熊雪梅，李可文，陳苗苗，文藝，馮文祎，鄭秋生*

（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆石河子 832000）（2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150030）（3.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

頭孢曲松鈉屬于第三代頭孢菌素類藥物，能夠抑制細(xì)胞壁的合成發(fā)揮抗菌作用[1]，對革蘭氏(+)菌、革蘭氏(-)菌都能發(fā)揮殺菌作用，在臨床上可以用于治療金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌等敏感菌導(dǎo)致的各種感染[2]。長期使用頭孢曲松鈉會引起腸道菌群失調(diào)、腸道組織病變及脾臟指數(shù)降低等[3]。研究結(jié)果表明，廣譜抗生素可以影響腸道中大約三分之一的細(xì)菌類群的豐度，導(dǎo)致分類豐富度、多樣性和均勻性迅速而顯著地發(fā)生變化[4]。腸道菌群平衡是維持人體微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的重要條件，與機(jī)體的免疫、代謝等密切相關(guān)[5]，其組成和豐度變化可能會造成與腸道菌群改變相關(guān)的疾病，如代謝綜合征、過敏、Ι 型糖尿病、癌癥等[6,7]。

通過補(bǔ)充益生菌能夠?qū)股卦斐傻哪c道微生物紊亂起到一定的調(diào)節(jié)作用[8]。蔣豐嶺等[9]研究證明益生菌復(fù)合制劑的使用可通過增加雙歧桿菌、減少某些致病菌的方式一定程度上改善頭孢曲松導(dǎo)致的菌群紊亂。陳大衛(wèi)等[10]研究證實混合乳酸菌能夠混合乳酸菌菌懸液及其發(fā)酵乳可以改善由鹽酸林可霉素誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂。根據(jù)2002年世界衛(wèi)生組織的定義，益生菌是給予適量的時候能夠?qū)λ拗鹘】涤蟹e極影響的活的微生物[11]。在臨床實踐中，最常用的益生菌是乳酸菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬以及酵母菌屬，而人類正常的胃腸道菌群主要有乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等[12]。益生菌調(diào)節(jié)和重建宿主腸道微生物群的功效已得到公認(rèn)，如加強(qiáng)腸道屏障、抑制腸道黏膜炎癥等[13]。一些報道證實了益生菌在各種疾中的臨床有效性，包括急性胃腸道感染和炎癥性腸病[14,15]，以及調(diào)節(jié)抗生素導(dǎo)致的腸道內(nèi)菌群失調(diào)來增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。乳雙歧桿菌 V9（Bifidobacterium lactisV9）是從蒙古族健康兒童腸道中分離得到的一株益生菌，是動物雙歧桿菌乳亞種，對人工胃液，腸液以及膽鹽有良好的耐受性，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抗炎、防止腹瀉、增強(qiáng)免疫的功能[16,17]。

因此，本實驗通過給予小鼠頭孢曲松鈉建立腸道菌群失調(diào)實驗動物模型，乳雙歧桿菌V9 灌胃，同時采用高通量測序技術(shù)測定小鼠糞便菌群以分析灌胃前后的腸道菌群差異，HE 染色法觀察小腸組織病理學(xué)改變，免疫組化法檢測IL-1β、IL-6 和TNF-α表達(dá)，從而探討益生菌乳雙歧桿菌V9 對小鼠腸道菌群失衡的恢復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

60 只健康SPF 清潔級BALB/c 雄性小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0038。所有小鼠飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF 級動物室，溫度（20±2）℃，相對濕度46%～60%。本研究的動物實驗設(shè)計方案符合北京聯(lián)合大學(xué)倫理委員會審核標(biāo)準(zhǔn)（實驗動物倫理委員會意見書編號2021-5）。

1.1.2 主要實驗試劑

頭孢曲松鈉，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乳雙歧桿菌V9，北京科拓恒通生物技術(shù)股份有限公司；伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷（BEA）瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌（BS）瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇性（LBS）瓊脂培養(yǎng)基、產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；IL-2、IL-6、IL-1β、TNF-α，武漢華美生物工程有限公司；MDA、SOD、GSH、GSH-PX 測定試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司；Qiagen Gel Extraction Kit 試劑盒，QIAgen 公司；Gene JETTMGel Extraction Kit 試劑盒，Thermo Fisher scientific 公司；TruSeq PCR-Free DNA 建庫試劑盒，Illumina 公司；HE 染液，武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.1.3 主要實驗設(shè)備

TECAN 酶標(biāo)儀，廣州深華公司；電子分析天平，Sartorius 公司；高壓滅菌鍋，Zealway 公司；低溫超高速臺式離心機(jī)，Eppendorf 公司；漩渦振蕩器，IKA 公司；紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；Qubit@2.0 熒光儀，Thermo Fisher scientific 公司；Donatello 脫水機(jī)、Giotto 染色機(jī)，DANJIER 公司；RM2016 病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物及樣品處理

將60 只雄性BALB/c 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)抽12 只作為對照組，其余48 只小鼠用200 mg/mL 頭孢曲松鈉（0.2 mL/d）連續(xù)灌胃5 d，然后隨機(jī)分為4 組，每組12 只，分別為模型組、低（乳雙歧桿菌1.3×108CFU/kg）、中（乳雙歧桿菌2.6×108CFU/kg）、高（乳雙歧桿菌8.0×108CFU/kg）劑量組，每只灌胃0.2 mL/d，連續(xù)灌胃23 d。在此期間每天測量小鼠體重和記錄攝食情況。灌胃益生菌23 d 結(jié)束后，將小鼠脫頸處死，腹主動脈取適量血，4 ℃靜置后離心，取上清，分裝，保存于-80℃冰箱備用。取全部小鼠的心、肝、脾、肺、腎、空腸及小腸組織，部分用多聚甲醛固定，剩余部分保存于-80 ℃冰箱備用。計算臟器系數(shù)及小腸重量和長度。

1.2.2 血清細(xì)胞因子含量測定

取出保存于-80 ℃冰箱中的血清，按照ELISA 試劑盒說明書要求測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 含量。

1.2.3 小腸及肝臟抗氧化水平測定

取出保存于-80 ℃冰箱中的小腸及肝臟組織，稱取約0.2 g，加入預(yù)冷的PBS 緩沖液，勻漿，制備成10%的組織勻漿液，離心，取上清，按照試劑盒說明書測定小腸及肝臟組織中SOD、MDA、GSH 及GSH-Px 含量。

1.2.4 小腸組織病理學(xué)觀察

多聚甲醛固定空腸組織24 h 后，石蠟包埋切片，HE染色，脫水封片，在顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5 糞便活菌計數(shù)

在無菌條件下分別收集灌胃益生菌第0、23 天的小鼠糞便，與稀釋液充分混合，依10倍系列稀釋至10-8，分別接種于選擇性培養(yǎng)基上，采用平板活菌計數(shù)法計算菌落數(shù)，計算每克糞便中的活菌數(shù)（CFU/g）。腸桿菌：接種在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)24 h，計數(shù)發(fā)酵乳糖、G-桿菌的所有菌落。腸球菌：接種在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)48 h，計數(shù)有明顯褐色圈、G+球菌的所有菌落。乳桿菌：接種在LBS 瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃有氧培養(yǎng)48 h，計數(shù)過氧化氫酶試驗陰性、G+無芽孢桿菌的所有菌落。雙歧桿菌：接種在雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，計數(shù)過氧化氫酶試驗陰性、G+無芽孢多形態(tài)桿菌的所有菌落。產(chǎn)氣莢膜梭菌：接種在胰眎-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸（TSC）培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，計數(shù)所有在紫外光下有熒光的黑色菌落。

1.2.6 糞便DNA 提取及高通量測序

連續(xù)灌胃23 d 后，無菌條件下收集各組小鼠糞便置于干燥的滅菌試管中，-40 ℃凍存?zhèn)溆?，采用CTAB 法提取樣品的基因組DNA 并用2wt%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測其濃度和純度，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測序。16S rDNA V3-V4 區(qū)域擴(kuò)增，上游引物為：5’-CCTAYGGGR BGCASCAG-3’，下游引物為3’-GGACTACNNGGGT ATCTAAT-5’，使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，通過Illumina NovaSeq6000 對該文庫進(jìn)行雙末端測序，將數(shù)據(jù)結(jié)果處理過濾后，對樣品進(jìn)行物種多樣性和菌群構(gòu)成進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，并使用SPSS Statistics 21.0和Origin 2021統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間的比較采用單因素方差分析。p＜0.05 即認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠的攝食與體重

如圖1a 和圖1b 所示，與對照組相比，抗生素干預(yù)后各組小鼠的體重有輕微的降低，停止抗生素干預(yù)后體重逐漸恢復(fù)正常，且在正常范圍內(nèi)逐漸增加，而灌胃后各組小鼠攝食量隨著天數(shù)逐漸增加，與對照組小鼠趨勢一致，表明益生菌干預(yù)對小鼠體重及攝食均無影響。

圖1 乳雙歧桿菌V9 對小鼠體重（a）和（b）攝食影響Fig.1 Effect of Bifidobacterium lactis V9 on body weight (a) and food intake (b) level of mice

2.2 乳雙歧桿菌V9 對小鼠臟器系數(shù)的影響

如圖2b 所示，與模型組相比，中劑量組小鼠肝系數(shù)有一定差異（p＜0.05）。說明頭孢曲松鈉對小鼠肝系數(shù)有一定影響。由圖2a、2c、2d、2e、2f 可知，與模型組相比，各劑量組小鼠的心、肝臟、脾臟、肺、腎、胸腺系數(shù)不存在顯著性差異，說明乳歧桿菌V9 對小鼠臟器系數(shù)基本無影響。

圖2 乳雙歧桿菌V9 對小鼠心（a）、肝（b）、脾（c）、肺（d）、腎（e）和胸腺（f）臟器系數(shù)的影響Fig.2 Effects of Bifidobacterium lactis V9 on organ coefficients of heart (a),liver (b),spleen (c),lung (d),kidney (e) and thymus (f) in mice

2.3 乳雙歧桿菌V9 對小鼠小腸重量及長度的影響

如圖3a、3b 所示，對照組、模型組和各劑量組小鼠小腸的重量和長度沒有顯著性差異，說明灌胃頭孢曲松鈉和乳雙歧桿菌V9 對小鼠小腸重量和長度沒有影響。

圖3 乳雙歧桿菌V9 對小鼠小腸重量（a）和長度（b）影響Fig.3 Effect of Bifidobacterium lactis V9 on weight (a) and length (b) of mice

2.4 乳雙歧桿菌V9 對小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致多種促炎因子的產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2，它們與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的激活。在正常機(jī)體中含量非常低，但是當(dāng)炎癥發(fā)生時水平會有明顯升高[8]。

如表1可知，與對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 的含量極顯著升高（p＜0.01），分別增加48.22、7.35、7.37 及18.48 pg/mL；與模型組相比，低劑量組血清細(xì)胞因子IL-6、TNF-α含量極顯著降低（p＜0.01），IL-1β含量顯著降低（p＜0.05），IL-2 的含量有降低的趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）；中劑量組以及高劑量組血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 的含量均極顯著降低（p＜0.01），分別降低31.73、17.04、12.57 及31.71 pg/mL。以上結(jié)果表明，抗生素頭孢曲松鈉引起促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-2 水平升高，使得機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而乳雙歧桿菌V9 可顯著降低血清中炎癥因子水平，使炎癥反應(yīng)得到有效改善。這與Azad 等[18]的研究一致，益生菌能夠降低機(jī)體炎癥因子水平。

表1 小鼠血清中各細(xì)胞因子的含量Table 1 The content of each cytokine in mouse serum (pg/mL, n=12)

2.5 乳雙歧桿菌V9 對小鼠小腸及肝臟組織抗氧化的影響

大量研究的表明，腸道菌群失調(diào)大多和體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基有關(guān)。在正常情況下，動物機(jī)體內(nèi)都存在自由基清除系統(tǒng)，SOD、GSH 和GSH-Px 酶可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，MDA 是脂類物質(zhì)氧化應(yīng)激的終產(chǎn)物，可以反映機(jī)體損傷程度。當(dāng)機(jī)體受到刺激損傷時，SOD、GSH 和GSH-Px 酶活性顯著降低，MDA 水平顯著升高[19]，因此聯(lián)合測定這4 個指標(biāo)可衡量機(jī)體的抗氧化能力。

如表2所示，在肝臟中，與對照組比較，模型組GSH 及GSH-Px 的含量極顯著降低（p＜0.01），SOD含量顯著降低（p＜0.05），MDA 含量顯著升高（p＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量組SOD、GSH 及GSH-Px的含量均極顯著升高（p＜0.01），在小腸中分別增加122.34 U/mg prot、13.93 mg GSH/mg prot 及13.29 U/mg prot，在肝臟中分別增加90.9 U/mg prot、4.97 mg GSH/mg prot 及13.21 U/mg prot；高劑量組MDA 含量極顯著降低（p＜0.01），小腸中降低1.31 nmol/mg prot，肝臟中降低1.0 nmol/mg prot。以上結(jié)果表明，頭孢曲松鈉可抑制機(jī)體抗氧化物質(zhì)SOD、MDA、GSH 及GSH-Px 產(chǎn)生，而乳雙歧桿菌V9 可顯著恢復(fù)抗氧化物質(zhì)在體內(nèi)的水平，說明乳雙歧桿菌V9可增強(qiáng)小鼠機(jī)體清除自由基的能力，提高機(jī)體抗活性氧損傷的能力。

表2 乳雙歧桿菌V9 對小鼠小腸組織SOD、MDA、GSH 和GSH-Px的測定Table 2 Determination of SOD,MDA,GSH and GSH-PX in small intestine of mice by Bifidobacterium lactis V9

2.6 乳雙歧桿菌V9 對小鼠小腸組織病理學(xué)改變的影響

如圖4所示，對照組、抗生素干預(yù)后模型組以及益生菌灌胃后各劑量組小腸病理切片圖可知，各組小腸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，絨毛細(xì)長且密集，柱狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞，未見明顯炎癥。說明短時間頭孢曲松鈉灌胃對小腸絨毛沒有影響，各劑量乳雙歧桿菌V9 灌胃對小腸組織形態(tài)也無明顯影響。

圖4 小腸蘇木精和伊紅染色光鏡圖Fig.4 Light micrograph of the small intestine stained with hematoxylin and eosin

2.7 乳雙歧桿菌V9 對小鼠腸道菌群的影響

2.7.1 糞便活菌數(shù)分析

由表3可知，用抗生素造成腸道菌群紊亂后，與對照組相比，模型組腸桿菌、腸球菌、乳桿菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著降低（p＜0.01），分別減少2.68、2.93、2.84、17.07 lg cfu/g。產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量無顯著差異（p＞0.05）。灌胃益生菌后，與模型組比較，高劑量組腸桿菌的數(shù)量顯著降低（p＜0.01），降低0.34 lg cfu/g。乳桿菌以及雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加（p＜0.01），分別增加0.40 lg cfu/g 和0.26 lg cfu/g。各劑量組腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均無顯著性差異（p＞0.05）。以上結(jié)果表明乳雙歧桿菌V9 可以抑制腸桿菌生長，顯著促進(jìn)乳桿菌和乳雙歧桿菌生長，對腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌無明顯影響。說明乳雙歧桿菌V9 具有促進(jìn)有益菌的生長，抑制有害菌的生長，對腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)作用。

表3 0 d 和23 d 糞便腸道菌群計數(shù)Table 3 Count of fecal intestinal flora at 0 d and 23 d (lg cfu/g)

2.7.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性主要關(guān)注局域均勻生境下的物種數(shù)目，可以衡量物種分布的多樣性和均勻度，并直接反映測序的深度和數(shù)量，包括Observed-species、ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 等多樣性指數(shù)[20]。ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)可以評估樣本的菌群豐度，Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)評估樣本菌群多樣性[21]。

由表4可知，與對照組相比，短時間灌胃頭孢曲松鈉使小鼠腸道菌群的豐度和多樣性異常升高（p＞0.05），而益生菌乳雙歧桿菌V9 灌胃可顯著改善此現(xiàn)象（p＜0.01）。

表4 各組腸道菌群α 多樣性Table 4 Alpha diversity of intestinal microbial flora among groups (±s)

表4 各組腸道菌群α 多樣性Table 4 Alpha diversity of intestinal microbial flora among groups (±s)

組別 OTU Shannon Simpson Chao1 ACE Good-Coverage對照組 683.83 5.93 0.94 860.79 873.98 0.99模型組 1053.83 6.60 0.97 1400.68 1394.50 0.99低劑量組 454.83** 5.35** 0.91* 528.20** 538.58** 1.00**中劑量組 521.33** 5.60* 0.93 650.11** 654.11** 1.00**高劑量組 526.67** 5.48** 0.93* 668.04** 667.53** 1.00**

2.7.3 菌群構(gòu)成分析

正常的健康腸道菌群主要由厭氧菌組成，主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobiota）組成，其中前4 個菌門占腸道總菌群的98%。腸道菌群按照功能可以分為有益菌、有害菌和條件致病菌，主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門，其他細(xì)胞只占很小的比例[22]。

由表5和圖5可知，在門水平上，各組樣本主要優(yōu)勢菌門為擬桿菌門和厚壁菌門，它們在腸道中通常是占主導(dǎo)地位的[23]，它們能夠參與能量的供應(yīng)及腸道中多糖的發(fā)酵[24]?？股靥幚砗?，模型組小鼠腸道菌群中unidentified_Bacteria 和酸桿菌門Acidobacteriota豐度顯著增加（p＜0.05），分別增加2.23%、0.66%。乳雙歧桿菌V9 處理后，Acidobacteriota、脫鐵桿菌門Deferribacteres 和Others 豐度顯著減少（p<0.01），分別減少0.83%、0.01%、2.77%，Proteobacteria 和Firmicutes豐度顯著減少（p＜0.05），分別減少3.14%、9.28%。門水平結(jié)果說明乳雙歧桿菌 V9 可以抑制Acidobacteriota 的生長。

表5 門水平各組間腸道菌群分析Table 5 Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level (±s)

表5 門水平各組間腸道菌群分析Table 5 Analysis of intestinal microbial flora among groups in phylum level (±s)

相對豐度/%菌群 對照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組Bacteroidota 50.78±18.40 52.72±5.03 44.29±9.18 56.80±14.60 61.24±12.23 Firmicutes 33.88±13.45 27.63±3.96 35.24±10.83 23.87±10.87 18.35±7.71*Verrucomicrobiota 6.08±11.90 2.49±3.88 12.40±14.44 11.44±12.21 6.77±10.37 Actinobacteriota 0.94±0.53 2.52±2.23 17.29±0.59 1.44±0.73 6.02±6.49 Proteobacteria 2.68±1.47 3.47±2.08 1.00±1.64 0.33±0.39* 1.53±2.79 unidentified_Bacteria 1.87±0.90 4.10±1.35# 2.63±2.13 2.08±1.00* 2.02±1.54*Desulfobacterota 0.54±0.72 0.524±0.41 0.425±0.20 1.09±1.61 0.54±0.63 Campylobacterota 0.34±0.21 0.69±0.55 0.86±0.86 1.01±0.67 1.10±1.35 Acidobacteriota 0.19±0.27 0.85±0.43# 0.04±0.08** 0.08±0.17** 0.03±0.06**Deferribacteres 0.01±0.01 0.01±471.42 0.00±0.00** 0.02±0.02 0.17±0.34 others 2.68±1.08 5.01±2.14 1.38±0.60** 1.84±1.01* 2.24±1.56*

圖5 灌胃前后小鼠腸道菌群在門水平上的豐度變化Fig.5 Changes in the abundance of intestinal microbiota at phylum level before and after gavage

由表6和圖6知，在屬水平各組主要優(yōu)勢菌有艾克曼菌屬（Akkermansia）、杜波希氏菌屬（Dubosiella）、毛螺旋菌（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。艾克曼氏菌具有抗炎，維持機(jī)體腸道健康和調(diào)節(jié)代謝紊亂的作用[25,26]。杜波希氏菌屬與大多數(shù)差異脂類代謝產(chǎn)物顯著相關(guān)[27]。乳酸桿菌屬能夠改善腸道屏障功能，抑制腸道病原菌的繁殖[28]。抗生素處理后，模型組擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）數(shù)量極顯著增加（p＜0.01），增加5.07%；而乳雙歧桿菌V9 灌胃后，Bifidobacterium數(shù)量顯著增加（p＜0.05），增加0.68%，理研菌（Alistipes）數(shù)量極顯著增加（p＜0.01），增加2.91%，Alloprevotella數(shù)量顯著減少（p＜0.05），減少3.86%，Others數(shù)量極顯著減少（p＜0.01），減少17.07%。上述結(jié)果說明乳雙歧桿菌V9 可以促進(jìn)腸道內(nèi)Alistipes增殖。Dziarski 等[29]研究表明，Alistipes finegoldii可以減緩腸道炎癥，降低炎癥性腸病的發(fā)病率。此外，有資料研究證明[30]，Alistipes屬數(shù)量減少可能引發(fā)Clostridium difficile感染。

表6 屬水平各組間腸道菌群分析Table 6 Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level (±s)

表6 屬水平各組間腸道菌群分析Table 6 Analysis of intestinal microbial flora among groups in genus level (±s)

相對豐度/%菌群 對照組 模型組 低劑量組 中劑量組 高劑量組Akkermansia 6.04±11.92 2.43±3.89 12.40±14.43 11.43±12.21 6.77±10.37 Dubosiella 3.87±4.60 0.34±0.27 12.25±13.67 5.92±7.77 0.52±0.303 Lachnospiraceae_NK4A136_group 7.30±7.28 5.76±4.97 2.31±1.12 3.50±3.68 3.26±3.15 Lactobacillus 8.03±5.54 6.30±4.49 10.06±6.80 5.09±4.77 5.09±4.77 Bifidobacterium 0.18±0.34 0.04±0.02 0.72±0.51* 0.72±0.73 5.39±6.40 Alloprevotella 0.24±0.07 5.31±2.84## 1.19±0.74* 6.14±6.97 1.45±0.77*Bacteroides 1.00±0.49 1.50±0.76 1.85±0.64 2.21±0.81 4.63±4.70 Alistipes 0.84±0.46 0.66±0.27 6.08±2.68** 3.57±1.80** 1.79±1.65 Prevotellaceae_UCG-001 0.51±0.31 0.84±0.47 0.83±0.45 1.06±0.37 0.88±0.67 Desulfovibrio 0.49±0.71 0.47±0.41 0.42±0.20 1.07±1.60 0.52±0.62 Others 71.48±15.37 76.36±6.95 51.90±10.44** 59.29±13.87* 69.08±11.89

圖6 灌胃前后小鼠腸道菌群在屬水平上的豐度變化Fig.6 Changes in the abundance of intestinal microbiota at genus level before and after gavage

對各組物種進(jìn)行差異分析，如圖7所示，抗生素灌胃導(dǎo)致模型組有害菌擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）極顯著增加（p＜0.01），丹毒莢膜菌屬（Erysipelatoclostridium）、庫特氏菌屬（Kurthia）顯著增加（p＜0.05），氣味桿菌Odoribacter極顯著降低（p＜0.01）。

圖7 差異物種相對豐度聚類熱圖Fig.7 Species relative abundance clustering heat map

乳雙歧桿菌V9 灌胃后，低劑量組擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、Mucispirillum、乳酸桿菌屬、魏斯氏菌（Weissella）、（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、Oscillibacter、Enterobacter極顯著降低（p＜0.01），Muribaculum、[Eubacterium]_siraeum_group、Kurthia、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Enterococcus顯著降低（p＜0.05），Alidlipes、雙歧桿菌Bifidobacterium極顯著提高（p＜0.01）。Dubosiella顯著提高（p＜0.05）。中劑量組乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、Weissella、（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、（Enterobacter）極顯著降低（p＜0.01 ）。Kurthia、[Eubacterium]_xylanophilum_group、Enterococcus、Colidextribacter顯著降低（p＜0.05），Alidlipes極顯著提高（p＜0.01），雙歧桿菌顯著提高（p＜0.05）。高劑量組擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、乳酸桿菌屬、Weissella、Prevotellaceae_Ga6A1_group、Enterobacter極顯著降低（p＜0.01），Enterococcus顯著降低（p＜0.05）。

根據(jù)上述結(jié)果可知，頭孢曲松鈉處理后，有害菌擬普雷沃菌等致病菌的豐度增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著降低，使得腸道菌群嚴(yán)重失衡。研究資料表明，擬普雷沃菌屬是臨床上較常見的條件致病菌，常引起女性生殖道及口腔感染，與結(jié)締組織的分解有關(guān)，其豐度的增加與有利于腸道健康和代謝內(nèi)毒素的異常產(chǎn)生有關(guān)[31]。乳雙歧桿菌V9 處理后擬普雷沃菌數(shù)量顯著降低，說明乳雙歧桿菌V9 能夠抑制其生長。與表3糞便活菌計數(shù)結(jié)果一致，乳雙歧桿菌V9 能夠促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌的生長，雙歧桿菌、乳酸菌和疣微菌是腸道的重要生理菌群，能夠降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH值，抑制有害菌的生長，具有抗氧化及提高機(jī)體免疫力的能力，與肥胖、糖尿病和過敏等各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，被認(rèn)為是健康腸道的重要標(biāo)志[32-34]。魏斯氏菌能夠引起菌血癥、膿腫、假體關(guān)節(jié)感染和感染性心內(nèi)膜炎[35]。這說明乳雙歧桿菌V9 在一定程度上促進(jìn)了增加有益菌數(shù)量，抑制有害菌生長，從而對機(jī)體腸道菌群失調(diào)起到調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

綜上所述，乳雙歧桿菌V9 的干預(yù)使得頭孢曲松鈉導(dǎo)致的小鼠腸道炎癥得到緩解，抗氧化能力恢復(fù)，以及腸道菌群有益菌雙歧桿菌、疣微菌門豐度增加，并且抑制了有害菌擬普雷沃菌的增長，改善微生物群落。說明乳雙歧桿菌V9 能夠抑制炎癥反應(yīng)以及在一定程度上調(diào)節(jié)腸道菌群。