陳銀萍， 趙鎮(zhèn)賢， 丁浚剛， 王彤彤， 馬駿杰， 張鈺清

(蘭州交通大學環(huán)境與市政工程學院， 甘肅 蘭州 730070)

植物修復技術是利用超富集植物修復重金屬污染土壤的一項新興技術[1,2]，但由于超富集植物通常生長緩慢、生物量小，因此修復效率較低，從而限制了該技術的實際應用。修復效率不僅取決于植物對重金屬的吸收和積累效率，而且在很大程度上依賴于重金屬在土壤中的生物有效性和植物根系吸收重金屬的能力。研究表明：施加螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)、[s,s]-乙二胺二琥珀酸(EDDS)和氨基三乙酸(NTA)等[3,4]，可以活化土壤中的重金屬元素，促進重金屬離子向植物地上部轉移，從而提高東南景天(SedumalfrediiHance)對Cd污染土壤以及黑麥草(LoliumperenneLinn.)對Cu和Zn污染土壤的修復效率。在這些螯合劑中，易被生物降解的EDDS受到更為廣泛的關注[5]，例如：EDDS和NTA能誘導豨薟(SigesbeckiaorientalisLinn.)[6]和蕹菜(IpomoeaaquaticaForsk.)[7]有效修復Cd污染土壤；EDDS還能增加三葉鬼針草(BidenspilosaLinn.)對Cd的吸收和富集能力[8]。此外，微生物[9]和激素[10]等聯(lián)合作用，能夠強化EDDS和EDTA等對Cd和Pb污染土壤的修復效應，例如，植物生長調節(jié)劑(DA-6和6-BA)與EDDS聯(lián)合施用可促進龍葵(SolanumnigrumLinn.)的生長和Cd吸收[11]。

一氧化氮(NO)是植物生長調節(jié)信號分子之一，并參與植物對各種重金屬脅迫的信號應答[12]。在重金屬脅迫條件下，適宜濃度的外源NO可以通過提高植物抗氧化酶系統(tǒng)的活性來緩解脅迫傷害[13]；并通過促進纖維素的合成提高植物對重金屬的吸收和累積能力，提升葉綠素含量或修復損傷的葉綠體，從而增強植物的光合能力[14,15]。但是，目前關于NO與螯合劑聯(lián)用對植物生長和Cd吸收的影響效應尚缺乏明確的研究結論。

紫苜蓿(MedicagosativaLinn.)為多年生草本植物，具有生長快、適應能力強、根系發(fā)達、枝葉繁多、產量高等特點，并具有清除土壤中Cd、Cu、Zn等重金屬的潛力，是一種很有應用前景的污染土壤修復植物[16]。為了探究NO與螯合劑聯(lián)用對植物修復Cd污染土壤的作用效應，作者以紫苜蓿幼苗為研究材料，采用盆栽法研究了土壤Cd脅迫條件下不同濃度硝普鈉(SNP)和EDDS單一處理及復合處理對紫苜蓿生長、生理和Cd積累的影響，并對紫苜蓿生長和Cd積累指標間及其與SNP和EDDS濃度的相關性進行分析，以期明確NO與EDDS協(xié)同處理對植物修復Cd污染土壤的作用機制，為Cd污染土壤植物修復強化技術的應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

紫苜蓿品種‘甘農3號’(‘Gannong No. 3’)種子購于甘肅省農業(yè)科學研究院。EDDS和SNP均購自Sigma-Aldrich上海貿易有限公司，0.15 mmol·L-1SNP大約可產生小于0.2 μmol·L-1的NO[17]。

供試土壤為甘肅省蘭州市榆中縣周邊村莊農耕土的表層(0～20 cm)土壤，營養(yǎng)土購自蘭州市西固區(qū)林產品開發(fā)公司。將土壤風干后粉碎，過孔徑2 mm篩，與營養(yǎng)土等質量混勻，稱取2 kg混合基質分裝于配有托盤的花盆中(口徑20 cm、高度15 cm)，以CdCl2·2.5H2O模擬Cd污染土壤，以溶液的形式加入土壤中，直至土壤本底Cd質量濃度達到15 mg·kg-1；適量澆水，不定期翻動土壤，平衡21 d后開始實驗。

1.2 方法

1.2.1 幼苗培育方法 選取飽滿均勻的紫苜蓿種子，用體積分數(shù)1%NaClO溶液浸泡10 min，再用超純水沖洗干凈，晾干后播種至上述Cd污染土壤中，播種深度0.5 cm；置于溫度20 ℃～25 ℃、色溫6 500 K的條件下培養(yǎng)，光照時間為6:00—20:00；培養(yǎng)期間不定期更換花盆位置以消除邊際效應。待種子發(fā)芽后間苗，每盆保留55株。在幼苗生長過程中，以自來水(未檢測出Cd)澆灌，使土壤含水量保持在幼苗正常生長所需水平，不定期收集托盤中的滲漏液并倒回花盆中以防土壤中的Cd和養(yǎng)分流失，待紫苜蓿幼苗生長60 d后，用于SNP和EDDS處理。

1.2.2 實驗設計和處理方法 參考項目組前期的研究結果[16]確定SNP和EDDS的處理濃度，并設計單一和復合2類處理。SNP單一處理設置4個處理組：0.05 mmol·L-1SNP(T1S)、0.10 mmol·L-1SNP(T2S)、0.20 mmol·L-1SNP(T3S)和0.30 mmol·L-1SNP(T4S)。EDDS單一處理設置2個處理組：0.50 mmol·L-1EDDS(T1E)和1.50 mmol·L-1EDDS(T2E)。SNP和EDDS復合處理設置8個處理組：0.05 mmol·L-1SNP-0.50 mmol·L-1EDDS(T1S-1E)、0.10 mmol·L-1SNP-0.50 mmol·L-1EDDS(T2S-1E)、0.20 mmol·L-1SNP-0.50 mmol·L-1EDDS(T3S-1E)、0.30 mmol·L-1SNP-0.50 mmol·L-1EDDS(T4S-1E)、0.05 mmol·L-1SNP-1.50 mmol·L-1EDDS(T1S-2E)、0.10 mmol·L-1SNP-1.50 mmol·L-1EDDS(T2S-2E)、0.20 mmol·L-1SNP-1.50 mmol·L-1EDDS(T3S-2E)和0.30 mmol·L-1SNP-1.50 mmol·L-1EDDS(T4S-2E)。以不施用SNP和EDDS的Cd處理為對照(TCK)。

根據(jù)上述實驗設計配制不同濃度SNP和EDDS溶液，分別取100 mL SNP溶液噴施于紫苜蓿地上部分，取100 mL EDDS溶液施入土壤中，對照則施用同體積超純水。每處理3盆，每盆視為1個重復，處理7 d后測定各指標。

1.2.3 生長指標及根系活力和葉片光合色素含量測定 在不同處理的每個盆中各取5株完整植株，抖落根系土壤，依次用自來水和超純水分別沖洗3次，吸干表面水分，用直尺(精度1 mm)測量主根長和株高；將地上部與地下部分開，使用FA2204B型萬分之一電子天平(上海越平科學儀器有限公司)稱量地上部和地下部的鮮質量；隨后于105 ℃殺青30 min，并于75 ℃烘干至恒質量，冷卻后分別稱量地上部和地下部的干質量[18]。稱取紫苜蓿幼苗新鮮根系0.5 g，參照李合生[19]的方法測定根系活力；稱取紫苜蓿幼苗鮮葉0.2 g，參照李玲[20]的方法測定葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

1.2.4 植物和土壤中Cd含量測定 將烘干的地上部和地下部研磨成粉末，過孔徑0.18 mm篩，分別稱取0.5 g，參照文獻[21]中的方法，采用HNO3-HClO4體系進行消解處理，并用超純水定容至25 mL，用于Cd含量測定。

采用四分法采集盆中土壤，風干后研碎，過孔徑0.25 mm篩；稱取土壤樣品0.5 g，參照文獻[22]中的方法，采用HNO3-HCl-HF-HClO4體系進行消解處理，并用超純水定容至50 mL，用于Cd含量測定。

用220型火焰原子吸收分光光度計(美國Nicolet公司)測定植物和土壤樣品的Cd含量[23]，并計算Cd富集系數(shù)、Cd轉運系數(shù)和Cd修復效率，其中，Cd富集系數(shù)=植物Cd含量/處理后土壤Cd含量；Cd轉運系數(shù)=植物地上部Cd含量/植物地下部Cd含量；Cd修復效率=〔(處理前土壤Cd含量-處理后土壤Cd含量)/處理前土壤Cd含量〕×100%。

1.2.5 不同亞細胞組分中Cd含量測定 參照徐君等[24]的方法測定不同亞細胞組分中Cd含量并略加改動：取不同處理的完整植株，先用自來水沖洗干凈，再用20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液交換15 min，以除去根表面吸附的Cd2+，用超純水洗凈并吸干植株表面水分，將地上部和地下部分開，分別稱取2 g，加入5 mL預冷的提取液〔含250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.4)、1 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇(C4H10O2S2)，4 ℃〕，冰浴研磨至勻漿，于4 ℃下600g離心10 min，沉淀為細胞壁組分；上清液于4 ℃下1 000g離心20 min，沉淀為細胞器組分；上清液于4 ℃下10 000g離心20 min，沉淀為線粒體組分；上清液為可溶部分(含細胞質、細胞液、核糖和各類蛋白質等)，可直接用于Cd含量測定。細胞壁、細胞器和線粒體組分則參照文獻[21]中的方法，采用HNO3-HClO4體系進行消解處理，并用超純水定容至25 mL；用220型火焰原子分光光度計分別測定各亞細胞組分中的Cd含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用EXCEL 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)、Duncan’s多重比較及Pearson相關性分析(雙尾檢驗)。

2 結果和分析

2.1 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿生長的影響

土壤Cd脅迫條件下經不同濃度SNP和EDDS處理后紫苜蓿株高、根長以及地上部和地下部的鮮質量和干質量的差異見表1。

結果顯示：土壤Cd脅迫條件下，不同濃度SNP單一處理使紫苜蓿的株高、主根長、地上部的鮮質量和干質量、地下部的鮮質量和干質量均高于對照，其中，株高與對照差異顯著(P<0.05)，0.10和0.20 mmol·L-1SNP單一處理組地上部鮮質量與對照差異顯著，0.20和0.30 mmol·L-1SNP單一處理組地下部的鮮質量和干質量以及0.10、0.20和0.30 mmol·L-1SNP單一處理組地上部干質量也與對照差異顯著，但4個SNP單一處理組的主根長與對照無顯著差異。隨SNP濃度的升高，各項生長指標均呈先升高后降低的變化趨勢，其中，0.20 mmol·L-1SNP單一處理組各項生長指標均最高，較對照分別增加了75.81%、106.23%、108.06%、79.78%和229.17%。

由表1可以看出：土壤Cd脅迫條件下，0.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿株高、地上部的鮮質量和干質量、地下部的鮮質量和干質量均不同程度提高，較對照分別增加了35.48%、30.03%和66.13%、35.96%和95.83%，而主根長則較對照減小，但無顯著差異。經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿的各項生長指標總體上隨SNP濃度升高呈先升高后降低的變化趨勢。其中，SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，紫苜蓿的株高、主根長、地上部鮮質量和地下部干質量最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了47.05%、29.82%、59.91%和72.34%；SNP濃度為0.20 mmol·L-1時，紫苜蓿的地上部干質量和地下部鮮質量最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了49.51%和51.24%。

由表1還可以看出：土壤Cd脅迫條件下，1.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿株高、地上部的鮮質量和干質量、地下部的鮮質量和干質量均不同程度提高，較對照分別增加了31.94%、70.82和53.23%、25.84%和100.00%，而主根長則較對照減小，但無顯著差異。經不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿的株高、主根長、地上部的鮮質量和干質量、地下部鮮質量均隨SNP濃度升高呈先升高后降低的變化趨勢，而地上部鮮質量隨SNP濃度升高大體呈逐漸降低的變化趨勢。其中，SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，紫苜蓿的株高、地上部干質量和地下部鮮質量最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了33.25%、35.79%和25.00%；SNP濃度為0.05 mmol·L-1時，主根長和地下部干質量最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了20.25%和25.00%。

比較可見，經SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理，紫苜蓿的多項生長指標高于同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組，部分指標也高于同濃度SNP單一處理組。0.10 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的株高、地上部鮮質量和地下部干質量在所有處理組中最高，而0.20 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的地上部干質量和地下部鮮質量在所有處理組中最高。

表1 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿生長的影響

2.2 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿根系活力和葉片光合色素含量的影響

土壤Cd脅迫條件下經不同濃度SNP和EDDS處理后紫苜蓿根系活力及葉片光合色素含量的差異見表2。

結果顯示：土壤Cd脅迫條件下，不同濃度SNP單一處理使紫苜蓿根系活力和葉片光合色素含量高于對照，其中，經0.10～0.30 mmol·L-1SNP單一處理后根系活力和各項葉綠素含量指標均顯著高于對照，但類胡蘿卜素含量無顯著差異。隨SNP濃度的升高，紫苜蓿根系活力和類胡蘿卜素含量逐漸增高，在SNP濃度為0.30 mmol·L-1時達到最大值，較對照分別增加了110.01%和24.81%；葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量隨SNP濃度升高呈先升高后降低的變化趨勢，在SNP濃度為0.20 mmol·L-1時最高，較對照分別增加了37.67%、26.06%和34.06%。

由表2可以看出：土壤Cd脅迫條件下，0.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿葉綠素b和總葉綠素含量顯著減少，較對照分別減少了12.96%和5.76%；而根系活力、葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量則與對照無顯著差異。經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿根系活力和光合色素含量高于對照和0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且總體上差異顯著。隨SNP濃度升高，SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的根系活力和光合色素含量均呈先升高后降低的變化趨勢。其中，SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，根系活力以及葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素的含量均最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了149.68%、44.82%、57.96%、38.09%和48.58%。

由表2還可以看出：土壤Cd脅迫條件下，1.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿葉綠素a和類胡蘿卜素含量較對照分別增加了8.02%和12.52%，且差異顯著；而葉綠素b含量較對照降低了5.46%，且差異顯著；根系活力和總葉綠素含量高于對照，但差異不顯著。經0.05～0.20 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿的根系活力及光合色素含量總體上均高于對照和1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且差異顯著。隨SNP濃度升高，SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的根系活力和光合色素含量總體上呈先升高后降低的變化趨勢。其中，SNP濃度為0.20 mmol·L-1時，根系活力最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組增加了52.67%；在SNP濃度為0.05 mmol·L-1時，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總葉綠素的含量均最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增高了19.60%、29.21%、13.16%和22.32%。

表2 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿根系活力和葉片光合色素含量的影響

比較可見，0.10 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的根系活力和光合色素含量在所有處理組中均最高。

2.3 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿Cd積累及Cd轉運和修復效率的影響

土壤Cd脅迫條件下經不同濃度SNP和EDDS處理后紫苜蓿Cd含量、Cd轉運系數(shù)和Cd富集系數(shù)以及土壤Cd含量和Cd修復效率見表3。

結果顯示：土壤Cd脅迫條件下，不同濃度SNP單一處理使紫苜蓿地上部和地下部Cd含量、Cd轉運系數(shù)、地上部和地下部的Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率均高于對照，土壤Cd含量均低于對照，且差異顯著。隨SNP濃度升高，地上部的Cd含量和Cd富集系數(shù)均呈逐漸升高的變化趨勢，而地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率均呈先升高后降低的變化趨勢，土壤Cd含量呈先降低后升高的變化趨勢。其中，SNP濃度為0.30 mmol·L-1時，地上部的Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd轉運系數(shù)均最高，較對照分別增加了82.29%、29.03%和85.58%；地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率也較高，較對照分別增加了42.57%、45.62%和66.89%；土壤Cd含量較對照減少了1.99%。

表3 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿Cd含量、Cd轉運系數(shù)和Cd富集系數(shù)以及土壤Cd含量和Cd修復效率的影響

由表3可以看出：土壤Cd脅迫條件下，0.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿地上部和地下部的Cd含量、Cd轉運系數(shù)、地上部和地下部的Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率均高于對照，其中，地上部Cd含量、Cd轉運系數(shù)、地上部Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率均與對照差異顯著。經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿地上部和地下部Cd含量、地上部和地下部Cd富集系數(shù)及Cd修復效率均高于對照和0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組；而Cd轉運系數(shù)則高于對照但低于0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且差異顯著；土壤Cd含量低于對照和0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且與對照差異顯著。其中，SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)均最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了99.72%和81.03%；SNP濃度為0.20 mmol·L-1時，地上部的Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率均最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了33.62%、36.05%和42.66%，土壤Cd含量最低，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組降低了1.95%。

由表3還可以看出：土壤Cd脅迫條件下，1.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿地上部和地下部的Cd含量、Cd轉運系數(shù)、地上部和地下部的Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率均高于對照，而土壤Cd含量低于對照，且差異顯著。經不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿地上部和地下部的Cd含量、地上部和地下部的Cd富集系數(shù)和Cd修復效率均高于對照，且差異顯著。與1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組相比，0.05 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的各項指標均無顯著差異，而其他復合處理組各項指標均較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組存在不同程度差異。其中，經0.10～0.30 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)及土壤Cd含量均高于1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，而Cd轉運系數(shù)和Cd修復效率則均低于后者，且差異顯著；僅0.30 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組地上部的Cd含量和Cd富集系數(shù)顯著低于1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組。

比較可見，1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組地上部和地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd轉運系數(shù)和Cd修復效率均高于0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，土壤Cd含量則低于0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組。0.10 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的地下部Cd含量和Cd富集系數(shù)在所有處理組中均最高，0.20 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的地上部Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率在所有處理組中均最高，而土壤Cd含量在所有處理組中最低。

總體上看，紫苜蓿地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)大幅度高于地上部，表明根系是紫苜蓿吸收和積累Cd的主要器官。

2.4 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿不同亞細胞組分中Cd含量的影響

土壤Cd脅迫條件下經不同濃度SNP和EDDS處理后紫苜蓿地上部和地下部不同亞細胞組分中Cd含量的差異分別見表4和表5。

2.4.1 地上部亞細胞組分中Cd含量的差異 結果顯示：在土壤Cd脅迫條件下，不同濃度SNP單一處理總體上使紫苜蓿地上部各亞細胞組分的Cd含量較對照顯著增加。隨SNP濃度升高，地上部各亞細胞組分的Cd含量總體上呈逐漸升高的變化趨勢，SNP濃度為0.30 mmol·L-1時，地上部細胞壁、細胞器和可溶部分的Cd含量均最高，較對照分別增加了64.81%、52.41%和95.36%。

由表4可以看出：土壤Cd脅迫條件下，0.50 mmol·L-1EDDS單一處理以及不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理均可使紫苜蓿地上部各亞細胞組分的Cd含量較對照顯著增加。經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿地上部細胞壁和可溶部分的Cd含量均較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組顯著增加，且隨SNP濃度升高均呈先升高后降低的變化趨勢，在SNP濃度為0.20 mmol·L-1時最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了17.39%和49.24%；而細胞器和線粒體的Cd含量總體上與后者無顯著差異。

表4 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿地上部的亞細胞組分中Cd含量的影響

由表4還可以看出：土壤Cd脅迫條件下，1.50 mmol·L-1EDDS單一處理以及不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理均可使紫苜蓿地上部各亞細胞組分的Cd含量較對照顯著增加。經不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，紫苜蓿地上部細胞壁、細胞器和線粒體的Cd含量均低于1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且總體上隨SNP濃度升高呈逐漸降低的變化趨勢，其中，與1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組相比，細胞壁和細胞器的Cd含量無顯著差異，0.10～0.30 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的線粒體Cd含量則差異顯著；可溶部分Cd含量隨SNP濃度升高呈先升高后降低的變化趨勢，在SNP濃度為0.10 mmol·L-1時最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組增加了8.98%。

總體上看，在所有處理組中，紫苜蓿地上部細胞壁、細胞器和線粒體的Cd含量均以1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組最高，可溶部分Cd含量則以0.10 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組最高。

2.4.2 地下部亞細胞組分中Cd含量的差異 由表5可見：在土壤Cd脅迫條件下，不同濃度SNP單一處理總體上可使紫苜蓿地下部細胞器和可溶部分的Cd含量較對照顯著升高，但線粒體的Cd含量與對照無顯著差異；而細胞壁的Cd含量則在SNP濃度為0.05和0.10 mmol·L-1時顯著低于對照，在SNP濃度為0.20 mmol·L-1時顯著高于對照。隨SNP濃度升高，地下部各亞細胞組分的Cd含量總體上呈波動升高的變化趨勢。其中，SNP濃度為0.20 mmol·L-1時，細胞壁和可溶部分的Cd含量最高，較對照分別增加了3.39%和141.86%。

由表5可以看出：在土壤Cd脅迫條件下，0.50 mmol·L-1EDDS單一處理使紫苜蓿地下部細胞器、線粒體和可溶部分的Cd含量顯著高于對照，但細胞壁的Cd含量顯著低于對照。經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理，地下部細胞壁和可溶部分的Cd含量顯著高于對照和0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且隨SNP濃度升高均呈先高后低的變化趨勢；線粒體的Cd含量顯著高于對照，但與0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組無顯著差異；而細胞器的Cd含量顯著低于0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組，且僅0.10 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理組的Cd含量顯著高于對照，其他復合處理組與對照無顯著差異。SNP濃度為0.20 mmol·L-1時，地下部可溶部分Cd含量最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組增加了149.56%；SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，地下部細胞壁的Cd含量最高，較0.50 mmol·L-1EDDS單一處理組增加了65.19%。

表5 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理對紫苜蓿地下部的亞細胞組分中Cd含量的影響

由表5還可以看出：在土壤Cd脅迫條件下，經1.50 mmol·L-1EDDS單一處理后紫苜蓿地下部可溶部分的Cd含量顯著高于對照，但細胞壁、細胞器和線粒體的Cd含量與對照無顯著差異。經不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理，地下部各亞細胞組分的Cd含量均隨SNP濃度升高呈“降低—升高—降低”的變化趨勢；0.10～0.30 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組地下部細胞壁、線粒體和可溶部分的Cd含量顯著高于對照和1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組；與對照和1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組相比，0.05 mmol·L-1SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理組地下部細胞壁和線粒體的Cd含量無顯著差異，但細胞器的Cd含量顯著降低，可溶部分的Cd含量較對照顯著增加，但與1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組無顯著差異。SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，地下部細胞器、線粒體和可溶部分的Cd含量均最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組分別增加了32.91%、42.43%和46.41%；SNP濃度為0.20 mmol·L-1時地下部細胞壁的Cd含量最高，較1.50 mmol·L-1EDDS單一處理組增加了32.51%。

總體分析發(fā)現(xiàn)，不論是地上部還是地下部，細胞壁和可溶部分的Cd含量均大幅度高于細胞器和線粒體的Cd含量，Cd含量從高至低依次為細胞壁、可溶部分、細胞器、線粒體，表明Cd主要沉積于細胞壁和細胞質(液泡)中；且地下部各亞細胞組分的Cd含量明顯高于地上部，表明根系是紫苜蓿Cd吸收和積累的主要器官。比較可見，SNP與0.50和1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，各亞細胞組分的Cd含量大多高于同濃度SNP單一處理組。

2.5 紫苜蓿生長和Cd積累指標間及其與SNP和EDDS濃度的相關性

在土壤Cd脅迫條件下，紫苜蓿地上部和地下部生長和Cd積累指標間及其與不同處理組SNP濃度和EDDS濃度的相關系數(shù)分別見表6、表7和表8。

表6 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理后紫苜蓿地上部生長和Cd積累指標間的相關系數(shù)1)

表7 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理后紫苜蓿地下部生長和Cd積累指標間的相關系數(shù)1)

2.5.1 地上部生長和Cd積累指標間的相關性 由表6可見：在SNP單一處理條件下，紫苜蓿地上部干質量與鮮質量呈極顯著正相關，Cd含量與Cd富集系數(shù)也呈極顯著正相關。經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，僅株高與地上部干質量、Cd含量和Cd富集系數(shù)的相關性未達顯著水平，其他指標間均呈極顯著或顯著正相關。在EDDS單一處理和不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理條件下，僅Cd含量與Cd富集系數(shù)呈極顯著正相關，其他指標間的相關性均未達顯著水平。

2.5.2 地下部生長和Cd積累指標間的相關性 由表7可見：在SNP單一處理條件下，紫苜蓿地下部僅主根長與其他指標間的相關性未達顯著水平，其他4個指標間均呈極顯著正相關。在EDDS單一處理條件下，僅主根長與干質量呈顯著負相關，Cd含量與Cd富集系數(shù)呈顯著正相關；經不同濃度SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，僅干質量與主根長和Cd含量呈顯著正相關，Cd含量與Cd富集系數(shù)呈極顯著正相關；經不同濃度SNP與1.50 mmol·L-1

表8 土壤Cd脅迫條件下SNP和EDDS處理濃度與紫苜蓿地上部和地下部生長和Cd積累指標的相關系數(shù)1)

EDDS復合處理后，僅鮮質量與干質量以及Cd含量與Cd富集系數(shù)呈極顯著正相關。

2.5.3 生長和Cd積累指標與SNP和EDDS處理濃度的相關性 由表8可見：在SNP單一處理條件下，紫苜蓿地上部Cd含量和Cd 富集系數(shù)均與SNP濃度呈顯著正相關，地下部的鮮質量、干質量、Cd含量和Cd富集系數(shù)也與SNP濃度呈顯著正相關。經SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，SNP濃度與地上部和地下部的各項生長指標均呈正相關，但相關性未達顯著水平；而經SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理后，SNP濃度與地上部和地下部的各項生長指標均呈不顯著負相關，與地上部的Cd含量和Cd富集系數(shù)呈顯著負相關，與地下部的Cd含量和Cd富集系數(shù)呈不顯著正相關。在EDDS單一處理條件下，紫苜蓿地上部和地下部的各項生長和Cd積累指標均與EDDS濃度無顯著相關性。

3 討論和結論

3.1 外源NO和EDDS處理對土壤Cd脅迫條件下紫苜蓿生長的影響效應

修復植物的生物量是權衡修復效率及篩選修復植物的重要因子和指標。作者在前期研究中[25]發(fā)現(xiàn)，與對照相比，低濃度Cd處理能促進紫苜蓿幼苗根和莖的生長，提高葉片葉綠素含量，增強SOD和POD活性，并以此緩解Cd脅迫造成的膜脂過氧化損傷。本研究中，在土壤15 mg·kg-1Cd脅迫條件下，單施不同濃度SNP和EDDS也能夠促進紫苜蓿地上部的生長及地上部和地下部的干物質積累，但隨SNP和EDDS濃度的升高，這種促進作用減弱，這與周萬海等[26]的研究結果一致。

研究結果表明：SNP與EDDS復合處理對紫苜蓿生長及部分生理指標的影響效應因SNP與EDDS濃度不同存在明顯差異，其中，0.10 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理對紫苜蓿的株高、主根長、地上部和地下部的鮮質量和干質量，以及根系活力及光合色素含量均有不同程度的促進作用，但若SNP和EDDS濃度分別超過0.20和0.50 mmol·L-1，二者復合處理對紫苜蓿的生長指標、根系活力以及光合色素含量具有不同程度的抑制作用，說明適宜濃度的SNP與EDDS復合處理具有“協(xié)同作用”，能有效促進紫苜蓿幼苗的生長。楊波等[8]的研究結果也表明：Cd脅迫條件下，使用較低濃度的EDDS有利于三葉鬼針草幼苗的生長；蔣文博等[27]認為，在低鹽脅迫下，SNP濃度超過一定量時對植物生物量有顯著抑制作用。造成上述結果的原因可能是高濃度EDDS可增強重金屬的溶解性，破壞植株體內的礦質元素平衡，從而導致生物膜結構破壞、細胞代謝紊亂，使光合色素的合成和積累減少，抑制光合作用，最終影響植株的生長發(fā)育[28]；此外，過量的外源NO也可抑制光合色素合成，破壞光合電子傳遞鏈，造成DNA損傷，并抑制植株的生長發(fā)育[29]。

3.2 外源NO和EDDS處理對土壤Cd脅迫條件下紫苜蓿Cd吸收和積累的影響效應

將螯合劑應用于重金屬污染土壤的植物修復，主要是因為螯合劑能夠使土壤中的重金屬解吸，或螯合劑與重金屬離子螯合，增加金屬流動性，或促進土壤中不易被生物吸收的重金屬形態(tài)向生物有效態(tài)轉化，從而增加植物對重金屬的吸收[4,5]。本研究中，土壤Cd脅迫條件下，單施不同濃度SNP或EDDS后，紫苜蓿地上部和地下部Cd含量總體上升高，且SNP和EDDS濃度越高，Cd含量也越高；相關性分析結果也顯示紫苜蓿地上部和地下部的Cd含量及富集系數(shù)均與SNP濃度呈顯著正相關，與EDDS濃度呈正相關，說明單獨施加外源NO或EDDS均能促進紫苜蓿對Cd的吸收富集。

研究結果表明：不同濃度SNP與EDDS復合處理能進一步提高紫苜蓿不同部位的Cd含量，但不同濃度EDDS的影響效應不同。其中，SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理時，隨SNP濃度升高，紫苜蓿地上部和地下部Cd含量呈先升高后降低的變化趨勢；SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理時，隨SNP濃度升高地上部Cd含量總體下降，而地下部Cd含量則先升高后降低，說明采用適宜濃度的SNP與EDDS復合處理能對紫苜蓿吸收Cd產生“協(xié)同作用”。冉烈等[30]對東南景天(SedumalfrediiHance)和袁菊紅等[31]對彩葉草(ColeushybridusHort. ex Cobeau)的相關研究也獲得了類似的結論。因而，根據(jù)植物對重金屬的解毒機制[32]，在相同EDDS濃度條件下，添加適宜濃度的SNP有利于紫苜蓿不同部位對Cd的解毒作用。

高濃度SNP與EDDS復合處理使紫苜蓿對Cd的富集作用減弱，可能是因為SNP與EDDS作為外源化學制劑，施用濃度超過了植物的耐受限度，對植物造成了損傷，引起代謝失調、細胞膜系統(tǒng)受損，使植物生長受到抑制，進而對Cd的吸收減少[3,8]。而適宜濃度的SNP與EDDS聯(lián)合施用則對提升紫苜蓿的Cd富集能力和轉運能力具有“協(xié)同作用”，其中，0.20 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理時，紫苜蓿地上部和地下部的Cd富集系數(shù)在所有處理中均最高，對Cd的修復效率也達到最大(6.22%)。相關性分析結果表明：SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理時，地上部和地下部的Cd富集系數(shù)均與SNP濃度正相關，而SNP與1.50 mmol·L-1EDDS復合處理時，地上部Cd富集系數(shù)與SNP濃度顯著負相關，說明SNP和EDDS濃度的變化對紫苜蓿不同部位對Cd的吸收和積累有較大影響，從而影響紫苜蓿不同部位的Cd含量，進而影響其修復效率。

3.3 外源NO和EDDS處理下紫苜蓿Cd吸收和積累的細胞學機制

細胞壁是重金屬離子進入植物細胞的第一道屏障，其金屬沉淀作用可能是一些植物耐重金屬的原因之一；液泡含有的蛋白質、糖、有機酸、有機堿等物質都能與重金屬離子結合，起到解毒作用，因而液泡常被認為是分隔重金屬離子的重要細胞器[33]。本研究中，不同處理條件下，紫苜蓿富集的Cd主要集中在細胞壁和可溶部分，這與作者前期的研究結果一致[25]。經適宜濃度的SNP與EDDS復合處理，當細胞壁上Cd的結合位點達到飽和時，Cd離子透過細胞膜轉運到原生質中，此時大量Cd離子累積在細胞質(含液泡)，實現(xiàn)了對Cd的區(qū)隔化作用；而細胞器和線粒體中的Cd含量明顯降低，避免了Cd對細胞器和線粒體的毒害，可見細胞壁的固持作用和液泡的區(qū)隔化作用是紫苜蓿應對Cd脅迫的重要防御機制之一。但是，當SNP和EDDS濃度超過一定范圍時，這種防御作用受到抑制。

3.4 結論

對上述研究結果進行綜合歸納和分析，結果表明：在土壤Cd脅迫條件下，單施SNP或EDDS均能促進紫苜蓿的生長，提高根系活力和葉綠素含量，促進地上部與地下部對Cd的吸收。適宜濃度的SNP與EDDS聯(lián)合施用能進一步促進紫苜蓿的生長和Cd富集，其中，在0.10 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理條件下，紫苜蓿的地下部Cd含量和Cd富集系數(shù)在所有處理組中均最高，其株高、地上部鮮質量、地下部干質量、根系活力以及光合色素含量也均最高；在0.20 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS復合處理條件下，紫苜蓿地上部Cd含量和Cd富集系數(shù)以及Cd修復效率在所有處理組中均最高，其地下部鮮質量和地上部干質量也均最高。因此，綜合考慮植株的生長狀況以及Cd吸收積累效應和修復效率，初步建議選用0.10～0.20 mmol·L-1SNP與0.50 mmol·L-1EDDS聯(lián)合施用，以強化紫苜蓿對Cd污染土壤的修復功能。

在亞細胞水平上，紫苜蓿細胞壁和可溶部分的Cd含量明顯高于細胞器和線粒體，表明紫苜蓿通過細胞壁的屏障作用增強其對Cd的耐性，并通過液泡的解毒作用降低Cd毒害，而施加SNP和EDDS有助于細胞壁中的Cd向可溶部分轉移及降低細胞器和線粒體中的Cd含量，說明SNP和EDDS的施用有利于紫苜蓿細胞對吸收的Cd進行解毒。

紫苜蓿對Cd的富集雖未達到Cd超富集植物的臨界標準，但從植株生長量、耐Cd能力及對Cd的吸收和轉化能力等方面綜合考慮，紫苜蓿在Cd污染土壤的植物修復中具備潛在的應用價值。

由于本文的實驗設計存在一定的不足，尤其是EDDS的濃度水平設置較為粗放，因而，在后續(xù)研究中將以本研究結果為基礎，采用正交實驗設計等更為科學的實驗設計方法，篩選出較為精準且易于實際應用的SNP和EDDS復合處理濃度，并采用分子生物學以及代謝組學等方法進一步研究SNP和EDDS聯(lián)合施用對紫苜蓿生長和Cd吸收積累的作用機制。