王國(guó)英,王瑞生,朱樹(shù)國(guó),王 勤,莫日根,周 剛*,朱葉青*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 2.呼和浩特市檢驗(yàn)檢測(cè)中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020; 3.呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

酪蛋白胨是以酪蛋白(從牛奶中提取,又稱干酪素、酪朊、乳酪素)作為原材料,經(jīng)胰蛋白酶消化水解、中和、過(guò)濾、濃縮精制而成的粉末。酪蛋白胨與一般蛋白胨相比水解程度更高、胨分子量分布更加均衡,國(guó)際上普遍將酪蛋白胨用作培養(yǎng)基的氮源[1]。然而國(guó)內(nèi)外普遍存在培養(yǎng)基質(zhì)量差異和批間質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題[2-4],酪蛋白胨作為培養(yǎng)基的主要原材料,其質(zhì)量已經(jīng)成為培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)提升產(chǎn)品質(zhì)量的瓶頸[5]。在我國(guó)培養(yǎng)基質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)較為落后[6],對(duì)培養(yǎng)基原料的系統(tǒng)研究較少[7],對(duì)酪蛋白胨的檢測(cè)指標(biāo)主要有pH值、澄明度、含水量、熾灼殘?jiān)⒑康萚8]。為了提升我國(guó)培養(yǎng)基的總體質(zhì)量,縮小與國(guó)際知名品牌培養(yǎng)基的差距,我們通過(guò)對(duì)酪蛋白胨中氨基酸進(jìn)行定量,來(lái)有效的控制培養(yǎng)基原材料的質(zhì)量。

目前,氨基酸的測(cè)定方法很多,有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]、離子色譜法[11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]、同位素質(zhì)譜法[14]等。氨基酸自動(dòng)分析儀法是最常用的一種分析方法[15-17],它是以陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為固定相,酸性緩沖液為流動(dòng)相,在柱后采用茚三酮溶液與氨基酸衍生生成具有可見(jiàn)光吸收的衍生物進(jìn)行檢測(cè),具有重復(fù)性好、儀器穩(wěn)定、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)[18]。本文通過(guò)對(duì)酪蛋白胨的水解條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了氨基酸分析儀測(cè)定酪蛋白胨中17種氨基酸的方法,該方法準(zhǔn)確、靈敏,填補(bǔ)了我國(guó)培養(yǎng)基原材料酪蛋白胨中氨基酸數(shù)據(jù)的空白,為研制純化學(xué)培養(yǎng)基以及提升我國(guó)培養(yǎng)基質(zhì)控水平提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氨基酸分析儀:S-433D型,德國(guó)sykam公司;微波消解儀:ETHOS UP型,德國(guó)Milestone公司;萬(wàn)分之一電子天平:ME204E型,瑞士Mettler Toledo公司;氮吹儀:N-EVAP-45型,美國(guó)Organomation公司;超純水機(jī):Milli-Q型,美國(guó)Milliproe公司。

17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品,和光純藥工業(yè)株式會(huì)社,日本;甲醇,色譜純,德國(guó)CNW公司;乙醇,色譜純,美國(guó)MREDA公司;檸檬酸三鈉(二水),優(yōu)級(jí)純,北京化工廠;鹽酸,優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;辛酸,優(yōu)級(jí)純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;氫氧化鈉,分析純,科茂化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸,分析純,天津盛奧化學(xué)試劑有限公司;硼酸,分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;苯酚,分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;EDTA,分析純,天津光復(fù)試劑有限公司;茚三酮,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

5批酪蛋白胨:錫林浩特市鼎安生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

緩沖A1:檸檬酸三鈉(二水)11.8 g,檸檬酸6.0 g,乙醇70mL,HCl(濃)5.6 mL,辛酸0.1 mL,純水定容至1000 mL,氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.45,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過(guò)濾。

緩沖B1:檸檬酸三鈉(二水)19.6 g,硼酸5.0 g,氫氧化鈉 3.1 g,辛酸0.1 mL,純水定容至1000 mL,氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值至10.85,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過(guò)濾。

再生液C1:氫氧化鈉 20.0 g,EDTA 0.2 g,純水定容至1000 mL,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過(guò)濾。

衍生試劑D1:20 g 茚三酮晶體,2 g苯酚,600 mL甲醇;緩慢攪拌到所有的茚三酮晶體完全溶解,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過(guò)濾,加入400 mL過(guò)濾后鉀鈉緩沖液(PH5.51),轉(zhuǎn)移到茚三酮試劑瓶中,氮?dú)鈴牡撞看荡蠹s3至5分鐘,加入VC后氮?dú)庠購(gòu)牡撞看荡蠹s3至5分鐘。

樣品稀釋液:檸檬酸三鈉(二水)11.8 g,檸檬酸6.0 g,HCI(濃)10.4 mL,辛酸0.1 mL,純水定容至1000 mL,氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值到2.20,0.45 μm 的有機(jī)系濾膜過(guò)濾。

精確吸取17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液,用超純水稀釋成37.5 μmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。根據(jù)需要再用超純水配成適當(dāng)濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

精密稱取混合混勻的樣品0.2 g(精確至0.0001 g)于消解管中,加入6 mol/L的鹽酸5 mL,密閉。水解功率1000 W,溫度150 ℃,消解40 min,冷卻后,轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻,移取 1.00 mL氮?dú)獯蹈?用5.00 mL稀釋液復(fù)溶,并用稀釋液定容至50 mL 容量瓶中,搖勻、過(guò)膜,注入氨基酸分析儀測(cè)定。

1.2.3 儀器工作參數(shù)

色譜柱:LCA K06/Na(4.6 mm×150 mm);衍生泵流速:0.25mL/min;柱溫:58 ℃; 高溫反應(yīng)器溫度:130℃;檢測(cè)波長(zhǎng):440nm(脯氨酸)、570 nm;進(jìn)樣量20 μL,洗脫方式:梯度洗脫,見(jiàn)表1。

圖1 17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖

表1 氨基酸分析儀泵參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 微波水解條件的優(yōu)化

微波水解溫度的優(yōu)化:在微波功率1000 W、水解時(shí)間40 min固定不變的情況下,分別考察水解溫度130 ℃、140 ℃、150 ℃、160 ℃、170 ℃、180 ℃對(duì)酪蛋白胨中各種氨基酸含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著測(cè)試溫度從130 ℃升高到180 ℃,氨基酸的總檢出量出現(xiàn)了先升高后下降的趨勢(shì),在150 ℃的時(shí)候,酪蛋白胨中總氨基酸的含量達(dá)到最大值,為845.37 g/kg,隨著溫度的繼續(xù)升高,胱氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、酪氨酸均有不同程度的下降,其他氨基酸逐漸趨于平穩(wěn),因此,我們最終選擇150℃作為水解溫度。

微波水解時(shí)間的優(yōu)化:在微波功率1000 W、水解溫度150 ℃條件下,水解時(shí)間在10～40 min時(shí),酪蛋白胨中氨基酸的總含量迅速升高,40 min時(shí)總氨基酸的含量高于其他各時(shí)間點(diǎn),40～50 min時(shí)趨于穩(wěn)定,沒(méi)有明顯增高,所以我們選擇40 min為最佳水解時(shí)間。

2.2 線性范圍、檢出限、定量限和精密度

按照優(yōu)化的方法進(jìn)行測(cè)定,采用外標(biāo)法定量,以氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/mL)、相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸分析,得到17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,見(jiàn)表2。結(jié)果表明各目標(biāo)物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998。分別以信噪比(S/N)的3倍和10倍進(jìn)樣濃度確定該法的最低檢出限和定量限分別為:0.02～1.22 g/kg、0.07～4.05 g/kg。

表2 17種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

同一混合均勻的酪蛋白胨樣品取6份,按照優(yōu)化好的方法進(jìn)行測(cè)定,氨基酸均有檢出,計(jì)算17種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,RSD的范圍為均≤4.5%,表明該方法的精密度良好。

2.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

精密稱取上述蛋白胨樣品6份,分別添加定量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在上述優(yōu)化的條件下進(jìn)行水解,測(cè)定氨基酸的含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表3,17種氨基酸的平均回收率為80.6%～106.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)≤4.9%。

表3 17種氨基酸的加標(biāo)回收率(n=6)

2.4 樣品的測(cè)定

按照上述建立的17種氨基酸含量的測(cè)定方法對(duì)5個(gè)批次酪蛋白胨進(jìn)行測(cè)定,氨基酸測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4,由測(cè)定結(jié)果可知酪蛋白胨中17種氨基酸均有檢出,其中含量最高的為谷氨酸,在172.36～182.93 g/kg之間,胱氨酸含量最低在1.17～2.86 g/kg之間,其他氨基酸含量在13.56～92.64 g/kg之間。氨基酸的含量約占到酪蛋白胨的77%以上。

表4 酪蛋白胨中17種氨基酸的含量(g/kg)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白胨為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)樣品水解條件的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,建立了經(jīng)過(guò)微波水解后使用氨基酸分析儀測(cè)定樣品中17種氨基酸含量的方法,該方法前處理所用時(shí)間短、所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠,適用于酪蛋白胨中氨基酸含量的測(cè)定,對(duì)于進(jìn)一步研究本品的蛋白質(zhì)和多肽組成具有重要的意義,為提升我國(guó)培養(yǎng)基評(píng)價(jià)規(guī)范提供了基礎(chǔ)的保障。