紀(jì)曉坤，馬 陽(yáng)，郭 曉，劉 穎，趙銀環(huán)，吳家寧，董律吏，杜 蕓

目前，靶向治療是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)臨床治療的重要手段和方法。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)指南推薦表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor recep-tor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)可作為敏感表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變患者的一線治療[1]。EGFR-TKIs能有效抑制EGFR敏感突變腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，用藥初期可獲得良好的效果，但隨后會(huì)出現(xiàn)明顯耐藥現(xiàn)象，嚴(yán)重影響治療效果和預(yù)后。溶酶體相關(guān)跨膜蛋白4B(lysosomal-associated transmembrane protein 4B, LAPTM4B)缺失增加了細(xì)胞膜通透性、pH值、組織蛋白酶釋放和細(xì)胞凋亡，在大多數(shù)腫瘤中過(guò)表達(dá)，與腫瘤增殖、耐藥，侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道LAPTM4B與EGFR關(guān)系密切[5]，但是LAPTM4B與NSCLC多基因突變狀態(tài)及EGFR-TKIs耐藥的關(guān)系尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)464例NSCLC細(xì)胞學(xué)標(biāo)本多基因突變狀態(tài)及LAPTM4B蛋白表達(dá)，探討LAPTM4B表達(dá)與多基因突變及臨床病理特征的關(guān)系；分析31例EGFR-TKIs靶向治療前標(biāo)本的LAPTM4B蛋白表達(dá)，評(píng)估EGFR-TKIs治療繼發(fā)耐藥基因T790M突變后LAPTM4B表達(dá)的變化，并探究LAPTM4B在EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2021年10月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心經(jīng)HE及免疫細(xì)胞化學(xué)染色確診為NSCLC的464例胸水及細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，離心沉淀，經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋等步驟制成細(xì)胞快[6]；并收集其中31例EGFR-TKIs靶向治療前的標(biāo)本及基因檢測(cè)結(jié)果。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)EGFR基因(18～21號(hào)外顯子)突變、ALK基因融合、ROS1基因融合、RET基因融合、K-RAS基因(2號(hào)外顯子)突變、BRAF基因(15號(hào)外顯子)突變、HER-2基因(20號(hào)外顯子)突變、NRAS基因(3號(hào)外顯子)突變、PIK3CA基因(20/9號(hào)外顯子)突變、c-MET基因(14號(hào)外顯子跳躍)突變。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自廈門(mén)艾德生物公司，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2免疫細(xì)胞化學(xué)染色 細(xì)胞塊4 μm厚切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脫蠟、乙醇梯度(100%、95%、70%)至水化，3%過(guò)氧化氫浸泡15 min，蒸餾水沖洗。pH 6.0的枸櫞酸鹽修復(fù)液高壓2 min，自然冷卻；PBS沖洗5 min。每張切片滴加50 μL LAPTM4B多克隆抗體(bs-9562R，Bioss公司)，4 ℃過(guò)夜。第2天，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加二抗，室溫孵育15 min；PBS沖洗3次，每次5 min。DAB顯色，終止時(shí)間視顯色強(qiáng)度決定。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3 min，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)后，梯度乙醇(70%、95%、100%)脫水，吹干后中性樹(shù)膠封固。

1.3 LAPTM4B染色結(jié)果判斷LAPTM4B染色評(píng)估由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理診斷醫(yī)師判讀，以陽(yáng)性癌細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度為評(píng)分依據(jù)。(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，10%～50%為1分，>50%為2分。(2)根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：未著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～2分為低表達(dá)組，3～4分為高表達(dá)組。

1.4 NSCLC細(xì)胞學(xué)標(biāo)本分化程度判讀由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師，綜合考慮腫瘤細(xì)胞的異型性和細(xì)胞塊的組織學(xué)形態(tài)進(jìn)行判讀[7-9]。高分化：腫瘤細(xì)胞常聚集成團(tuán)或簇狀，異型性小、形態(tài)相對(duì)較溫和，細(xì)胞核圓形或卵圓形，染色質(zhì)均勻細(xì)膩，可見(jiàn)核仁；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)分泌空泡或角化現(xiàn)象。細(xì)胞塊中腫瘤細(xì)胞可具有腺樣或鱗樣分化的特征，如腫瘤細(xì)胞呈腺腔樣、乳頭狀等排列或可見(jiàn)細(xì)胞間橋等；低分化：腫瘤細(xì)胞單個(gè)散在分布，高度異型性，可見(jiàn)瘤巨細(xì)胞，細(xì)胞核多形性明顯，染色質(zhì)染成粗塊狀、核仁不明顯；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分泌空泡少見(jiàn)。細(xì)胞塊中腫瘤細(xì)胞呈實(shí)性團(tuán)塊狀排列，細(xì)胞擁擠、重疊，細(xì)胞核明顯異型，染色質(zhì)粗糙，核仁不明顯。中分化：介于高分化和低分化之間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)性分析LAPTM4B蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。多因素Logistic回歸分析LAPTM4B蛋白表達(dá)與多基因突變狀態(tài)及EGFR-TKIs耐藥間的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC細(xì)胞學(xué)標(biāo)本多基因突變狀態(tài)464例NSCLC細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行多基因突變聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果示單基因突變365例(78.7%)、雙基因伴隨突變14例(3%)、野生型85例(18.3%)，陽(yáng)性率為81.7%。其中EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、HER-2、NRAS、c-MET基因突變率分別為59%、6%、3%、2%、4%、2%、2%、0.2%、1%。EGFR+PIK3CA、EGFR+BRAF、EGFR+HER-2、EGFR+RET、ALK+KRAS、EGFR+KRAS及RET+HER-2雙基因伴隨突變率分別為1%、0.4%、0.4%、0.4%、0.4%、0.2%、0.2%(圖1)。

圖1 464例非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞學(xué)標(biāo)本多基因突變狀態(tài)

2.2 LAPTM4B蛋白表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系本組464例NSCLC中男性222例，女性242例；≤65歲者253例，>65歲者211例；高分化77例，中分化120例，低分化267例。依據(jù)LAPTM4B染色評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)判讀LAPTM4B蛋白表達(dá)強(qiáng)度由低到高如圖2所示。LAPTM4B蛋白表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)關(guān)，與腫瘤分化程度呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌中LAPTM4B蛋白表達(dá)：A.不表達(dá)；B.低表達(dá)；C.高表達(dá)

表1 LAPTM4B表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LAPTM4B蛋白表達(dá)與多基因突變狀態(tài)的關(guān)系LAPTM4B蛋白表達(dá)與基因突變(P<0.001)及EGFR基因突變密切相關(guān)(P=0.001)；與ALK、ROS1、RET、KRAS、BRAF、HER-2、NRAS、PIK3CA、c-MET基因突變均無(wú)關(guān)(表2)。基因突變型病例相對(duì)于基因野生型病例，LAPTM4B蛋白表達(dá)增高的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=2.94，95%CI：1.804～4.791)。

表2 LAPTM4B表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌多基因突變狀態(tài)的關(guān)系

2.4 LAPTM4B蛋白表達(dá)與EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥的關(guān)系31例EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥基因T790M突變的NSCLC細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，其LAPTM4B蛋白表達(dá)水平高于與其配對(duì)的EGFR-TKIs治療前標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 LAPTM4B表達(dá)與EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥的關(guān)系

3 討論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中NSCLC占首位，5年生存率低于15%[10]。EGFR-TKIs或阿法替尼等其他ERBB酪氨酸激酶受體家族抑制劑的藥物是NSCLC患者EGFR敏感突變的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案，在晚期NSCLC患者中其有效緩解率為56%～74%，中位生存期為10～14個(gè)月[11-12]。然而，EGFR-TKIs治療后繼發(fā)的獲得性耐藥不可避免[13-14]，50%的獲得性耐藥是由EGFR-TKIs繼發(fā)EGFR基因20號(hào)外顯子T790M突變所引起的[15]。盡管EGFR突變的患者對(duì)EGFR-TKIs高度敏感，但約10%EGFR突變的NSCLC患者表現(xiàn)為原發(fā)耐藥[16]。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥的機(jī)制包括T790M突變、c-Met擴(kuò)增和PIK3CA突變[17-18]。由于獲得性耐藥的出現(xiàn)，大多數(shù)晚期NSCLC患者在開(kāi)始EGFR-TKIs治療1～2年內(nèi)病情進(jìn)展。因此，選擇合適的治療方案需要實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)患者基因突變狀態(tài)，但現(xiàn)有的基因突變檢測(cè)方法成本高、耗時(shí)久，不利于EGFR-TKIs耐藥的實(shí)時(shí)預(yù)測(cè)。LAPTM4B的出現(xiàn)可能成為監(jiān)測(cè)EGFR-TKIs耐藥的預(yù)測(cè)分子。

LAPTM4B首先在人肝細(xì)胞癌中被發(fā)現(xiàn)，是一種新型的致癌基因，定位于8q22.1染色體，其2個(gè)等位基因(AY219176和AY219177)分別編碼3.5×104和4.0×104的蛋白質(zhì)(LAPTM4B-35和LAPTM4B-40)。LAPTM4B-35在肝細(xì)胞癌、乳腺癌等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，其通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤增殖和化療耐藥，并通過(guò)富脯氨酸的結(jié)構(gòu)域與參與多種信號(hào)通路的含SH3結(jié)構(gòu)域的信號(hào)分子相互作用，促進(jìn)腫瘤遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道LAPTM4B與EGFR關(guān)系密切：(1)LAPTM4B可以通過(guò)阻斷活化的EGFR(active EGFR)腔內(nèi)聚集并抑制其溶酶體降解來(lái)增強(qiáng)和延長(zhǎng)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)；(2)非激酶依賴性的EGFR(inactive EGFR)與LAPTM4B共同定位于早期和晚期核內(nèi)體，在無(wú)血清環(huán)境中相互作用并相互穩(wěn)定[5]。雖然LAPTM4B可與EGFR相互作用，但其與NSCLC多基因突變狀態(tài)及EGFR-TKIs耐藥的關(guān)系尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)選用晚期NSCLC患者的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本為研究對(duì)象，避免疾病臨床分期及放、化療對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)LAPTM4B表達(dá)與NSCLC病理分化程度呈正相關(guān)，且與EGFR基因突變有關(guān)，但與KRAS、PI3CA、c-MET及NRAS等基因突變均無(wú)關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，KRAS、NRAS突變對(duì)EGFR-TKIs敏感性顯著降低[20-21]；PIK3CA與EGFR基因共突變可導(dǎo)致耐藥，影響EGFR-TKIs的治療療效[18]。5%～20%的EGFR-TKIs耐藥是由c-Met擴(kuò)增引起的[18,22]。結(jié)果顯示LAPTM4B表達(dá)與EGFR基因突變有關(guān)，為進(jìn)一步證實(shí)LAPTM4B表達(dá)與EGFR-TKIs耐藥的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)選取其中31例EGFR敏感突變患者接受EGFR-TKIs靶向治療后，繼發(fā)T790M突變產(chǎn)生繼發(fā)耐藥的標(biāo)本，并收集比較其相應(yīng)的EGFR-TKIs治療前配對(duì)標(biāo)本的LAPTM4B表達(dá)，結(jié)果顯示EGFR-TKIs治療后LAPTM4B表達(dá)顯著高于EGFR-TKIs治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果證實(shí)LAPTM4B表達(dá)與EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥基因T790M突變有關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，siRNAs降低LAPTM4B的表達(dá)可抑制自噬小體的成熟和自噬流的形成，而轉(zhuǎn)染LAPTM4B質(zhì)粒使其過(guò)表達(dá)可挽救并促進(jìn)代謝應(yīng)激中自噬流的形成，LAPTM4B過(guò)表達(dá)在自噬中發(fā)揮重要作用[23-24]。眾所周知，自噬既是腫瘤抑制機(jī)制亦是腫瘤保護(hù)機(jī)制，此“雙刃劍”的作用在腫瘤形成及治療中存在較大爭(zhēng)議。自噬可抵抗缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏和化療藥物暴露等惡劣環(huán)境，有助于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)壓力應(yīng)激并存活，因而自噬成為腫瘤的保護(hù)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)自噬在骨肉瘤、卵巢癌和肺癌的化療耐藥中發(fā)揮重要作用[24-27]。Tan等[5]研究發(fā)現(xiàn)LAPTM4B與inactive EGFR核內(nèi)體上的相互作用，并招募ATG5，從而促進(jìn)EGFR與自噬抑制劑Rubicon的結(jié)合，進(jìn)而使腫瘤促進(jìn)因子Beclin 1從Rubicon-Beclin 1復(fù)合物中分離觸發(fā)自噬。LAPTM4B還可通過(guò)直接激活自噬相關(guān)基因ATG3轉(zhuǎn)錄調(diào)控自噬[23]。Miao等[28]證實(shí)LAPTM4B的表達(dá)與EGFR的激活呈正相關(guān)；Beclin 1通過(guò)LAPTM4B的N末端和C末端的結(jié)構(gòu)域與LAPTM4B相互作用，并與EGFR競(jìng)爭(zhēng)與LAPTM4B的結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)胃癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的耐藥。這一系列機(jī)制均導(dǎo)致自噬增強(qiáng)，并發(fā)揮保護(hù)腫瘤的作用，導(dǎo)致EGFR-TKIs的耐藥。在NSCLC中LAPTM4B表達(dá)顯著增加時(shí)，可能與LAPTM4B觸發(fā)自噬活性，自噬發(fā)揮腫瘤保護(hù)機(jī)制產(chǎn)生EGFR-TKIs的耐藥，并引起EGFR-TKIs繼發(fā)耐藥基因T790M突變。

綜上所述，LAPTM4B可能通過(guò)自噬途徑參與EGFR-TKIs的耐藥；還可通過(guò)增加藥物外排、減少藥物核定位和藥物誘導(dǎo)的DNA損傷，參與EGFR-TKIs的耐藥[24]。因此，作者認(rèn)為靶向LAPTM4B可能有助于增強(qiáng)EGFR-TKIs的治療效果。LAPTM4B可能是抑制腫瘤生長(zhǎng)或使腫瘤對(duì)化療敏感的新的重要治療靶點(diǎn)。