李香榮，何秀英，陳 浩，陸展華，王曉飛，王石光，方志強(qiáng)，巫浩翔，劉 維

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/ 廣東省水稻育種新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 廣東省水稻工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南優(yōu)質(zhì)稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330000）

水稻（Oryza sativaL.）是亞洲乃至世界最重要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有極其重要的地位［1］。我國水稻耕作面積僅次于印度，但稻谷總產(chǎn)量居世界之首，約占我國糧食總產(chǎn)量的40%以上，其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)性是保證我國糧食安全的重要指標(biāo)。當(dāng)前，水稻病害仍是稻谷產(chǎn)量損失的重大原因［2］，其中由革蘭氏陰性黃單胞桿菌致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）引起的白葉枯病（BacterialBlight，BB）是南方稻區(qū)主要的細(xì)菌性病害，它通過侵染水稻維管束，在稻葉葉尖和葉邊緣產(chǎn)生黃綠色斑點(diǎn)，隨后侵染至木質(zhì)部的導(dǎo)管，并導(dǎo)致葉片枯萎變成灰白色，嚴(yán)重降低水稻的光合作用，引致減產(chǎn)（一般20%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%，甚至顆粒無收）和損害稻米品質(zhì)［3-4］。華南稻區(qū)高溫高濕且臺(tái)風(fēng)暴雨頻發(fā)的天氣有利于白葉枯病的暴發(fā)與流行，而且華南雙季稻連作的栽培模式更容易導(dǎo)致該病害的發(fā)生。目前，對(duì)白葉枯病的主要防治手段仍是化學(xué)防治，但施用大量化學(xué)藥劑不但造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，對(duì)人類和動(dòng)物產(chǎn)生危害，而且增加生產(chǎn)成本。

利用寄主植物抗性是防治白葉枯病的首選策略。培育與種植抗白葉枯病水稻品種是當(dāng)前世界公認(rèn)的防治該病害最為安全、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的手段，而不斷鑒定發(fā)現(xiàn)抗病種質(zhì)，發(fā)掘廣譜抗白葉枯病基因是進(jìn)行抗病育種的前提。然而，僅用常規(guī)方法很難培育出對(duì)白葉枯病具有持久廣譜抗性的水稻品種。在自然和人工選擇的雙重壓力下病原菌不斷變異，特別是華南稻區(qū)白葉枯菌表現(xiàn)出種群多、毒性強(qiáng)等特點(diǎn)，如強(qiáng)毒菌V 型菌和IX 型菌在華南稻區(qū)首先被發(fā)現(xiàn)并向全國蔓延，進(jìn)而造成品種抗性減弱甚至喪失，抗病品種變成感病品種［5］。因此，對(duì)已知抗白葉枯病基因進(jìn)行評(píng)價(jià)與合理利用，不斷篩選新的優(yōu)良抗病種質(zhì)資源，發(fā)掘鑒定新的廣譜抗病基因，對(duì)培育具有持久抗性的水稻品種、保證水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)顯得十分必要?，F(xiàn)代生物技術(shù)工具（特別是分子標(biāo)記）的應(yīng)用，促進(jìn)了抗白葉枯病基因的克隆。本文歸納總結(jié)了近年來在水稻白葉枯病研究方面取得的一些進(jìn)展，對(duì)生產(chǎn)上應(yīng)用較好的3 個(gè)主效抗白葉枯病基因進(jìn)行了詳細(xì)闡述與評(píng)價(jià)，并對(duì)白葉枯病抗病育種現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)和展望，以期為生產(chǎn)上有效防治該病害提供參考。

1 水稻白葉枯病基因的挖掘和研究

黃單胞桿菌主要通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌不同的效應(yīng)蛋白來攻擊宿主植物，抑制宿主免疫并從中獲取營養(yǎng)。水稻黃單胞桿菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白可分為兩大類，即轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)蛋白（Transcription Activator-Like Effectors，TALE）和非TALE（又稱為Xops）［6-7］，水稻在應(yīng)對(duì)白葉枯病菌效應(yīng)蛋白入侵時(shí)采取多種方式進(jìn)行防御。白葉枯病菌與水稻互作，符合“基因?qū)颉保╣ene-for-gene）關(guān)系，水稻的抗?。≧）基因或感病（S）基因被病菌中對(duì)應(yīng)匹配的無毒（arv）基因或毒性（vir）基因激活，水稻才表現(xiàn)出抗病或感病。

目前，經(jīng)國際注冊(cè)確認(rèn)和期刊報(bào)道的水稻白葉枯病抗性基因有46 個(gè)、感病基因有2 個(gè)，這些基因?qū)Σ煌兹~枯致病小種有不同的抗譜。而已被分離克隆的主效基因或等位基因只有16 個(gè)，分別 為Xa1、Xa2、Xa31、Xa14、Xa45(t)、xa13、xa25、xa41(t)、xa5、Xa10、Xa23、Xa27、Xa7、Xa3/Xa26、Xa4和Xa21（表1）。根據(jù)對(duì)TALE效應(yīng)蛋白和非TALE 效應(yīng)蛋白的不同抗病機(jī)制與蛋白結(jié)構(gòu)，上述16 個(gè)抗病基因主要編碼NBSLRR（Nucleotide binding site-leucine-rich repeats）類〔Xa1、Xa2、Xa14、Xa31(t) 和Xa45(t)〕、MtN3/saliva家族〔xa13、xa25、xa41(t)〕、轉(zhuǎn)錄因子ⅡA（TFIIA）γ 亞基（xa5）、Executor R Protein Receptor（Xa10、Xa23、Xa27、Xa7）、類受體激酶（Receptor-Like Kinase，RLK）（Xa21、Xa3/Xa26、Xa4）等5 類蛋白質(zhì)。

2 我國水稻白葉枯病菌致病型劃分與抗性基因評(píng)價(jià)

為了解我國水稻白葉枯病菌致病型的分化和變異動(dòng)態(tài)，合理布局生產(chǎn)上的抗病品種，植物病理學(xué)家分別采集不同稻作區(qū)水稻白葉枯病標(biāo)準(zhǔn)病葉，分離得到白葉枯病原菌，應(yīng)用不同類型寄主鑒別材料，根據(jù)寄主和病原菌之間的互作反應(yīng)劃分不同的致病型。方中達(dá)等［23］利用中國水稻白葉枯病統(tǒng)一鑒別寄主金剛30、Tetep、南粳15、Java14、IR26 對(duì)全國各地的菌系進(jìn)行聯(lián)合鑒定，最后將我國白葉枯病菌劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V、Ⅵ和Ⅶ共7 個(gè)致病型。王春連等［24］除發(fā)現(xiàn)7個(gè)與全國菌系聯(lián)合鑒定相同的致病型外，在云南還發(fā)現(xiàn)1 個(gè)致病性較弱的新致病型。曾列先等［6］在廣東省水稻白葉枯病病區(qū)采集標(biāo)準(zhǔn)病葉，分離提純到53 個(gè)病原菌株，采用中國水稻白葉枯病統(tǒng)一鑒別寄主金剛30、Tetep、南粳15、Java14、IR24，發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)新模式強(qiáng)致病菌型，該致病型可使上述鑒別寄主全部感病，其致病譜廣、毒性強(qiáng)，是一個(gè)高致病性菌株，且廣東生產(chǎn)上的主栽水稻品種對(duì)該菌型均無明顯抗性，嚴(yán)重威脅廣東水稻的安全生產(chǎn)，因此及早尋找具有針對(duì)性的有效抗性基因是防制該病的有效手段。李崗［25］用采自全國12 個(gè)省主要稻區(qū)的103 個(gè)水稻白葉枯菌，對(duì)30 個(gè)水稻品種進(jìn)行毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水稻品 種IRBB3（Xa3）和IRBB4（Xa4）對(duì)50% 以上的測(cè)試菌感病，而它們所含的抗病基因Xa3和Xa4是傳統(tǒng)品種中廣泛利用的抗病基因。近等基因系品種IRBB21（Xa21）擁有最廣的單基因抗性譜，IRBB50（Xa4+xa5）和IRBB54（xa5+Xa21）是抗病表現(xiàn)最好的雙抗病基因組合品種。陳功友等［26］在全國范圍內(nèi)采集了500 多株患水稻白葉枯病的水稻，并通過Southern 雜交對(duì)每個(gè)菌株的TALE 基因進(jìn)行檢測(cè)，選擇含抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa7、Xa13、Xa21、Xa23的近等基因系和輪回親本IR24 以及完成測(cè)序的日本晴等為鑒定材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含xa5、Xa7和Xa23基因的材料僅能被少數(shù)菌株侵染，對(duì)白葉枯病具有廣譜抗性。基于此，后文針對(duì)具有廣譜抗性且應(yīng)用廣泛的Xa23、Xa7和xa5基因作進(jìn)一步總結(jié)歸納。

3 廣譜抗病基因Xa23、Xa7 和xa5 的研究歷程

3.1 Xa23 的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制

水稻白葉枯病抗性基因Xa23來源于我國普通野生稻，對(duì)國內(nèi)外現(xiàn)有的白葉枯病鑒別菌株都表現(xiàn)出全生育期高抗性。1987—1991 年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院與廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院合作，經(jīng)多菌系復(fù)選篩選，從普通野生稻中篩選出全生育期高抗國際廣致病菌菲律賓6 號(hào)小種（P6）的新抗源RBB16，由于P6 能侵襲所有已命名的栽培稻抗白葉枯病基因，推測(cè)RBB16 可能攜帶新的抗病基因［27-28］。該抗性源攜帶的基因于2001 年被國際水稻新基因命名委員會(huì)正式命名為Xa23。Xa23具有全生育期抗性、完全顯性、抗性譜廣等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前水稻抗白葉枯病育種中應(yīng)用最廣泛的抗病基因之一［29-32］。

3.1.1Xa23的遺傳機(jī)理與定位克隆 章琦等［27］將Xa23基因轉(zhuǎn)入栽培稻金剛30 中，選育得到近等基因系CBB23，CBB23 全生育期高抗28 個(gè)菌系（包括10 個(gè)菲律賓鑒別小種、7 個(gè)中國致病型小種、3 個(gè)日本小種和8 個(gè)韓國主要致病小種），其抗譜和抗性遺傳能力均超過國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的Xa21基因。通過利用攜帶新基因的1 對(duì)近等基因系構(gòu)建F2作圖群體，篩選出160 個(gè)單株利用SSR標(biāo)記進(jìn)行基因定位，最初定位于水稻第11 號(hào)染色體上，與標(biāo)記OSR06 和RM224 圖距分別為5.3、27.7 cM。隨后潘海軍等［33］和王春連［34］構(gòu)建了以金剛30 為母本、CBB23 為父本的F2擴(kuò)大群體2 562 株，利用SSR 和RAPD 引物將Xa23精細(xì)定位于第11 號(hào)染色體長臂的標(biāo)記RpdH5 和RM206之間，遺傳距離分別為7.0、1.9 cM。王春連［34］通過EST 分子標(biāo)記繼續(xù)縮小區(qū)間，將Xa23限定于標(biāo)記C189 和CP02662 之間，遺傳距離縮小至0.8、1.3 cM，通過對(duì)候選基因分析，預(yù)測(cè)認(rèn)為最有可能的候選基因是LOC_Os11g37620。

王春連［34］用距離基因0.8 cM 的EST 標(biāo)記C189，擴(kuò)增Xa23的近等基因系CBB23 的基因組片段為探針，篩選水稻明恢63 的TAC 文庫和廣陸矮4 號(hào)的PAC 文庫；對(duì)獲得的7 個(gè)陽性克隆用酶切法和Tail-PCR 法進(jìn)行末端片段分離，獲得15 個(gè)末端片段，檢測(cè)抗感親本之間的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)末端片段；用這些末端片段作RFLP 標(biāo)記，對(duì)F2群體進(jìn)行檢測(cè)和連鎖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離依次為0.4、0.4、0.4、0.5、0.6、0.6、1.1 cM。雖然69B、70N 和81N 這3 個(gè)片段與Xa23的遺傳距離均為0.4 cM，但序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)69B 與70N 的物理距離為35 kb，與81N為95 kb，69B 為距Xa23最近。Lj13和Xa23之間的遺傳距離為1.1 cM，位于基因的另一側(cè)，而Lj204（Lj74）、Lj210、Lj215、Lj55與Xa23基因共分離。王春連繼而構(gòu)建了pCCl BAC 庫，利用緊密連鎖標(biāo)記Lj211和共分離標(biāo)記Lj74對(duì)BAC文庫進(jìn)行篩選，共獲得5 個(gè)陽性克隆，并建立了1 個(gè)交叉克隆群，最終將Xa23基因鎖定在BAC克隆608 中，利用脈沖電泳檢測(cè)到約80 kb 的插入片段。隨后利用鳥槍法對(duì)BAC 克隆608 進(jìn)行測(cè)序，獲得了72 115 bp 的DNA 序列?；蝾A(yù)測(cè)顯示共有12 個(gè)開放閱讀框（ORF），根據(jù)ORF 編碼產(chǎn)物的同源性比較和分子標(biāo)記定位結(jié)果，最終確定候選基因?yàn)? 個(gè)ORF。最終該團(tuán)隊(duì)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將篩選出的10 個(gè)候選基因克隆載體轉(zhuǎn)化感病品種，用潮霉素和Southern 雜交檢測(cè)抗性植株的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)高抗和中抗植株中同時(shí)存在單拷貝和雙拷貝，從而成功克隆該基因。

3.1.2Xa23介導(dǎo)的抗病機(jī)制Xa23屬于Executor抗性基因，EBE 啟動(dòng)子上的AvrXa23可以與Xoo中廣泛存在的無毒效應(yīng)因子AvrXa23結(jié)合，誘導(dǎo)Xa23基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Xa23編碼蛋白在受感染的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生HR 反應(yīng)，直接殺死受感染的細(xì)胞，限制細(xì)菌在宿主體內(nèi)的繼續(xù)繁殖，從而有效抵御白葉枯病進(jìn)一步侵襲［34］。

Xa23蛋白序列中與HR 相關(guān)的氨基酸研究表明，Xa23的氨基端和羧基端在引起HR 反應(yīng)中發(fā)揮的作用是相互獨(dú)立的，不能實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)，且改變位于羧基和氨基兩末端的關(guān)鍵氨基酸殘基的酸堿性質(zhì)不會(huì)影響最終HR 表型的結(jié)果。同時(shí)，崔華［35］還證實(shí)了Xa23的3 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域在HR 誘導(dǎo)功能中的重要存在價(jià)值。Xa23基因編碼1 個(gè)執(zhí)行R 蛋白，但是該基因與當(dāng)前已知的R基因并無太大同源性。Xa23編碼1 個(gè)由113 個(gè)氨基酸組成的蛋白，該蛋白與已知的執(zhí)行子R 蛋白Xa10 有一半相同，預(yù)測(cè)Xa23跨膜螺旋結(jié)構(gòu)與Xa10 重疊［35］。與Xa10不同的是，Xa23的轉(zhuǎn)錄由AvrXa23（在所有Xoo中檢測(cè)到的類激活因子）特異性激活，且其與感病的等位基因xa23具有相同的ORF，但它們的啟動(dòng)子區(qū)域不同，Xa23缺乏與AvrXa23的TALE 結(jié)合原件。這說明執(zhí)行子R基因家族成員蛋白通過與病原菌中同源的TALE識(shí)別而產(chǎn)生廣譜抗性。

3.1.3Xa23的進(jìn)化機(jī)制Xa23等位基因僅出現(xiàn)在稻屬中，其編碼區(qū)序列有較高的同源性。天然栽培稻中沒有檢測(cè)到EBEAvrXa23，顯性抗病基因Xa23只存在于野生稻中。278 份代表性水稻材料中只有97 份含有Xa23/xa23基因，表明該基因在水稻中并不廣泛。Xa23/xa23等位基因啟動(dòng)子的核苷酸序列多樣性顯著高于其編碼區(qū)，分為Pro-A、B、C、D、E 共5 種 單 倍 型。Pro-A是唯一含有EBEAvrXa23的單倍型，且只有這種單倍型具有抗病功能。5 種單倍型在地理分布上沒有顯著差異，Pro-A 僅存在于野生稻中，其他4 種單倍型分布于野生稻和栽培稻中，其中Pro-D單倍型的比例高達(dá)26.8%［35］。Xa23來源于普通野生稻，在水稻馴化育種過程中可能存在瓶頸效應(yīng)［36］。

3.2 Xa7 的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制

Xa7的研究始于20 世紀(jì)70 年代，最早從孟加拉國栽培品種DV85 中被發(fā)現(xiàn)［37］，對(duì)PXO61、PXO86、PXO79 和SCB4-1 具 有抗性，是孕穗期抗性的顯性基因。國際水稻所將Xa7基因轉(zhuǎn)育到感病品種IR24 中，獲得近等基因系IRBB7。Xa7屬于顯性R基因，對(duì)白葉枯病菌具有高抗、廣譜、持久和耐熱的抗性［38］。

3.2.1Xa7的遺傳機(jī)理與定位克隆 在過去40 多年中，由于Xa7基因的廣譜抗病性，它一直是研究者所聚焦的重要基因。盡管Xa7基因發(fā)現(xiàn)得較早，但其定位與克隆的過程卻比較漫長，原因在于該基因遺傳位點(diǎn)的序列與參考基因組存在很大差異，導(dǎo)致國內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室在Xa7基因的定位克隆上一直未獲成功［39］。1995 年，Kaji 等［40］將Xa7基因定位于107.5 cM 的范圍內(nèi)。Porter等［41］利用近等基因系IRBB7 構(gòu)建作圖群體，通過AFLP、STS、SSR 等系列多態(tài)性分子標(biāo)記，將Xa7定位在M1 和M3 之間約2.7 cM 的距離。Chen 等［42］利用IR24/IRBB7 F2作圖群體，根據(jù)粳稻品種日本晴的參考基因組將Xa7基因定位于118.5 kb 的區(qū)間內(nèi)。經(jīng)過眾多研究者的不懈努力，最近該基因克隆取得了突破性進(jìn)展，Chen 等［42］和Luo 等［19］兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)于2021 幾乎同時(shí)克隆出Xa7基因。Wang 等［43］通過構(gòu)建BAC 文庫填補(bǔ)了Xa7定位基因座中的基因組缺口，與日本晴相比，IRBB7 中存在100 kb 非共線序列，利用BAC 的順序重疊克隆進(jìn)行互補(bǔ)轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)Xa7屬于孤兒基因，編碼一種與已知抗性蛋白不同的小蛋白。Xa7啟動(dòng)子中的27 bp 效應(yīng)物結(jié)合元件EBE 對(duì)于AvrXa7 誘導(dǎo)表達(dá)模型是必需的。Xa7錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，并觸發(fā)水稻和煙草中的程序性細(xì)胞死亡。眾多實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，Xa7對(duì)白葉枯病菌具有廣譜抗性，抗幾乎所有日本小種或亞種，同時(shí)也抗多種菲律賓小種［44］。與主效抗病基因Xa4和Xa10相比，Xa7具有更持久的水稻白葉枯病菌抗性［45］。

3.2.2Xa7介導(dǎo)的抗病機(jī)制與進(jìn)化 AvrXa7 是由Xoo的avrXa7基因所編碼的TALE 蛋白，具有雙重功能，不僅可引發(fā)Xa7所介導(dǎo)的抗病性，同時(shí)還可與OsSWEET14啟動(dòng)子上的TALE 結(jié)合元件EBE 結(jié)合，誘導(dǎo)OsSWEET14基因的表達(dá)，導(dǎo)致水稻感?。?1,46］。pthXo3是PXO61 的毒性基因，編碼TALE 蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，pthXo3與avrXa7高度同源，其編碼蛋白PthXo3 同樣可識(shí)別Xa7和OsSWEET14的啟動(dòng)子EBE 序列，提示pthXo3可能是Xa7的另一個(gè)無毒基因［47］。研究表明，Xoo的兩個(gè)重要TALE（AvrXa7 和PthXo3）對(duì)Xa7啟動(dòng)子EBE 的識(shí)別結(jié)合功能可能是導(dǎo)致Xa7具有廣譜抗性的重要原因，后續(xù)仍需要強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來證明。此外，諸多證據(jù)表明，Xa7在高溫條件下對(duì)白葉枯病具有更好的抗性，而其他大多數(shù)R基因卻相反［48］，目前還不清楚高溫條件下R基因喪失抗性的具體機(jī)制。不同溫度處理試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高溫條件下Xoo可誘導(dǎo)Xa7基因更快更高表達(dá)，推測(cè)可能是提前激活并增強(qiáng)水稻對(duì)Xoo的防御反應(yīng)［49］。對(duì)3 000 多個(gè)水稻品種的分析表明，Xa7基因在大多數(shù)品種、地方品種和野生稻材料中都不存在，但在與水稻屬最近的外群Leersia perrieri（中國菰與假稻）中發(fā)現(xiàn)了高度同源的Xa7。

3.3 xa5 的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制

xa5在孟加拉國地區(qū)的澳大利亞水稻品種DV85、DV86 和DZ78中發(fā)現(xiàn)，對(duì)PXO61 和PXO86 具有抗性，最初定位于第5 號(hào)染色體上［14］。該基因最初發(fā)現(xiàn)于供體品種DZ192 中，對(duì)菲律賓生理小種1、2、3、5 同時(shí)具有抗性。在國際水稻所的種質(zhì)資源圃中鑒定到一系列攜帶該基因的資源，并將這些品種歸類于DZ192 群，利用此類材料與IR24 配制近等基因系IRBB5。

3.3.1xa5的遺傳機(jī)理與定位克隆 來自水稻的xa5抗性基因?qū)λ景兹~枯病菌引起的水稻白葉枯病具有隱性、小種特異性抗性。Blair 等［50］通過構(gòu)建F2作圖群體，獲得1 016 個(gè)植株，在水稻5 號(hào)染色體遠(yuǎn)端設(shè)置44 個(gè)DNA 標(biāo)記，繪制了xa5周圍染色體區(qū)域的高分辨率遺傳圖，篩選重組單株；之后用接種菲律賓白葉枯病菌株P(guān)XO61的F3家族對(duì)重組F2個(gè)體進(jìn)行后代檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)xa5基因被映射到標(biāo)記RS7 和RM611 之間約0.5 cM區(qū)間范圍內(nèi)，該區(qū)間跨度約70 kb，共包含11 個(gè)ORF。該位點(diǎn)的序列數(shù)據(jù)是從覆蓋部分區(qū)域的Indica（IR24 等位線，IRBB21）BAC 中生成的，并與其他重疊的India（cv 9311）和Japonica（cv Nipponbare）序列進(jìn)行比較。候選基因分析顯示，1 個(gè)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子（TFIIa）、1 個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、1 個(gè)tRNA 合成酶、1 個(gè)MAP 激酶和1 個(gè)半胱氨酸蛋白酶，以及4 個(gè)未知、假設(shè)或推測(cè)的蛋白質(zhì)，可能是抗性基因的產(chǎn)物。鐘義明等［51］根據(jù)國際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃（IRGSP）、中國超雜交稻基因組計(jì)劃（SRGP）等，開發(fā)出12 個(gè)SSLP 和CAPS 標(biāo)記，用于進(jìn)一步精細(xì)定位，最終將xa5基因定位于標(biāo)記K5 和T4 之間0.3 cM 的區(qū)間范圍，約為24 kb，且與標(biāo)記T2 共分離。對(duì)24 kb 序列分析表明，1 個(gè)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體和1 個(gè)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子（TFIIa）可能是xa5抗性基因的產(chǎn)物。Iyer 等［14］發(fā)現(xiàn)xa5基因的cDNA 全長為906 bp，結(jié)構(gòu)中包含有3 個(gè)外顯子，編碼由106 個(gè)氨基酸組成的蛋白產(chǎn)物，該蛋白產(chǎn)物是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子TFIIA 的γ亞基；此外，還發(fā)現(xiàn)非SWEET等位基因的隱性抗白葉枯病基因xa5的作用范圍更廣。

3.3.2xa5介導(dǎo)的抗病機(jī)制 Iyer 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，隱性基因xa5與顯性基因Xa5相比，僅有兩個(gè)核苷酸的差異，使得第39 位的谷氨酸（抗?。┩蛔兂衫i氨酸（感?。?，從而造成功能轉(zhuǎn)變，并且這種氨基酸位點(diǎn)的突變?cè)斐傻墓δ苻D(zhuǎn)變也存在其他抗病和感病品種中。Iyer 等［52］發(fā)現(xiàn)，xa5介導(dǎo)的隱性抗病反應(yīng)是抑制病原菌的轉(zhuǎn)移而不是限制病原菌的增殖，表明其抗病表型與基因型的相關(guān)性都是保守的。xa5是全生育期抗性不完全隱性基因，與其等位顯性基因Xa5一樣是組成型表達(dá)。該基因的編碼產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子TFIIA 的γ 亞基，TFIIAγ 是真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，與果蠅和人的TFIIAγ 有50%的同源性，與擬南芥、玉米、大麥、甘蔗和小麥有85%～93%的同源性，大多數(shù)植物和水稻具有相同的TFIIA γ 易感性等位基因［53］。

4 水稻白葉枯病抗病育種現(xiàn)狀

近年來，水稻白葉枯病呈逐年加重趨勢(shì)，“老病新發(fā)”問題越來越嚴(yán)重，抗白葉枯病基因的鑒定和利用加快了其抗病育種的進(jìn)程，拓寬了栽培稻抗病性的遺傳來源。目前，利用抗白葉枯病基因的方法主要是通過常規(guī)育種結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）。近年來，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展和完善，編輯易感基因以獲得抗病材料的方法得到應(yīng)用。盡管迄今為止已有40 多個(gè)抗白葉枯病基因報(bào)道，但由于大多數(shù)抗性基因的抗譜較窄、隱性基因利用率低、抗病基因的不同功能不能重疊等原因，這些基因很少真正應(yīng)用于育種實(shí)踐。Xa3和Xa4基因曾在水稻白葉枯病抗性育種中發(fā)揮重要作用，但隨著病原菌的不斷變異，它們逐漸失去對(duì)白葉枯病菌的抗性。Xa21基因具有相對(duì)較廣的抗譜，一直在水稻抗白葉枯病育種中發(fā)揮作用。Xa7和Xa23基因的克隆為水稻抗白葉枯病提供了新的基因資源，對(duì)國內(nèi)外所有已鑒定的菌株都具有高度抗性，并且在水稻整個(gè)生長期都具有抗性且完全顯性，導(dǎo)入效應(yīng)也明顯，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.1 分子標(biāo)記輔助育種

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來MAS 在作物育種中的應(yīng)用越來越廣泛，特別是在提高作物抗性和精準(zhǔn)育種以提高品質(zhì)方面。優(yōu)良的基因是MAS 的前提，高效準(zhǔn)確的分子標(biāo)記是MAS 成功的關(guān)鍵。

MAS 育種克服了常規(guī)育種周期長、繁瑣等缺點(diǎn)，通過利用與抗白葉枯病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來跟蹤目標(biāo)基因，不受環(huán)境條件的限制和病原菌生理小種的影響，可在早代進(jìn)行選擇，短時(shí)間內(nèi)可選育出持久抗白葉枯病的水稻品種。如蘭艷榮等［54］利用常規(guī)雜交回交和MAS，獲得4 個(gè)分別攜帶Xa21和Xa7基因的株系，成功改良了華201S 的白葉枯病抗性。多基因聚合育種比如利用優(yōu)化的分子標(biāo)記和抗性鑒定，以雜交稻重要親本明恢86 為對(duì)象，選育出同時(shí)攜帶Xa21和Xa23的抗病品種。作者所在課題組利用常規(guī)轉(zhuǎn)育和MAS 相結(jié)合的方式，聚合Xa23、Pi1、Pi2基因改良兩系不育系粵晶1S 的抗性，最終獲得改良不育系臺(tái)S 和沃S，通過廣東省品種審定委員會(huì)鑒定并向四川臺(tái)沃種業(yè)有限責(zé)任公司進(jìn)行成果轉(zhuǎn)化［55］；獲得高抗白葉枯病水稻品種粵新銀占2 號(hào)（粵審稻20120041）、粵特油占（粵審稻20200060），并通過廣東省品種委員會(huì)審定［56］。然而，不是所有抗病基因都可以累加聚合，如隱性廣譜抗病基因xa5（轉(zhuǎn)錄因子TFⅡA γ 小亞基），病原菌分泌效應(yīng)子蛋白進(jìn)入細(xì)胞后，不能利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)來轉(zhuǎn)錄，宿主表現(xiàn)出抗病。而當(dāng)xa5與Xa23、Xa27、Xa7聚合時(shí)，病原菌效應(yīng)子AvrXa23、AvrXa27、AvrXa7 也不能利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，Xa23、Xa27、Xa7也就不能被病原菌誘導(dǎo)表達(dá)，抗病機(jī)制沒有啟動(dòng)，不但沒有增加水稻自身抗性，反而失去原本的抗病性。

4.2 轉(zhuǎn)基因育種

抗病品種的培育不是一勞永逸的，需要不斷利用輪換基因和多基因聚合等技術(shù)，以獲得廣譜并且具有持久抗性的品種。該方法在一定程度上可有效解決傳統(tǒng)育種中秈-粳雜交不育和栽培稻-野生稻雜交不親和等問題，并可大大縮短育種時(shí)間。劉玉晴［57］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將構(gòu)建的OsPR1a-OX轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)入到水稻受體4021 中，篩選鑒定OsPR1A超表達(dá)陽性純合株系OsPR10a-RNai和OsPR10a-OX，提高了對(duì)白葉枯病菌的抗性。黃大年等［58］利用轉(zhuǎn)基因的方法，通過在中百4 號(hào)和京引119 中轉(zhuǎn)入抗菌肽B基因，獲得具有明顯白葉枯病抗性的京引119-B 植株。何利娟［59］利用適用于多靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9 基因編輯載體，構(gòu)建靶向OsPi21和OsBON1基因的CRISPR/Cas9 基因編輯載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得水稻日本晴轉(zhuǎn)基因植株，檢測(cè)并得到相關(guān)轉(zhuǎn)基因突變材料。張小紅等［60］利用轉(zhuǎn)基因方法，獲得了Xa23的轉(zhuǎn)基因水稻，通過對(duì)這些轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有明顯的白葉枯病抗性。雖然通過轉(zhuǎn)基因方法可獲得白葉枯病抗性水稻，但獲得的水稻屬于轉(zhuǎn)基因水稻，到目前為止轉(zhuǎn)基因水稻尚未在國內(nèi)獲批進(jìn)行商業(yè)種植。

4.3 基因編輯育種

多數(shù)白葉枯抗病基因基于感病基因的點(diǎn)突變產(chǎn)生，如隱性抗病基因xa5是因1 個(gè)氨基酸突變導(dǎo)致；SWEET感病基因家族Xa13、Xa25和Xa41由于啟動(dòng)子存在TALE 結(jié)合元件，被病原菌識(shí)別而誘導(dǎo)表達(dá)［61］?；蚓庉嫺胁』騿?dòng)子區(qū)，影響SWEET基因啟動(dòng)子效應(yīng)結(jié)合元件與TALE蛋白結(jié)合，從而獲得白葉枯病抗性品種的方式具有廣闊的應(yīng)用前景。陳功友等［26］通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)水稻品種Kitaake 的3 個(gè)感病 基 因Xa13/OsSWEET11、Xa25/OsSWEET13、11N3/OsSWEET14進(jìn)行編輯，成功創(chuàng)制高抗白葉枯病的材料。Yang 等［62］通過修飾OsSWEET基因啟動(dòng)子區(qū)，成功獲得白葉枯病抗病品種。此外，某些TALE 依賴的顯性Xa基因表達(dá)受到限制。因此，通過編輯顯性抗病基因的啟動(dòng)子以擴(kuò)大基因抗譜，創(chuàng)造高品質(zhì)抗白葉枯病水稻，同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。

5 展望

白葉枯病的發(fā)病范圍廣泛，世界范圍內(nèi)除南極洲外其余各洲均有發(fā)現(xiàn)，尤其是中亞地區(qū)的中國、日本、印度等國家較嚴(yán)重。水稻病害是其產(chǎn)量損失的重大威脅，隨著生態(tài)環(huán)境的變化，高溫高濕天氣頻發(fā)，沿海地區(qū)臺(tái)風(fēng)侵?jǐn)_，水稻種子南繁北調(diào)，白葉枯病呈逐年加重的趨勢(shì)?；瘜W(xué)農(nóng)藥對(duì)該病害有一定的防治作用，但會(huì)造成環(huán)境污染生態(tài)破壞，并且增加種稻生產(chǎn)成本。利用寄主自身對(duì)白葉枯病的原始抗性，不僅能確保水稻產(chǎn)量，還能減輕因大量施用農(nóng)藥而造成的環(huán)境污染。經(jīng)過科研工作者的大量的育種實(shí)踐證明，挖掘并應(yīng)用白葉枯病抗性基因被認(rèn)為是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上最有效、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的防治白葉枯病的方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。

水稻的R基因和白葉枯病的TAL基因是長期相互選擇的結(jié)果，選擇壓力使得這兩類基因呈現(xiàn)多樣性，人類為防治白葉枯病所做的工作將是持久的。目前，抗譜較廣的基因有xa5、Xa7和Xa23，Xa7基因于2021 年才克隆，其抗譜僅次于Xa23，Xa23是分子育種使用最廣泛的一個(gè)基因，其田間效果總體最好，顯性抗病基因的聚合能有效增強(qiáng)水稻品種的抗病性。隱性抗病基因xa5編碼轉(zhuǎn)錄因子TFⅡA γ 小亞基，影響病原菌分泌一種效應(yīng)子蛋白進(jìn)入細(xì)胞后利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，宿主表現(xiàn)出抗病性。正因?yàn)槠渥饔脵C(jī)制不同，在xa5分別與Xa7和Xa23聚合后，并不能使抗性疊加，Xa7和Xa23基因的抗性被沉默?？梢?，并不是所有的白葉枯抗病基因都可以累加聚合，基礎(chǔ)研究對(duì)基因作用機(jī)制的研究十分有必要且須進(jìn)一步加強(qiáng)。

利用轉(zhuǎn)基因育種可以獲得抗白葉枯病水稻品種，但目前轉(zhuǎn)基因水稻尚未獲得種植許可，仍然處于材料儲(chǔ)備階段。利用基因編輯隱性抗病基因啟動(dòng)子區(qū)間TALE 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，病原菌無法誘導(dǎo)感病基因表達(dá)，從而成功創(chuàng)制高抗白葉枯病水稻材料，這也是未來值得研究的方向之一。