趙文俊，葉倩君，李偉杰，趙超凡，彭東，杜冰，黎攀

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

由飲酒造成的酒精性肝病（Alcohol Liver Disease，ALD）是世界上最常見的肝疾病之一，近年來，隨著人們對(duì)酒精攝入量的增加，ALD 的發(fā)病率也越來越高，這引起了全世界的關(guān)注[1]。研究表明，氧化應(yīng)激是ALD 發(fā)病的主要機(jī)制，酒精在代謝的過程中產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），進(jìn)而造成機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)異常代謝，嚴(yán)重影響機(jī)體的健康[2]。增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力被認(rèn)為是預(yù)防和治療ALD 的有效方式[3]。近年來，豆類及其加工產(chǎn)品在酒精性肝病已有相關(guān)的研究并取得良好的研究成果，如豆豉[4]、豆粕肽[5]、納豆[6,7]、豆胚[8]，但國內(nèi)外鮮有對(duì)淡豆豉方面的研究，相較于黃豆和納豆，黑豆擁有的異黃酮、花青素等活性物質(zhì)種類和含量更豐富[9]，抗氧化活性也更好[10]。

益生菌發(fā)酵在增強(qiáng)風(fēng)味、減少有效成分破壞[11]、提高發(fā)酵效率[12]等方面有著重要的作用。淡豆豉（Fermented Black Soybeans，F(xiàn)S）是以黑豆為原料，輔以桑葉、青蒿經(jīng)發(fā)酵而成的藥食同源產(chǎn)品。淡豆豉中富含多種活性成分[13]，這些活性成分例如大豆異黃酮、花色苷具備降低膽固醇和保護(hù)心血管疾病的功能，也能通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平來抑制肝損傷。此外，淡豆豉中的溶栓酶是繼納豆激酶之后發(fā)現(xiàn)的一種具有強(qiáng)烈溶解血栓纖維蛋白功能的絲氨酸蛋白酶[9]，已有研究證明溶栓酶在酒精性肝病中有良好的預(yù)防和治療效果[14]，推測(cè)淡豆豉在保護(hù)酒精性肝損傷方面也有積極的作用。

本課題組前期利用乳酸芽孢桿菌DU-106 和中國根霉12 復(fù)合菌種發(fā)酵黑豆并對(duì)其進(jìn)行工藝優(yōu)化得到高大豆異黃酮和高溶栓酶活性的淡豆豉[15]，鑒于此，本研究利用課題組的淡豆豉探究其是否對(duì)急性酒精誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，其研究結(jié)果可以為淡豆豉在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為淡豆豉的高附加值利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

淡豆豉，新資源與功能性原料研究及評(píng)價(jià)中心，其中蛋白質(zhì)45.5 g/100 g，總黃酮20.0 mg/100 g，溶栓酶活性15 531 IU/g[15]；金昭膠囊，無限極有限公司提供，主要原料為葛根、枳椇子、梔子，總黃酮500 mg/100 g；56°紅星二鍋頭白酒，北京紅星股份有限公司；血乙醇（ALC）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）試劑盒、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）、高密度脂蛋白（HDL-c），南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒、細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）試劑盒，武漢華美生物工程有限公司；所用試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

BNR07953 型酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；BA210T 顯微鏡，Motic；YD-315 切片機(jī)，浙江金華益迪試驗(yàn)器材；BMJ-A 包埋機(jī)常州中威電子儀器；5180R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)屏障環(huán)境，許可證編號(hào)：SYXK（粵）2014-0136。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和倫理規(guī)則飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度23 ℃，相對(duì)濕度40%，明暗交替各12 h，通風(fēng)條件良好。

1.2.2 淡豆豉對(duì)急性酒精中毒大鼠的降血醇作用

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組和淡豆豉組，每組6只，正常組和模型組灌胃0.9wt%生理鹽水，陽性對(duì)照組灌胃2 g/(kg·bw)金昭膠囊，淡豆豉組灌胃0.5 g/(kg·bw)淡豆豉，每天2 次，間隔4 h。末次給藥30 min 后，除正常組以外，各組灌胃給予52°紅星二鍋頭白酒12 mL/(kg·bw)造成SD 大鼠急性酒精中毒，空白組給予等量的0.9wt%生理鹽水。分別于灌胃酒精后的1、2、4 h 對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶靜脈從采血。

1.2.3 淡豆豉對(duì)急性酒精中毒大鼠的解酒機(jī)制研究

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分為正常組（NC，0.9%生理鹽水）、模型組（MC，0.9%生理鹽水）、陽性對(duì)照組（P，2 g/(kg·bw)金昭膠囊）、淡豆豉低劑量組（LFS，0.5 g/(kg·bw)）、淡豆豉高劑量組（HFS，1 g/(kg·bw)），每組8 只。各組大鼠每天灌胃各組相應(yīng)的樣品，每天1 次，持續(xù)7 d，末次給藥30 min 后，除正常組以外，各組灌胃12 mL/(kg·bw)的52°紅星二鍋頭白酒[16,17]，禁食不禁水12 h 后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔動(dòng)脈采血，取大鼠的肝臟于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血清與肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定

將采集的血樣立即置于4 ℃冰箱自然沉降1 h 后，于冷凍離心機(jī)離心（4 ℃，3 000 r/min）15 min，取上清液待測(cè)。血清生化指標(biāo)ALC、AST、ALT、ALP、ADH、ALDH、CYP2E1、TC、TG、LDL-C、HDL-c 等指標(biāo)按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)；血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平按酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定。

稱取約0.2 g 肝臟組織加入9 倍體積的生理鹽水（m:V=1:9）于研磨機(jī)中研磨，離心（4 ℃，3 000 r/min）15 min，取上清液待測(cè)。按試劑盒說明書方法檢測(cè)肝臟中AST、ALT、ALP、ADH、ALDH、CYP2E1、CAT、SOD、GSH-Px 酶活。

1.2.5 肝組織形態(tài)學(xué)分析

取肝左葉同一部位組織塊，立即置入10%的中性甲醛中固定24 h，乙醇梯度脫水后進(jìn)行石蠟包埋與蘇木精-伊紅染色法（HE 染色）[18]，采像為普通光學(xué)顯微鏡采集，挑選出具有代表性的圖片。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用軟件SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同實(shí)驗(yàn)組組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用GraphPad Prism 8 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡豆豉對(duì)大鼠血清乙醇濃度的影響

由表1可知，正常組乙醇濃度為零，模型組乙醇濃度高于其它組，說明急性酒精中毒造模成功。酒后2 h 模型組大鼠血乙醇濃度急劇上升（1 294.05 mg/L），顯著高于陽性對(duì)照組和淡豆豉組（p<0.01），酒后4 h，各組大鼠的血醇濃度降低，淡豆豉組大鼠血醇水平最低，為560.36 mg/L，與模型組相比（1 044.71 mg/L）差異達(dá)到極顯著水平（p<0.01）。結(jié)果表明，淡豆豉能夠有效抑制血乙醇濃度的升高并具有降血醇作用，該實(shí)驗(yàn)為后續(xù)淡豆豉解酒機(jī)制提供依據(jù)。

表1 淡豆豉對(duì)急性酒精中毒大鼠血醇濃度的影響(mg/L)Table 1 Effect of fermented beans on blood alcohol concentration in rats with acute alcohol intoxication (mg/L)

2.2 淡豆豉對(duì)急性酒精性肝損傷大鼠保護(hù)機(jī)制研究

2.2.1 淡豆豉對(duì)大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

體質(zhì)量被認(rèn)為是公認(rèn)的健康指標(biāo)。在本研究中，初始大鼠體質(zhì)量沒有顯著差異，7 d 后正常組大鼠體質(zhì)量大于其他組，而淡豆豉低劑量組和淡豆豉高劑量組大鼠體質(zhì)量低于模型組（p<0.05），而正常組大鼠體質(zhì)量最高，達(dá)到了332.24 g，這可能是由于灌胃樣品的能量影響了動(dòng)物的攝食所導(dǎo)致的。模型組肝臟指數(shù)（4.00%）與正常組（4.09%）相比沒有顯著差異，而與模型組相比，低、高劑量淡豆豉組顯著小于模型組（p<0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性酒精誘導(dǎo)可造成大鼠肝臟指數(shù)增加，經(jīng)淡豆豉治療的大鼠可以降低其肝臟指數(shù)。

表2 不同組別大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)Table 2 Body weight and liver weight of different groups of rats

2.2.2 淡豆豉對(duì)大鼠血清和肝損傷相關(guān)指標(biāo)的影響

酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制可能與氧化應(yīng)激和炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)[19,20]，急性肝損傷早期表現(xiàn)為細(xì)胞壞死或膜通透性的改變，導(dǎo)致ALP、ALT、AST 釋放到血液中，增加血清中ALP、ALT、AST 的活性，因此，ALP、ALT、AST 通常作為監(jiān)測(cè)肝損傷的指標(biāo)[21,22]。有報(bào)道表明黑豆肽能夠顯著降低高脂大鼠AST、ALT和血脂的水平，并減輕氧化應(yīng)激[23,24]，Pan 等[25]揭示豆粕肽處理能夠使酒精性肝損傷大鼠AST 和ALT 的水平下降。本研究結(jié)果如圖1所示，與正常組相比，大鼠血清AST、ALT 和ALP 的水平均顯著高于正常組（p<0.01），分別提高了126.17%，79.93%和41.53%，說明急性酒精性中毒能導(dǎo)致大鼠肝損傷相關(guān)指標(biāo)水平急劇上升，造模成功。如圖1a 所示，與模型組相比，淡豆豉低、高劑量組血清AST 水平降低了20.98%、35.26%，且高劑量組差異達(dá)到顯著水平（p<0.05），低劑量組沒有顯著差異；圖1b 說明淡豆豉和金昭膠囊能夠降低血清ALT 酶活；如圖1c 所示，各治療組均能降低大鼠血清中ALP 酶活，差異達(dá)到極顯著水平（與模型組相比，p<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性酒精中毒能夠?qū)е麓笫蠹毙愿螕p傷，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)指標(biāo)的水平上升，而淡豆豉通過降低血清AST、ALT、ALP 的酶活抑制肝損傷程度。

圖1 大鼠血清中肝損傷相關(guān)酶的水平Fig.1 Levels of liver injury-related enzymes in serum of rats

2.2.3 淡豆豉對(duì)大鼠血脂代謝的影響

脂質(zhì)代謝紊亂是酒精性肝損傷的表現(xiàn)之一，酒精促進(jìn)TC 和TG 的合成，TC 和TG 可通過HDL-C 從肝臟轉(zhuǎn)移到外周部位，增加肝臟脂質(zhì)含量，從而導(dǎo)致ALD 惡化[26]。如圖2a 所示，與正常組相比，急性酒精性肝損傷導(dǎo)致TC 水平上升29.25%，差異極顯著（p<0.01）。而與模型組相比，陽性對(duì)照組和淡豆豉組都能顯著的抑制TC 上升（p<0.01），且淡豆豉高劑量較低劑量效果好（與模型組相比，下降30.43%），與陽性對(duì)照組并無差別；同樣地，與模型組相比，各給藥組也能顯著降低TG 的水平，模型組TG 水平高于正常組，但是差異不顯著（圖2b）。如圖2c 和圖2d所示，急性酒精性肝損傷對(duì)LDL-c 和HDL-c 的水平?jīng)]有明顯的影響，淡豆豉高劑量組可顯著降低LDL-c水平。結(jié)果表明，淡豆豉可以改善酒精誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂，可以顯著降低血清TC 和TG 的水平，這與PAN[25]的研究結(jié)果相似。

圖2 大鼠血清血脂四項(xiàng)的含量Fig.2 Levels of the four lipids in serum of rats

2.2.4 淡豆豉對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響

過度飲酒還會(huì)刺激肝巨噬細(xì)胞活化并產(chǎn)生促炎因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進(jìn)而加速炎癥的發(fā)生[27]。如圖3所示，與正常組相比，模型組中TNF-α、IL-1β和IL-6 的水平分別上升88.01%、212.85%和67.00%，差異達(dá)到極顯著水平（p<0.01），除淡豆豉高劑量組對(duì)TNF-α水平抑制效果不顯著外，陽性對(duì)照組和淡豆豉組均能夠抑制由酒精誘導(dǎo)的炎癥因子水平升高，且抑制效果極顯著（p<0.01），說明淡豆豉可通過抑制炎癥因子的釋放而降低炎癥反應(yīng)。有研究表明PFP-1 抑制酒精性肝損傷大鼠炎癥因子的上升，抑制效果最高55%[28]，而本研究淡豆豉對(duì)IL-1β的抑制率達(dá)到了72.02%。其它研究也證明降低AST、ALT、血脂和炎癥等水平是防止肝組織進(jìn)一步損傷和炎癥反應(yīng)的有效方式之一[29,30]，與本研究的結(jié)果類似。然而，AST、TC 和TNF-α這些指標(biāo)只能一般性地反映肝臟發(fā)生了損傷和炎癥的發(fā)生，具體淡豆豉對(duì)酒精肝損傷的護(hù)肝機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

圖3 大鼠血清炎癥因子水平Fig.3 Levels of inflammatory factors in serum of rats

2.2.5 淡豆豉對(duì)大鼠血清和肝臟乙醇代謝相關(guān)酶的影響

酒精在機(jī)體內(nèi)代謝有氧化和非氧化途徑，在脫氫酶系統(tǒng)中，乙醇被ADH 轉(zhuǎn)化為乙醛，然后被ALDH氧化為乙酸，第二個(gè)主要途徑是微粒體乙醇氧化系統(tǒng)（MEOS），其通過CYP2E1 進(jìn)行酒精代謝[31]。直接參與機(jī)體內(nèi)酒精代謝有關(guān)酶的水平如圖4和圖5所示，與正常組相比，模型組血清和肝臟中ADH 水平降低了60%左右，且模型組血清中ADH 與正常組相比差異極顯著（p<0.01）。而經(jīng)金昭膠囊或淡豆豉干預(yù)的大鼠，其ADH 的水平高于模型組；CYP2E1 是參與酒精代謝另一途徑的相關(guān)酶，如圖4c 和圖5c 所示，與正常組相比，模型組CYP2E1 含量顯著升高（p<0.01），陽性對(duì)照組、淡豆豉低劑量和高劑量組血清中CYP2E1 的水平分別下降了 46.24%、30.06%和35.29%，顯著低于模型組（p<0.01）。在肝臟中CYP2E1的水平也低于模型組，但差異不顯著（p>0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，酒精刺激能夠降低大鼠血清、肝組織中ADH、ALDH 酶活，同時(shí)，提高CYP2E1 的質(zhì)量濃度，經(jīng)淡豆豉干預(yù)能提高ADH 和ALDH 的酶活，降低CYP2E1 水平。

圖4 大鼠血清乙醇代謝相關(guān)酶的水平Fig.4 Levels of enzymes related to ethanol metabolism in serum of rats

圖5 大鼠肝組織中乙醇代謝相關(guān)酶的水平Fig.5 Levels of enzymes related to ethanol metabolism in liver of rats

2.2.6 淡豆豉對(duì)大鼠肝臟抗氧化相關(guān)酶的影響

酒精通過上述途徑代謝會(huì)產(chǎn)生過多的ROS，ROS又會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和肝臟氧化應(yīng)激，過量的自由基可被SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶清除，例如，在SOD 的作用下，超氧陰離子與氫離子反應(yīng)生成過氧化氫，并在CAT 的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為水，從而抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激[32]，因此，抗氧化能力在ALD 中發(fā)揮著重要的作用。如圖6所示，酒精處理使CAT、SOD 和GSH-Px 的水平降低了56.51%、37.45%和48.17%，顯著低于正常組（p<0.01），而對(duì)大鼠進(jìn)行為期7 d 的淡豆豉或者金昭膠囊前處理能夠不同程度得阻止肝臟抗氧化酶活的降低。如圖6a 和圖6c 所示，淡豆豉低、高劑量組均能極顯著提高CAT 和SOD 的活力（p<0.01），與模型組相比，金昭膠囊能夠提高CAT 活力，但沒有顯著差異（p<0.05）。圖6b 中高劑量淡豆豉與模型組相比能夠極顯著提高GSH-Px 酶活（p<0.01），而低劑量提升效果沒有顯著差異（p<0.01）。酒精的代謝依賴于ADH、ALDH 和CYP2E1 的水平，代謝過程中產(chǎn)生的活性氧由抗氧化酶清除[31]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明淡豆豉能提高酒精代謝相關(guān)酶的水平，進(jìn)而加快酒精代謝，并提高抗氧化酶的活力以清除ROS。Wu 等[33]研究表明黑豆具有更高的抗氧化能力，能顯著降低肝臟脂質(zhì)過氧化水平。在本研究中，淡豆豉一方面可以通過提高ADH 和ALDH 的酶活，加快乙醇在體內(nèi)的代謝。另一方面，還能提高SOD、CAT、GSH-Px 酶活消除乙醇代謝產(chǎn)生的ROS，并抑制細(xì)胞色素P4502E1（CYP2E1）的誘導(dǎo)作用，與前人的研究結(jié)果類似。因此，淡豆豉干預(yù)這兩條通路的相關(guān)酶來達(dá)到解酒護(hù)肝的效果。

圖6 大鼠肝臟抗氧化酶的水平Fig.6 Levels of antioxidant-related enzymes in liver of rats

2.2.7 淡豆豉對(duì)大鼠肝組織形態(tài)的影響

為探究急性酒精中毒對(duì)大鼠肝細(xì)胞是否有影響，對(duì)大鼠肝組織形態(tài)進(jìn)行觀察。如圖7所示，正常組肝細(xì)胞完整，分布均勻，呈規(guī)則的球狀，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤。而模型組肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡，脂肪滴，表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性的損傷。相較于模型組，淡豆豉干預(yù)后能夠減輕肝細(xì)胞的損傷，偶見少量的空泡，肝索排列整齊，肝細(xì)胞無明顯變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變，其形態(tài)接近于正常組。結(jié)果表明，淡豆豉能夠減輕急性酒精誘導(dǎo)的肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)性損傷，具有護(hù)肝作用。

圖7 大鼠肝組織切片F(xiàn)ig.7 Histopathological section of the liver of rats

3 結(jié)論

本研究初步證明淡豆豉是通過降低炎癥通路下游因子的釋放和增強(qiáng)抗氧化通路中SOD、CAT 等抗氧化酶活性來改善大鼠急性酒精性肝損傷，但是本研究還未探索與哪一炎癥通路和抗氧化通路有關(guān)聯(lián)。綜上，本研究以急性酒精性肝損傷大鼠為模型，對(duì)淡豆豉解酒護(hù)肝作用機(jī)制進(jìn)行研究，其結(jié)果表明，淡豆豉能降低酗酒大鼠血醇濃度，降低血清AST、ALT、ALP 的水平，抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放以降低炎癥反應(yīng)，并提高肝臟中ADH、ALDH、CAT 等抗氧化酶活性，進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，達(dá)到解酒護(hù)肝的目的。本研究表明藥食同源淡豆豉可作為解酒護(hù)肝的保健品，同時(shí)為黑豆及其加工產(chǎn)品的高附加值應(yīng)用提供理論依據(jù)。