGF水平呈正相關(guān)，MicroRNA-515-5p水平與VEGF水平呈負(fù)相關(guān)。說明Micr-146a-5p水平降低、MicroRNA-515-5p水平升高，可能通過影響VEGF引起流產(chǎn)，共同參與RSA。但以上推論需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

綜上所述，RSA患者絨毛組織Micr-146a-5p表達(dá)下降，MicroRNA-515-5p表達(dá)上升，與VEGF表達(dá)存在相關(guān)性，推測Micr-146a-5p、MicroRNA-515-5p可能通過影響血管生成而引起流產(chǎn)，但具體作用機(jī)制需深入研究。