李金玲，李佳濱，元紅權(quán)，蔣文藝，劉海強，秦雪梅，林春梅*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春 130118）（2.長春通源醫(yī)院，吉林長春 130012）

在全球范圍內(nèi)，每年大約有200 萬例的人因慢性肝炎、酒精性或非酒精性肝病、環(huán)境因素、以及藥物引起的毒性，導致肝纖維化、肝硬化、以至于肝癌[1,2]。因此，肝病一直都受到科學家們的關(guān)注，甲醛（Formaldehyde，F(xiàn)A）是一種高活性的危險化學物質(zhì)，不僅具有極強的反應性，可迅速與硫醇和大分子結(jié)合導致DNA 損傷[3]，且與呼吸道疾病、過敏、白血病、腦癌等疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[4-7]，現(xiàn)甲醛已被國際癌癥研究機構(gòu)列為1 類人類致癌物[8]。此外，Duan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)，甲醛充當促氧化劑或降低抗氧化劑水平從而破壞氧化平衡，顯著增加自由基含量，且過量的活性氧產(chǎn)生會導致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物的不可逆氧化修飾[10,11]。若甲醛經(jīng)口腔進入機體會增加炎癥細胞因子的釋放，肝細胞的凋亡，粘附分子的表達和白細胞的浸潤，在短時間內(nèi)會引起肝功能異常，最終導致肝臟受損[12-14]。且目前尚無特異性解毒劑可用于治療甲醛誘導的器官毒性。

大量的研究表明，補充具有抗氧化特性的天然化合物（如多酚、黃酮等）在預防肝臟損傷方面有著重要作用[15,16]。鞣花酸（Ellagic Acid，EA）是石榴中主要的酚類之一[17]，具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗癌、抗凋亡等作用[18-21]。有研究表明，鞣花酸可以激活氧化防御系統(tǒng)，對自由基具有強效清除作用，并抑制脂質(zhì)過氧化[22-24]。此外，鞣花酸可減少炎癥因子的產(chǎn)生，如IL-6、IL-8 和TNF-α等[25]。本實驗為了探究鞣花酸是否對甲醛誘導的肝損傷具有保護作用，采用灌服甲醛來建立小鼠肝臟損傷模型，并給予兩種不同濃度鞣花酸溶液進行干預，探討鞣花酸對甲醛誘導的小鼠肝臟損傷的作用及其機制，為減緩甲醛誘導的肝損傷提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

甲醛溶液（37%～40%），西隴化工股份有限公司；鞣花酸（純度≥95%），Sigma 公司（貨號：E2250）；Bradford 蛋白含量檢測試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（貨號：KGA804）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒-WST，東仁化學科技(上海)有限公司（貨號：S311）；TRIzol reagent kit，美國Invitrogen 公司（貨號：15596-026）；Prime ScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser kit，寶生物工程（大連）有限公司（貨號：RR047A）；TB Green? Premix Ex Taq? II kit，寶生物工程（大連）有限公司（貨號：RR820A）；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號：C0105）。

1.1.2 主要儀器

超微量分光光度計，美國Nano Drop 公司；微孔板分光光度計，美國伯騰儀器有限公司；熒光定量PCR 儀，德國耶拿分析儀器股份公司；HistoCore Arcadia H 熱石蠟包埋機，德國Leica 公司；半自動輪轉(zhuǎn)式切片機，德國Leica 公司；BX53F 光學顯微鏡，日本OLYMPUS 公司。

1.1.3 實驗動物

32 只8 周齡SPF 級雄性ICR 小鼠（35～40 g），購于遼寧省長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物許可號SCXK（遼）2020-0001。適應性飼養(yǎng)一周后進行實驗，實驗期間小鼠自由飲食飲水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備

將32 只雄性ICR 小鼠隨機分為四組：對照組（生理鹽水）、甲醛模型組（333 mmol/L 甲醛溶液）、鞣花酸低劑量組（33 mmol/L 鞣花酸溶液）和高劑量組（66 mmol/L 鞣花酸溶液），分別連續(xù)灌胃14 d。每日上午給予對照組小鼠生理鹽水，除對照組外，其它組分別給予小鼠333 mmol/L 甲醛溶液；下午給予對照組與模型組小鼠生理鹽水，用藥組小鼠分別給予不同濃度鞣花酸溶液。

1.2.2 肝臟指數(shù)的計算

分別稱量解剖前小鼠的體重和解剖后小鼠的肝臟重量，根據(jù)以下公式進行計算：

式中：

A——肝臟指數(shù)；

m1——肝臟質(zhì)量，g；

m0——小鼠質(zhì)量，g。

1.2.3 肝組織病理學觀察

解剖后取小鼠肝臟組織置于10wt%中性福爾馬林溶液中，進行固定。將固定好的肝臟組織進行脫水、包埋，切片（5 μm），進行蘇木精-伊紅（H&E）染色，并在光學顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織的形態(tài)特征。

1.2.4 氧化損傷指標檢測

脂質(zhì)過氧化檢測：取-80 ℃冷凍儲存的肝臟組織，按照試劑盒說明書，將肝臟組織制成勻漿液，加入試劑，95 ℃孵育30 min 后，在波長532 nm 下測量OD值并進行計算。

超氧化物歧化酶活性檢測：按照試劑盒說明書，制備肝臟勻漿液，配置WST 的工作液和酶的工作液，加入試劑后，在37 ℃培養(yǎng)20 min，用酶標儀在450 nm處讀數(shù)并進行計算。

1.2.5 實時熒光定量PCR 檢測

使用TRIzol 試劑盒提取小鼠肝臟的總RNA，測定其濃度后，按照Prime Script?RT 試劑盒和gDNA Eraser試劑盒的說明書，將2 μg總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。根據(jù)TB Green?PremixEx Taq?II 試劑盒的要求，以逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA 為模板，采用表1所示引物，進行實驗，并以GAPDH 引物作為目的基因轉(zhuǎn)錄表達的內(nèi)參基因。

表1 熒光定量PCR 分析所用引物Table 1 Primer used for quantitative real-time PCR analysis

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad 7.0 版本，對得到數(shù)據(jù)進行單因素方差的分析（one-way ANOVA），計量資料以Mean±SEM.表示。其中，p<0.05，表明差異具有統(tǒng)計學意義；p<0.01，表示差異具有高度統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠肝臟指數(shù)水平變化

在李亞琳[26]的研究中，隨著甲醛染毒劑量以及染毒時間的增加，肝臟指數(shù)逐漸減小，說明甲醛增加了肝臟的代謝負荷，即可能通過影響附加生理或生化負荷的代償能力，從而使其代謝能力降低，間接導致了肝臟組織的損傷。本實驗中，小鼠肝臟指數(shù)如表2所示，雖然各組之間無顯著性差異（p>0.05），但與對照組相比，甲醛模型組小鼠肝臟指數(shù)降低了3.63%；與模型組相比，給藥組小鼠肝臟指數(shù)隨藥物濃度增加而升高，其中鞣花酸高劑量組增加了9.14%。小鼠肝臟指數(shù)的升高表明鞣花酸緩解了甲醛誘導的肝損傷。

表2 小鼠肝臟指數(shù)Table 2 Liver index in mice

2.2 小鼠肝臟組織的形態(tài)學變化

如圖1所示，與對照組相比，甲醛模型組小鼠肝索排列紊亂，肝細胞的形態(tài)異常（小空泡，雙核，肝細胞核腫大），說明甲醛對肝臟造成了損傷。與模型組相比，經(jīng)鞣花酸處理的小鼠肝索排列整齊，肝細胞中空泡減少，肝細胞質(zhì)均勻分布，表明鞣花酸可減緩甲醛誘導的肝損傷。

圖1 鞣花酸對甲醛誘導的小鼠肝損傷的組織學變化的影響(400x)Fig.1 Effect of ellagic acid on histopathological changes in formaldehyde-induced liver injury in mice

2.3 小鼠肝臟組織的氧化損傷分析

氧自由基反應和脂質(zhì)過氧化反應在機體的新陳代謝中起著重要的作用，并且處于動態(tài)平衡，若平衡被打破，則會引起新陳代謝失常、形成氧自由基連鎖反應，損害生物膜及其功能，以致形成細胞透明性病變造成組織、器官等損傷[27]。MDA 是脂質(zhì)過氧化后形成的主要產(chǎn)物，并且作為判斷氧化損傷的常用參數(shù)之一[28,29]。超氧化物歧化酶是用于證明與氧化應激相關(guān)損傷的抗氧化酶[30]，它的活性變化被認為是氧化應激的標志。有研究表明，甲醛可以通過促進體內(nèi)氧自由基的生成和降低抗氧化酶的活性而引起機體的氧化損傷[31]。Teng 等[32]將離體大鼠肝細胞暴露于甲醛中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化水平和ROS 含量增加，導致肝細胞氧化損傷。在本研究中，與對照組相比，甲醛模型組小鼠肝組織的MDA 濃度62.84 nmol/mg，顯著升高（p<0.01）；相反，鞣花酸低劑量組小鼠肝組織的MDA 濃度為38.51 nmol/mg，鞣花酸高劑量組小鼠肝組織的MDA濃度為43.25 nmol/mg，與甲醛模型組相比，鞣花酸處理后，MDA 含量下降，分別下降了38.71%和31.17%，圖2a。小鼠肝組織的中SOD 活性變化如圖2b 所示，甲醛模型組小鼠肝組織的SOD 活性為0.84 U/mg，甲醛模型組SOD 活性較對照組降低了17.65%；鞣花酸低劑量組小鼠肝組織的SOD 活性為0.90 U/mg，鞣花酸高劑量組小鼠肝組織的SOD 活性為1.09 U/mg，與甲醛模型組相比，鞣花酸用藥組SOD 活性呈劑量相關(guān)上升。圖2c、2d 為小鼠肝臟組織中SOD1、SOD2mRNA的表達水平，可發(fā)現(xiàn)甲醛模型組SOD1和SOD2的表達水平與對照組相比降低到 0.58 和 0.56（p<0.01），與甲醛模型組相比，鞣花酸低劑量組SOD1和SOD2的表達水平升高到0.98 和0.98（p<0.01），鞣花酸高劑量組SOD1和SOD2的表達水平升高到1.23和1.11（p<0.01）。

圖2 小鼠肝臟組織氧化損傷水平變化Fig.2 The change of oxidative damage in mice liver

以上結(jié)果表明，甲醛暴露引起了小鼠肝組織中MDA 含量的升高、SOD 活性和SOD1、SOD2mRNA的表達水平的降低，說明肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，抗氧化防御機制被破壞，從而導致了肝臟的氧化損傷。而經(jīng)鞣花酸干預后MDA 的含量下降，SOD 的活性和SOD1、SOD2mRNA 的表達水平上升，說明鞣花酸通過其抗氧化作用緩解了甲醛誘導的氧化應激損傷。

2.4 小鼠肝臟NF-κB 的表達水平分析

NF-κB 是許多信號通路中的關(guān)鍵因子，尤其是在炎癥、免疫、細胞增殖和凋亡中。Li 等[33]利用脂多糖誘導肝損傷，通過免疫印跡分析磷酸化NF-κB 的情況，結(jié)果表明LPS 的攻擊明顯增加磷酸化NF-κB 的表達，說明NF-κB 信號傳導在受損肝細胞中被激活。在本實驗中，與對照組相比，甲醛模型組小鼠肝組織的NF-κBmRNA 的表達水平升高至1.54（p<0.01）；相反，與甲醛模型組相比，鞣花酸用藥組小鼠肝組織的NF-κBmRNA 的表達水平顯著降低（p<0.01），低劑量組降低至0.78，高劑量組降低至0.49，圖3所示。數(shù)據(jù)表明鞣花酸在甲醛誘導的肝損傷中可降低NF-κB信號傳導來發(fā)揮保護作用。

圖3 小鼠肝臟NF-κB 表達水平Fig.3 The gene expression level of NF-κB

2.5 小鼠肝臟炎癥因子的表達水平分析

有研究表明，甲醛刺激細胞因子的產(chǎn)生，這些細胞因子影響參與炎癥和巨噬細胞介導的免疫的iNOS的代謝[34]。Fethullah 等[35]的研究中指出暴露于甲醛的大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和YKL-40 水平升高，表明甲醛類似于誘導細胞因子合成的激活劑，誘導炎癥級聯(lián)反應并增加關(guān)鍵細胞因子的水平。本實驗中，與對照組相比，甲醛模型組小鼠肝組織的IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 的表達水平升高，分別升高到1.06、1.10和1.11；相反，與甲醛模型組相比，鞣花酸用藥組小鼠肝組織的IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 的表達水平顯著降低（p<0.01），其中鞣花酸低劑量組炎癥因子表達水平分別降低至0.63（IL-1β）、0.87（IL-6）和0.85（TNF-α），鞣花酸高劑量組炎癥因子表達水平分別降低至0.61（IL-1β）、0.38（IL-6）和0.79（TNF-α），圖4所示。在本研究，甲醛引起小鼠肝組織中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 的表達水平增加，說明甲醛導致肝臟出現(xiàn)炎癥反應，而鞣花酸通過其具有的抗炎作用，降低了甲醛引起的肝臟組織的炎癥反應。

圖4 小鼠肝臟炎癥因子的表達水平Fig.4 The gene expression level of inflammatory factor

2.6 小鼠肝臟凋亡因子的表達水平分析

甲醛導致ROS 的產(chǎn)生，誘導細胞凋亡和壞死[36,37]。Caspase 在細胞凋亡的早期階段被激活，Caspase-3 充當細胞凋亡的終止子[38]。Bax 是線粒體應激誘導凋亡通路下游的效應分子[39]。Sapmaz 等[40]將成年大鼠暴露于甲醛中，使其吸入甲醛，并利用免疫組織化學檢查大鼠氣管上皮組織中Bax和Caspase-3 的表達，發(fā)現(xiàn)甲醛組Bax 和Caspase-3 蛋白表達水平較高，說明甲醛導致氣管上皮細胞凋亡。所以在本實驗中通過對凋亡因子（Bax 和Caspase-3）表達水平的分析，來測定肝細胞的凋亡情況。如圖5所示，與對照組相比，甲醛模型組小鼠肝組織的Bax、Caspase-3mRNA的表達水平顯著上升（p<0.01），分別上升到1.29 和1.27，與甲醛模型組相比，鞣花酸低劑量組和高劑量組小鼠肝組織的Bax、Caspase-3mRNA 的表達水平顯著降低（p<0.01），低劑量組Bax和Caspase-3的表達水平顯著降低至0.70 和0.96，低劑量組Bax和Caspase-3的表達水平顯著降低至0.68 和0.93。甲醛染毒的模型組Bax和Caspase-3mRNA 的表達水平升高，誘導了肝臟細胞凋亡。經(jīng)鞣花酸處理后Bax、Caspase-3mRNA的表達水平顯著下降，減少了肝細胞的凋亡。

圖5 小鼠肝臟凋亡因子的表達水平Fig.5 The gene expression level of Bax,Caspase-3 in mice liver

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明甲醛暴露可引起小鼠肝臟組織發(fā)生氧化應激損傷，并誘導炎癥反應發(fā)生，細胞凋亡，而經(jīng)鞣花酸干預后損傷程度均有所緩解，說明鞣花酸通過其抗氧化，抗炎和抗凋亡的特性對甲醛誘導的小鼠肝損傷具有一定的保護作用。