阮婷玉, 史唯地, 馬 勛, 王 靜, 康立超, 杜冬冬, 殷月蘭

（1. 石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室, 新疆 石河子 832003；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心, 新疆 石河子 832000；3. 江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室, 江蘇 揚州 225009）

單 核 細(xì) 胞 增 生 李 斯 特 菌 （Listeria monocytogenes, Lm）是引起全球嚴(yán)重的食源性感染和公共衛(wèi)生問題的一種食源性病原體, 可引起人類李斯特菌病[1］。單增李斯特菌毒力島4（Listeria monocytogenespathogenicity island-4, LIPI-4） 為2016 年新發(fā)現(xiàn)的與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和母嬰感染相關(guān)的Lm 特異性毒力基因簇[2］。N-myc 下游調(diào)節(jié)基因1（N-myc downstream regulated gene 1, NDRG1）又稱分化相關(guān)基因1[3］, 多年來該基因在人類和動物中相繼被發(fā)現(xiàn)。NDRG1 是一種胞質(zhì)蛋白, 主要在上皮細(xì)胞中表達(dá), 但其細(xì)胞定位取決于細(xì)胞類型[4］。國 內(nèi) 外 研 究[5-9］發(fā) 現(xiàn)：NDRG1 作 為 一 種 高度保守的蛋白質(zhì), 廣泛存在于各種正常組織和腫瘤中, 并參與胚胎發(fā)育、脂質(zhì)合成、髓鞘合成、細(xì)胞增殖分化、腫瘤細(xì)胞遷移、炎性腫瘤微環(huán)境的調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)和維持外周軸突的功能完整等多種過程。NDRG1 在癌癥中的研究較多, 但在炎性疾病發(fā)生發(fā)展中作用的研究較少。目前關(guān)于LIPI-4 的研究主要集中于基因序列分析[10］、流行病學(xué)調(diào)查[11-12］和生 物學(xué)特性[13］等, 關(guān)于LIPI-4 在Lm 致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中分子機制的研究較少。本研究構(gòu)建NDRG1 shRNA 干擾載體、過表達(dá)載體和建立 穩(wěn) 定 過 表 達(dá)NDRG1 的hCMECs, 為 后 續(xù)NDRG1 在LIPI-4 介導(dǎo)的Lm 侵襲和穿越血腦屏障誘導(dǎo)中樞炎癥中的分子機制研究提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒、主要試劑和儀器人腦微血管 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 （human cerebralis microvascular endothelial cells, hCMECs） 購自北納創(chuàng)聯(lián)生物研究院。大腸桿菌（Escherichia coli, E. coli）DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pMD19-T（Simple）購自北京寶日醫(yī)（TaKaRa）生物有限公司, 真核表達(dá)載體pcDNA3.1 由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院胡廣東副教授饋贈, 表達(dá)載體pGPU6-GFP購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）、 胎 牛 血 清（fetal bovine serum, FBS） 和 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 生 長 因 子（endothelial cell growth factor, ECGF） 購 自 美國Sciencell公司, 限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京） 有限公司, 瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自北京天根公司, NDRG1 兔多克隆抗體（AF7551）和GAPDH 兔單克隆抗體（AF1186）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司, 辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG （H+L） 和DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公 司, Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 和Opti-MEM 購自美國賽默飛世爾科技公司, 新霉素（G418）購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。實時熒光 定 量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR） 儀 和 普 通PCR 儀 購 自 德 國Sensoquest 公司, 微量核酸蛋白測定儀和CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher 科技有限公司, SDSPAGE 凝膠電泳儀和蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自英國Cleaver 公司, 倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 NDRG1 shRNA 的設(shè)計和合成參照GenBank 登錄NDRG1 全開放閱讀框（登錄號為CR456842.1）, 通 過shRNA 靶 序 列 設(shè) 計 網(wǎng) 站https：//rnaidesigner. invitrogen. com, 篩選8 條靶序列, 加入9 nt TTCAAGAGA 序列形成了含莖環(huán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu), 并且以6個T堿基作為RNA pol Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。分別命名為shRNA-NDRG1-236、shRNANDRG1-242、 shRNA-NDRG1-251、 shRNANDRG1-613、 shRNA-NDRG1-239、 shRNANDRG1-564、 shRNA-NDRG1-802、 shRNANDRG1-1041 和shRNA-NDRG1-NC （表1）, 引物委托上海吉瑪公司合成。

表1 NDRG1 基因shRNA 載體靶序列和退火DNA Oligo 序列Tab. 1 Target sequences of shRNA vector of NDRG1 gene and annealed DNA Oligo sequences

1.3 NDRG1 shRNA 干擾載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染效率觀察采取水浴方式對設(shè)計合成的8 個shRNA 的DNA 雙鏈進(jìn)行退火, 50 μL 退火體系：正義鏈和反義鏈（100 μ mol·L-1）各5 μL, 退火緩沖液（10×TE Buffer）5 μL, ddH2O 35 μL。選擇BamH Ⅰ和BbsⅠ對pGPU6-GFP 空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切, 經(jīng)凝膠電泳檢測后純化回收相關(guān)片段, 采用T4 連接酶將回收產(chǎn)物與含互補黏性末端的DNA 雙鏈連接, 轉(zhuǎn)化至DH5α 中, 在Kana 抗性平板上篩選陽性克隆送至生工生物工程（上海） 股份有限公司測序鑒定。將復(fù)蘇后的第3 代hCMECs 以1×105mL-1的密度接種至12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 細(xì)胞密度達(dá)到80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 轉(zhuǎn)染體系為每孔1.5 μg 質(zhì)粒+3.0 μL Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染后4～6 h 更換為無抗生素的完全培養(yǎng)基, 轉(zhuǎn)染后24 h 在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率, 以表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescence protein, GFP） 的陽性克隆百分率作為轉(zhuǎn)染效率。

1.4 NDRG1 過表達(dá)引物設(shè)計、合成和載體構(gòu)建

參照GenBank 登錄NDRG1 全開放閱讀框（登錄號為CR456842.1）, 采用Primer 5.0 軟件設(shè)計特異性引物：上游引物5'-CCCAAGCTTGGGATGTCTCGGGAGATGCAGGAT-3', 下游引物5'-CGGGATCCCGTTAACAGGAGACCTCCATGGACTTG-3', 并對引物的5'端添加酶切位點（下劃線部分為酶切位點）及保護(hù)性堿基（斜體部分為保護(hù)性堿基）, 引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以hCMECs 的cDNA 為模板擴(kuò)增NDRG1 CDS 片段, 將其與pMD19-T 連接并測序[由生工生物工程（上海）股份有限公司完成］。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒與pcDNA3.1 質(zhì)粒分別采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后純化回收相關(guān)片段, 經(jīng)T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化至DH5α 中, 在Amp 抗性平板上篩選陽性克隆菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取、雙酶切檢測和測序。

1.5 細(xì)胞總RNA 提取、質(zhì)檢和反轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR法檢測hCEMCs 中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平將構(gòu)建成功的8 個shRNA 干擾載體和過表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染hCEMCs 后, 48 h 提取細(xì)胞總RNA。以轉(zhuǎn)染空載體的hCEMCs 作為對照組, 采用RT-qPCR法驗證干擾和過表達(dá)后hCEMCs 中NDRG1 mRNA表達(dá)水平。分別對干擾載體轉(zhuǎn)染后48 h 及過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后篩選純化的細(xì)胞株采用TRIzol 試劑提取細(xì)胞中總RNA, 提取后采用超微量分光光度計（Nanodrop 2000） 和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA 質(zhì)檢。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A） 制備cDNA。以NDRG1 基因為目的基因（上游引物5'-ACACCTACCGCCAGCACATT-3'；下游引物5'-GGTCGCTCAATCTCCAGGTC-3'）, 以GAPDH 基因作為內(nèi)參基因（上游引物5'-TGCCTCCTGCACCACCAACT-3'；下游引物5'-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3'）, 采 用 RT-qPCR 法 檢 測hCEMCs 中目的基因mRNA 表達(dá)水平。RT-qPCR反 應(yīng) 體 系：Perfect Start?Green qPCR SuperMix 10 μL, PCR上游和下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL, cDNA 模板1 μL, 無核酸酶水加至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃、30 s；94 ℃、5 s, 60 ℃、15 s, 72 ℃、10 s；共45 個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.6 蛋白提取和Western blotting 法檢測hCEMCs中NDRG1 蛋白表達(dá)水平采用Western blotting 法驗證干擾和過表達(dá)后hCEMC 中NDRG1 蛋白表達(dá)水平。分別對干擾載體轉(zhuǎn)染后96 h 及過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418 篩選純化后的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。收集細(xì)胞后按照蛋白裂解液說明書進(jìn)行操作, 提取細(xì)胞蛋白樣品并進(jìn)行BCA 蛋白定量。每孔加入15 μg 蛋白, 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后將條帶轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h。按照1∶1 000比例加入抗NDRG1 和GAPDH 抗體, 4 ℃靜置過夜孵育。TBST 洗膜5 min×3 次, 按1∶2 500 比例加入HRP 山羊抗免IgG, 室溫?fù)u床孵育1 h 后采用TBST 洗膜5 min×3 次。采用DAB 進(jìn)行顯色。

1.7 NDRG1 穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞篩選采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和新霉素篩選的方式獲得穩(wěn)定過表達(dá)NDRG1的細(xì)胞。將復(fù)蘇后第3 代hCMECs 以1×104mL-1接種至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 待細(xì)胞匯合至90%時進(jìn)行G418 濃度梯度篩選, 每孔中加入含不同濃度G418 （0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、0.8、0.9 和1.0 g·L-1）的 培 養(yǎng) 基, 每 個 梯 度行3 個重復(fù)孔, 每2～3 d 更換1 次篩選培養(yǎng)液；以14 d 內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小G418 濃度為最佳濃度。按照“1.3”中的操作步驟對過表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。另準(zhǔn)備1 孔hCMECs 作為篩選用陰性對照（對照組）。在轉(zhuǎn)染后48 h 對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行G418 篩選, 待陰性對照細(xì)胞全部死亡后, 將G148 濃度減半繼續(xù)培養(yǎng)至14 d。14 d 后將出現(xiàn)的陽性克隆細(xì)胞采用濾紙片法消化至24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)。將篩選得到的陽性克隆細(xì)胞在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中稀釋, 選擇只有1 個細(xì)胞生長的孔繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。采用RT-qPCR 和Western blotting 法檢測篩選后陽性克隆hCMECs 中NDRG1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 pGPU6-GFP 載體的雙酶切產(chǎn)物和鑒定對含有GFP 的載體pGPU6-GFP 采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定（圖1）, 電泳檢測結(jié)果顯示載體片段大小約為5 117 bp, 與預(yù)期結(jié)果一致, 可行后續(xù)實驗。

圖1 pGPU6-GFP 載體雙酶切產(chǎn)物鑒定電泳圖Fig.1 Identification electrophoregram of products of pGPU6-GFP vector digested by double enzyme

2.2 NDRG1 干擾載體轉(zhuǎn)染效率采用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建的8 個shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染hCMECs, 轉(zhuǎn)染后24 h 采用熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。表達(dá)GFP 的陽性克隆細(xì)胞百分率約為70%, 轉(zhuǎn)染后的hCMECs 增殖情況良好, 表明NDRG1 基因shRNA 干擾載體轉(zhuǎn)染成功并穩(wěn)定表達(dá)。見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察shRNA 干擾載體轉(zhuǎn)染后hCMECs 中GFP 表達(dá)情況Fig. 2 Expression of GFP in hCMECs after transfected with shRNA interference vectors obseved under fluorescence microscope

2.3 NDRG1 shRNA 轉(zhuǎn)染后hCEMCs 中NDRG1 mRNA 和蛋白表達(dá)水平RT-qPCR 法檢測結(jié)果顯示：8 個shRNA 干擾載體中有3 個具有較好的干擾效果（圖3A）, 分別為shRNA-236、shRNA-242 和shRNA-613。轉(zhuǎn)染后hCEMCs 中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平分別約為對照的26%、21%和13%。轉(zhuǎn)染后96 h 時對上述3 個載體轉(zhuǎn)染后hCEMCs 中NDRG1 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行Western blotting 法檢測, 結(jié)果顯示：在相對分子質(zhì)量為48 000 附近檢測到與預(yù)計相對分子質(zhì)量相符的對應(yīng)特異性蛋白條帶, 且蛋白表達(dá)水平與RT-qPCR 法檢測結(jié)果一致（圖3B）。

圖3 不同載體轉(zhuǎn)染后hCMECs 中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平(A)和NDRG1 蛋白表達(dá)電泳圖(B)Fig. 3 Expression levels of NDRG1 mRNA (A) and electrophoregram of expressions of NDRG1 protein (B) in hCMECs after transfected with different vectors

2.4 pcDNA3.1-NDRG1 過表達(dá)載體構(gòu)建以hCMECs 的cDNA 為模板, 通過PCR 擴(kuò)增獲得NDRG1 CDS 片段（圖4A）, 電泳結(jié)果目的片段大小與預(yù)期（1 185 bp）相符。采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對pcDNA3.1 載體進(jìn)行酶切, 電泳鑒定結(jié)果顯示線性化載體條帶大?。? 428 bp） 與預(yù)期結(jié)果相符（圖4B）。將NDRG1 CDS 擴(kuò)增片段連接測序載體pMD19T, 測序正確后回收目的片段與線性化的pcDNA3.1 載體連接和轉(zhuǎn)化, 經(jīng)過Amp 抗性篩選后提取重組質(zhì)粒, 采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切, 重組質(zhì)粒雙酶切后可見1 185 與5 428 bp 的2 個條帶（圖4C）, 與預(yù)期結(jié)果一致, 經(jīng)測序驗證表明pcDNA3.1-NDRG1 過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 NDRG1 CDS PCR 產(chǎn)物(A)、pcDNA3.1 線性化鑒定(B)和pcDNA3.1-NDRG1 重組質(zhì)粒酶切(C)電泳圖Fig. 4 Electropherograms of NDRG1 CDS PCR product (A), pcDNA3.1 linearization identification (B), and enzyme digestion of pcDNA3.1-NDRG1 recombinant plasmid (C)

2.5 過表達(dá)NDRG1 的hCMECs 的建立RTqPCR 法檢測結(jié)果顯示：與對照比較, 篩選后的hCMECs 中NDRG1 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)約25.96 倍；Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：在相對分子質(zhì)量48 000 附近檢測到清晰單一條帶, 與預(yù)計相對分子質(zhì)量相符, 且蛋白表達(dá)趨勢與RT-qPCR電泳結(jié)果一致（圖5）, 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無明顯改變（圖6）, 表明穩(wěn)定過表達(dá)NDRG1 的hCMECs 建立成功。

圖5 hCMECs 中NDRG1 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 5 Electrophoregram of expression of NDRG1 protein in hCMECs

圖6 過表達(dá)NDRG1 的陽性克隆hCMECs 形態(tài)表現(xiàn)Fig. 6 Morphology of positive clone hCMECs overexpressing NDRG1

3 討 論

病原菌與宿主細(xì)胞的相互作用極其復(fù)雜, 病原菌感染細(xì)胞后會導(dǎo)致細(xì)胞大量基因的表達(dá)發(fā)生改變, 研究參與這一過程的宿主細(xì)胞的基因有助于探討病原菌的致病機制, 為疾病的防控提供理論基礎(chǔ)。Lm 是引起人獸共患李斯特菌病的胞內(nèi)寄生菌, 可穿越宿主血腦屏障、腸道屏障和胎盤屏障, 引起細(xì)菌性腦膜炎、腸胃炎和流產(chǎn)等疾病[14-15］。近年來人類李斯特菌病的致死率在全球多個地區(qū)達(dá)到20%～30%[16-17］, 可見其危害性。為了研究LIPI-4介導(dǎo)的Lm 穿越血腦屏障誘導(dǎo)中樞炎癥中的分子機制, 本課題組[14］前期完成了LIPI-4 介導(dǎo)的Lm 在體外的毒力研究, 并通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選到宿主細(xì)胞的差異表達(dá)基因之一——NDRG1。NDRG1作為一種已知的多發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子, 但是其在炎性疾病中的研究較少, 尤其在Lm 引起的中樞炎癥中的作用未見報道。

研究[18］顯示：NDRG1 在人體多種組織中廣泛表達(dá), 提示NDRG1 可能參與各種組織和細(xì)胞的生長過程。NDRG1 作為一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白[19-21］, 在機體中可對多種刺激產(chǎn)生反應(yīng), 并且通過多種信號通路和分子機制介導(dǎo)其活性發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[22-23］。此外NDRG1 參與多種生理活動和功能調(diào)節(jié), 包括腫瘤進(jìn)展和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng), 因此NDRG1 在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。JIN 等[24］發(fā)現(xiàn)：在熱滅活的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌處理的牛乳腺上皮MAC-T 細(xì)胞模型中NDRG1 表達(dá)上調(diào)。為了進(jìn)一步探索NDRG1在自然環(huán)境中的表達(dá), JIN 等[24］檢測了NDRG1 在乳房炎和正常牛乳腺組織中的基因表達(dá), 結(jié)果顯示：NDRG1 參與了牛乳房炎時乳腺的免疫應(yīng)答。研究[25-26］顯示：在炎癥狀態(tài)下的牛乳腺上皮細(xì)胞和乳房組織中NDRG1 高表達(dá), 并且NDRG1 通過影響腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6和轉(zhuǎn)化生長因子β 的表達(dá), 抑制磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B, p-AKT）下游效應(yīng)分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of repamycin, mTOR）的激活；并且NDRG1通過負(fù)調(diào)控p-AKT 和p-MTOR 信號分子的表達(dá), 抑制β-酪蛋白的合成和細(xì)胞增殖。

目 前RNA 干 擾 技 術(shù) 很 多[26］, 其 中shRNA 干擾載體具有高度特異性, 操作簡單, 穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率和干擾效率較高, 重復(fù)性好。shRNA 一旦整合進(jìn)入細(xì)胞基因組, 能夠使靶基因長時間穩(wěn)定敲減。GFP 為常用的報告基因, 發(fā)射的綠色熒光穩(wěn)定, 且靈敏度高、易于檢測, 因此可以幫助評估載體的轉(zhuǎn)染效率。基于上述研究基礎(chǔ), 本研究采用pGPU6-GFP 載體, 成功構(gòu)建了針對人源NDRG1的shRNA 干擾載體并在hCMEC 中檢測轉(zhuǎn)染效率和干擾效率, 篩選出了干擾效果最好的shRNA 干擾載體, 為后續(xù)深入研究NDRG1 基因的功能提供有利條件。

本研究成功構(gòu)建針對人源NDRG1 的shRNA干擾載體并驗證干擾效果, 構(gòu)建pcDNA3.1-NDRG1 真核表達(dá)載體并建立了穩(wěn)定過表達(dá)NDRG1 的hCMECs, 為 后 續(xù)NDRG1 在LIPI-4 介導(dǎo)的Lm 感染hCMECs 中的功能驗證提供依據(jù)。