陳文穎，周世水*，閆統(tǒng)帥，梁思宇

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.廣東石灣酒廠集團(tuán)股份有限公司，廣東佛山 528031）

黃酒是我國(guó)的民族特產(chǎn)之一，風(fēng)味獨(dú)特，富含礦物質(zhì)、維生素、有機(jī)酸、肽、氨基酸、γ-氨基丁酸、多酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分[1]。但我國(guó)傳統(tǒng)黃酒中高級(jí)醇含量較高，消費(fèi)者普遍反映有易上頭、易醉等現(xiàn)象[2]。高級(jí)醇，也稱為雜醇，是酒精飲料中的一類風(fēng)味化合物，對(duì)酒精飲料的感官品質(zhì)和特性有顯著的影響。適量的高級(jí)醇會(huì)使得酒體口感醇厚、柔軟、豐滿，酒香協(xié)調(diào)。當(dāng)高級(jí)醇含量過高時(shí)，酒不僅會(huì)有雜醇油的味道，而且容易有“上頭”的強(qiáng)烈醉感[3]。黃酒中高級(jí)醇對(duì)人體有潛在的危害，它比乙醇具有更高的毒副作用[4,5]；其次不同高級(jí)醇比例導(dǎo)致毒副作用不同，特別是異戊醇/異丁醇比例越高，酒的醉度越高[6]。采取有效發(fā)酵控制來調(diào)控黃酒中高級(jí)醇的含量及不同高級(jí)醇比例，降低黃酒“上頭”的醉度和改善黃酒品質(zhì)，對(duì)提高黃酒的地位和擴(kuò)大市場(chǎng)消費(fèi)量具有重要意義。

酵母發(fā)酵產(chǎn)生的高級(jí)醇主要來源于糖代謝生物合成途徑或支鏈氨基酸Ehrlich 降解途徑[7,8]，在Ehrlich途徑中，BAT2基因編碼的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化支鏈氨基酸轉(zhuǎn)化為α-酮酸，隨后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇[9]。THI3基因編碼一個(gè)與丙酮酸脫羧酶（PDCs）十分相似的蛋白質(zhì)類酮酸脫羧酶，被鑒定為亮氨酸代謝的主要脫羧酶，催化2-酮異己酸形成異戊醇[7]。目前BAT2基因[9-11]和THI3基因[12-14]單獨(dú)缺失對(duì)不同酒類影響均有較多研究，但還對(duì)THI3和BAT2基因同時(shí)缺失對(duì)黃酒影響的研究還較少。

本文以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株XF1 的單倍體XF1a7/XF1α6 和THI3基因缺失XF1-T的單倍體XF1a7-T/XF1α6-T 為原始菌采用Cre/loxP 同源重組系統(tǒng)[15]構(gòu)建BAT2基因缺失重組菌XF1-B 和THI3/BAT2雙基因缺失重組菌XF1-TB，然后進(jìn)行黃酒發(fā)酵研究BAT2基因缺失和THI3/BAT2雙基因缺失對(duì)高級(jí)醇生成的影響。以期控制黃酒中高級(jí)醇含量和優(yōu)化高級(jí)醇比例來降低黃酒“上頭”的醉度，為提高黃酒品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中使用的所有菌株和質(zhì)粒載體列于表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study.

1.1.2 引物設(shè)計(jì)

本研究中使用的引物列于表2中。釀酒酵母（S288c）BAT2基因組序列從NCBI（序列號(hào)：NC-001144.5）獲得。采用Snapgene 軟件設(shè)計(jì)引物，上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

表2 本實(shí)驗(yàn)使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 主要試劑

中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；ApexHFHS 脫氧核糖核酸聚合酶、DNA 回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，湖南艾科瑞生物科技有限公司；遺傳霉素（G418）和博來霉素（Zeocin），北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸丁酯、丙酮、正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇（均為色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；半乳糖、無水乙酸鈉、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化鈉（均為分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸苯酯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母提取粉、蛋白胨、瓊脂（生化試劑）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L。

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L。

YPG 培養(yǎng)基：半乳糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L。

McClary 麥?zhǔn)袭a(chǎn)孢培養(yǎng)基[16]：葡萄糖1 g/L，氯化鉀1.8 g/L，無水乙酸鈉8.2 g/L，酵母提取粉2.5 g/L，瓊脂20 g/L。

所有固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加20 g/L 瓊脂，并均經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

TC1000-S PCR 擴(kuò)增儀、PowerPac 3000 電泳儀、GelDoc 2000 凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；CanNeed-MB-800 自動(dòng)糖化器，肇慶市嘉儀儀器有限公司；5804R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；GC8100 氣相色譜儀，滕州中科普儀器有限公司；高效液相色譜儀，LC-10A 雙泵島津液相色譜；安捷倫TC-C18 色譜柱，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.3 方法

1.3.1 敲除組件構(gòu)建

以pUG6 質(zhì)粒為模板，用引物loxP-F/loxP-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得兩端與酵母基因組同源的KanMX抗性基因片段（1 736 bp）；以提取的酵母基因組DNA 為模板，用引物BAT2-F1/BAT2-R1 和BAT2-F2/BAT2-R2 分別PCR 擴(kuò)增出同源臂BU（290 bp）和BD（361 bp）。利用KanMX 基因兩端與兩同源臂的重疊堿基進(jìn)行融合 PCR 連接成BAT2基因敲 除組件BU-loxp-KanMX-loxp-BD（2 338 bp）。

1.3.2 釀酒酵母電轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選

電轉(zhuǎn)化法[17]將敲除組件導(dǎo)入單倍體釀酒酵母細(xì)胞XF1a7/XF1α6 和XF1a7-T/ XF1α6-T，加0.1～0.2 μg純化敲除組件DNA 到感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化（1.5 kV、200 Ω、25 mF 的電容電擊5 ms）后，溫育的轉(zhuǎn)化子涂布含100 μg/mL G418 抗生素的YPD 平板上培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性菌落用引物BAT2-A、BAT2-D 進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。

1.3.3 篩選標(biāo)記去除與質(zhì)粒丟失

利用電轉(zhuǎn)化法將帶有Cre 重組酶基因的pSH65 質(zhì)粒導(dǎo)入BAT2基因缺失的單倍體酵母細(xì)胞XF1a7-BK/XF1α6-BK 和XF1a7-TBK/XF1α6-TBK，涂布于含200 μg/mL zeocin 抗生素平板上培養(yǎng)3 d，挑取陽(yáng)性菌在YPG 液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)10 h 以上，以期有足夠的時(shí)間使半乳糖誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65 產(chǎn)生Cre 重組酶，通過Cre 重組酶切除loxP位點(diǎn)間的抗性基因，然后涂布于含G418 平板和不含G418 平板上，篩選不能在G418抗生素平板生長(zhǎng)而能在不含G418抗生素平板上生長(zhǎng)的酵母菌進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，并傳代培養(yǎng)15 次以上，再次用200 μg/mL zeocin抗生素平板挑選pSH65質(zhì)粒丟失、無抗性標(biāo)記的重組酵母菌XFa7-B/XFα6-B和XFa7-TB/XFα6-TB?；蚯贸^程如圖1所示。

圖1 BAT2 基因敲除過程Fig.1 BAT2 gene knockout process

1.3.4 雙倍體融合

將去掉抗性標(biāo)記的單倍體酵母菌株XF1a7-B/XF1α6-B和XF1a7-TB/XF1α6-TB各取100 μL接種于含有3 mL YPD 的試管中搖床震蕩培養(yǎng)8 h，取10 μL 菌液在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合形態(tài)，將有啞鈴型的酵母融合菌液稀釋涂布于YPD 平板30 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑取單菌落顯微鏡觀察，并分散橢圓菌落進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)驗(yàn)證雙倍體XF1-B 和XF1-TB，用引物MAT-F/MAT-α/MAT-a[18]進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證。

1.3.5 黃酒發(fā)酵

為減少干擾，本實(shí)驗(yàn)采用液態(tài)發(fā)酵黃酒。將浸泡后的糯米加1.6 倍體積的水蒸熟，打漿后加0.1%～0.3%耐高溫淀粉酶95 ℃酶解20 min 進(jìn)行液化，再加入糯米質(zhì)量的5wt%麥芽、5wt%花生餅粉、250wt%水、0.25wt%中性蛋白酶、0.25%風(fēng)味蛋白酶和0.1%～0.3%（V/V）糖化酶進(jìn)行糖化，條件為：50 ℃糖化4 h、65℃ 1 h 和72 ℃ 20 min。過濾滅菌冷卻后備用。將酵母菌接種到10 mL 上述制備的黃酒發(fā)酵液中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h 后，取1 mL 菌液接種到含50 mL 黃酒發(fā)酵液中，30 ℃搖床培養(yǎng)16 h，得到種子液。取100 mL黃酒發(fā)酵液接種3%（V/V）酵母菌種子液30 ℃發(fā)酵7 d。

1.3.6 生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線參照徐佳等[10]的方法，取斜面菌種1 環(huán)，接到10 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min 培養(yǎng)12 h。再以1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL YPD 液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h 測(cè)定600 nm 處的吸光值。

1.3.7 理化性質(zhì)測(cè)定

CO2釋放量采用稱重法測(cè)量[18]，總酸、總糖、氨基態(tài)氮的測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 13662-2018[19]，酒精度的測(cè)定參照孟慶順等[20]的方法。

1.3.8 高級(jí)醇和氨基酸的測(cè)定

高級(jí)醇的測(cè)定參照Wu 等[21]的方法通過氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。氨基酸的測(cè)定參照芮鴻飛等[22]的方法采用液相色譜測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過SPSS 25.0 軟件采用單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析。其中，柱狀圖、生長(zhǎng)曲線使用Graph Pad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 敲除組件和重組酵母菌的構(gòu)建與驗(yàn)證

根據(jù)1.3.1 的方法構(gòu)建敲除組件，以提取的酵母基因組DNA 為模板，用引物BAT2-F1/BAT2-R1 和BAT2-F2/BAT2-R2分別PCR擴(kuò)增出同源臂BU和BD；以pUG6 質(zhì)粒為模板，用引物loxP-F/loxP-R 擴(kuò)增出loxp-KanMX-loxp，結(jié)果如圖2a、2b 所示，左同源臂BU（290 bp）的和右同源臂BD（361 bp）和抗性標(biāo)記loxP-KanMX-loxP（1 736 bp）通過融和PCR 連接，得到BAT2基因敲除組件BU-loxp-KanMX-loxp-BD（2 338 bp）。

圖2 敲除組件和重組菌株的PCR 驗(yàn)證Fig.2 PCR verification of disruption cassette

根據(jù) 1.3.2 的方法通過同源重組轉(zhuǎn)化酵母XF1a7/XF1α6 和XF1a7-T/XF1α6-T，然后挑選陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖2c 所示（以XF1a7-TBK、XF1α6-TBK 示例），重組菌株2 600 bp，原始菌株為1 692 bp，PCR 驗(yàn)證條帶和理論值一致，成功獲得BAT2和THI3/BAT2基因缺失重組酵母菌。

2.2 KanMX 抗性篩選標(biāo)記與pSH65 質(zhì)粒丟失驗(yàn)證

根據(jù)1.3.3 的方法對(duì)重組菌誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后對(duì)去除抗性的重組菌的進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖3a 所示（以XF1a7-TB 為例）。以BAT2-A 和BAT2-D 作為引物，未去除抗性的XF1a7-TBK 的PCR 產(chǎn)物大小為2 600 bp、去除抗性的XF1a7-TB 的PCR 產(chǎn)物大小為1 093 bp。以BAT2-A 和B-M 以及M-B 和BAT2-D 為引物的XF1a7-TB 的PCR 結(jié)果為無條帶。結(jié)果表明重組菌的KanMX抗性基因成功去除。

圖3 重組菌株XF1a7-TB 的抗性去除驗(yàn)證與質(zhì)粒丟失驗(yàn)證Fig.3 Resistant removal verification and plasmid loss verification of strains XF1a7-TB

根據(jù)1.3.3 的方法將傳代去除 pSH65 質(zhì)粒的重組菌進(jìn)行影印平板法篩選去除質(zhì)粒的菌株。質(zhì)粒丟失的菌株只能在不含抗生素平板上生長(zhǎng)，不能在含zeocin抗生素的平板上生長(zhǎng)。結(jié)果如圖3b 所示（以XF1a7-TB為例），不含zeocin 抗生素的平板上重組菌生長(zhǎng)，含zeocin 抗生素的平板上重組菌未生長(zhǎng)。結(jié)果表明pSH65 質(zhì)粒成功丟失。

2.3 基因缺失雙倍體融合的重組酵母菌

根據(jù) 1.3.4 的方法將不同配型單倍體XF1a7-B/XF1α6-B 和XF1a7-TB/XF1α6-TB 融合后，以引物MAT-F/MAT-α/MAT-a 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，泳道1 和泳道3 中的XF1a7-B 和XF1a7-TB 均為544 bp，泳道2 和泳道4 中的XF1α6-B和XF1α6-TB 均為404 bp，泳道5 和泳道6 均有544 bp和404 bp 兩條條帶，表明雙倍體XF1-B 和XF1-TB 融合成功。

圖4 融合雙倍體菌株驗(yàn)證Fig.4 PCR verification of Diploid strains

2.4 基因敲除對(duì)重組菌生長(zhǎng)性能的影響

根據(jù)1.3.6 的方法繪制原始菌XF1、重組菌XF1-B和XF1-TB 生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖5所示，雙基因缺失酵母XF1-B 和XF1-TB 的前期的生長(zhǎng)速率略低于XF1，但是最終生物量都沒有明顯差異。THI3和BAT2基因缺失影響酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使其生長(zhǎng)速率變慢，但對(duì)酵母菌體生長(zhǎng)性能影響不大。

圖5 原始菌XF1、重組菌XF1-B 和XF1-TB 生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curves of XF1,XF1-B and XF1-TB

2.5 基因敲除對(duì)重組菌發(fā)酵性能的影響

根據(jù)1.3.7 的方法測(cè)定原始菌XF1、重組菌XF1-B和XF1-TB 基本發(fā)酵性能如表3所示。從表3可知，重組菌XF1-B 和XF1-TB 的CO2產(chǎn)生量、總糖、總酸和酒精度與原始菌XF1 相比都無差異，說明THI3和BAT2基因缺失不影響酵母的基本發(fā)酵性能。而XF1-B 和XF1-TB 的氨基態(tài)氮分別為0.66 g/L 和0.65 g/L，提高了11.86%和10.17%，說明敲除BAT2能明顯抑制支鏈氨基酸分解合成高級(jí)醇途徑，從而使得氨基態(tài)氮積累。

表3 原始菌XF1、重組菌XF1-B 和XF1-TB 基本發(fā)酵性能Table 3 Basic fermentation performance of XF1,XF1-B and XF1-TB

2.6 基因敲除對(duì)重組菌生成高級(jí)醇的影響

根據(jù)1.3.7 的方法測(cè)定原始菌XF1、重組菌XF1-B和XF1-TB 發(fā)酵黃酒后的高級(jí)醇和氨基酸質(zhì)量濃度如圖6所示。從圖6可知，重組菌XF1-B、XF1-TB 發(fā)酵黃酒生成的異戊醇分別為139.60、126.06 mg/L，與原始菌XF1 相比分別降低了18.12%、26.06%；異丁醇分別為43.02、53.90 mg/L，降低了35.21%、18.83%；正丙醇分別為37.70、43.36 mg/L，提高了15.42%和32.75%；總高級(jí)醇分別為269.59、270.77 mg/L，降低了15.65%和15.28%；纈氨酸分別為286.89、281.63 mg/L，提高了6.75%、4.80%；蘇氨酸分別為112.24、107.49 mg/L，提高了2.28%、6.14%；亮氨酸分別為255.98、260.71 mg/L，提高了6.97%、8.95%；異戊醇/異丁醇分別為3.24 和2.34?？梢?，重組菌XF1-B、XF1-TB 釀造黃酒中總高級(jí)醇降低效果明顯，但是異戊醇/異丁醇比值相差大。

圖6 原始菌XF1、重組菌XF1-B 和XF1-TB 發(fā)酵黃酒后的高級(jí)醇和氨基酸含量Fig.6 The higher alcohol and amino acid content in fermented Huangjiu of strains XF1,XF1-B and XF1-TB

2.7 討論

本研究構(gòu)建重組菌XF1-B 使發(fā)酵黃酒中異戊醇、異丁醇分別降低了18.12%、35.21%，與Zhang 等[23]敲除釀酒酵母BAT2基因分別降低了黃酒中異戊醇與異丁醇14.20%、33.00%的結(jié)果相似，與葛峻伶等[24]敲除啤酒酵母BAT2基因分別降低了啤酒中異戊醇與異丁醇9.55%、10.63%的結(jié)果相差較大，可能是因?yàn)榘l(fā)酵原料以及酵母種類不同。對(duì)應(yīng)釀造黃酒中纈氨酸和亮氨酸提高了6.75%、6.97%，根據(jù)高級(jí)醇代謝途徑圖7分析，證實(shí)BAT2基因編碼的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇途徑起主要作用。

圖7 高級(jí)醇代謝途徑Fig.7 Higher alcohol metabolic pathway

本研究構(gòu)建重組菌XF1-TB 使發(fā)酵黃酒中異戊醇、異丁醇分別降低了26.06%、18.83%。Dickinson等[25]敲除釀酒酵母THI3基因接種以亮氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，異戊醇降低94%，接種以纈氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，異丁醇由3 020 mg/L 上升為3 080 mg/L[26]。而郝欣等[27]敲除THI3基因后接種玉米汁發(fā)酵，異戊醇并無明顯變化，并猜測(cè)該合成途徑受到破壞，異戊醇的合成會(huì)轉(zhuǎn)向氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑，本研究證實(shí)在THI3和BAT2同時(shí)缺失會(huì)導(dǎo)致異戊醇進(jìn)一步減少，并與Styger 等[28]敲除釀酒酵母THI3與BAT2雙基因異戊醇與異丁醇都有降低結(jié)論一致。重組菌BAT2/THI3基因缺失時(shí)，因THI3編碼的類酮酸脫羧酶是亮氨酸分解代謝途徑中α-酮異己酸脫羧生成異戊醇的關(guān)鍵酶[12]，該途徑受阻導(dǎo)致異戊醇生成量顯著降低。重組菌XF1-TB 與XF1-B 相比異丁醇提高了25.29%，目前還未見BAT2/THI3雙基因缺失較BAT2單基因缺失異丁醇會(huì)提高的報(bào)道，對(duì)于α-酮異戊酸生成異丁醇的途徑，因3 種同工酶（Pdc1p、Pdc5p或Pdc6p）中任何一種酶都能使α-酮異戊酸脫羧[27]而受影響小，異戊醇合成途徑受阻導(dǎo)致α-酮酸積累，而氨基酸的增加抑制了α-酮酸合成氨基酸，使積累的α-酮異戊酸在同工酶的作用下向異丁醇途徑合成，異丁醇生成量顯著提高，則重組菌XF1-TB 釀造黃酒中異戊醇/異丁醇比值降低。黃酒中高級(jí)醇含量并不是越低越好，它是黃酒醇厚感的重要成分，黃酒中高級(jí)醇含量在80～540 mg/L 之間比較合適[7]，異戊醇/異丁醇比值在0.5～2.5 之間醉度較低[29]，適當(dāng)?shù)母呒?jí)醇含量和不同高級(jí)醇比例是影響黃酒品質(zhì)的重要因素。通過構(gòu)建重組菌XF1-TB 釀造黃酒的總高級(jí)醇、異戊醇/異丁醇比值都顯著降低，有助于降低黃酒的“上頭”醉度，提升黃酒品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建BAT2基因缺失重組酵母菌XF1-B和BAT2/THI3雙基因缺失重組酵母菌XF1-TB。結(jié)果表明，重組菌XF1-B、XF1-TB 都能有效降低發(fā)酵黃酒中總高級(jí)醇含量，分別降低了15.65%、15.28%，同時(shí)對(duì)應(yīng)提高黃酒中氨基氮含量約11.86%、10.17%。這表明降低發(fā)酵黃酒中高級(jí)醇含量和提高黃酒中氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量在技術(shù)上是可行的。重組菌XF1-TB 比重組菌XF1-B 優(yōu)化了不同高級(jí)醇含量，即異戊醇/異丁醇比值由3.24 降低為2.34，這進(jìn)一步降低了黃酒“上頭”的醉度，為提高黃酒品質(zhì)提供了新的技術(shù)思路。因此，可通過構(gòu)建多基因缺失的重組酵母菌來降低釀造黃酒中高級(jí)醇含量和優(yōu)化不同高級(jí)醇比例，從而有效降低黃酒醉度和提高黃酒品質(zhì)。