代玉立,蘭成忠,甘 林,劉曉菲,龔國(guó)淑,楊秀娟*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建省作物有害生物綠色防控工程研究中心,福州 350013;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,成都 611130)

獼猴桃ActinidiachinensisPlanch.是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)水果,其種植面積和產(chǎn)量均位于世界前列[1]。由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種Pseudomonassyringaepv.actinidiae(Psa)引起的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病(kiwifruit bacterial canker)是全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)最具毀滅性的病害,該病害暴發(fā)速度快、毀滅性極強(qiáng)且難以防治[1-4]。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病最早發(fā)生于日本[5],此后在韓國(guó)[6]、意大利[7]、新西蘭[8]、西班牙[9]和法國(guó)[10]等獼猴桃生產(chǎn)國(guó)流行暴發(fā),給獼猴桃安全生產(chǎn)造成了極大的威脅。我國(guó)于1985年首次在湖南省發(fā)現(xiàn)此病[11],1989年該病害在四川省造成獼猴桃植株大面積死亡[12],1991年該病害在安徽省岳西縣暴發(fā),果園株發(fā)病率達(dá)32%,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[13],2018年獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病又在福建省福安市暴發(fā),果園株發(fā)病率達(dá)70%以上,造成超過(guò)15 hm2果園被毀[14]。隨著我國(guó)獼猴桃栽培的產(chǎn)業(yè)化和種植面積的規(guī)?；?細(xì)菌性潰瘍病帶來(lái)的威脅日益嚴(yán)峻。

明確病原菌的生物型(biovar)和群體遺傳關(guān)系,有助于揭示該病原菌的適生性、起源和流行趨勢(shì)[15-16]。近年來(lái),國(guó)外研究者通過(guò)DNA指紋圖譜和基因序列分析將獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌分成6個(gè)不同的生物型,分別命名為biovar 1[17]、biovar 2[17]、biovar 3[18]、biovar 4[18-19]、biovar 5[20]和biovar 6[21]。biovar 1主要在日本以及意大利2008年以前的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體中發(fā)現(xiàn),能產(chǎn)生菜豆毒素(phaseolotoxin);biovar 2僅在韓國(guó)流行危害,能產(chǎn)生冠菌素(coronatine),但是不產(chǎn)生菜豆毒素;biovar 3是分布最廣、危害最嚴(yán)重的世界性流行群體,既不產(chǎn)生菜豆毒素,也不產(chǎn)生冠菌素;biovar 4最早發(fā)現(xiàn)于新西蘭和澳大利亞,為弱致病力群體,僅在葉片上引起少許壞死斑,不引起潰瘍和幼芽枯死;biovar 5和biovar 6是近期發(fā)現(xiàn)的新類(lèi)型,目前僅分布于日本局部地區(qū)[1,18-19]。biovar 3因其流行范圍廣、適生性強(qiáng)和極具破壞性而引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究興趣[1,3,15,22]。目前,我國(guó)研究者對(duì)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的研究主要在病原物的分子檢測(cè)與鑒定、病害流行規(guī)律及防控等方面[23],而有關(guān)我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的生物型檢測(cè)研究相對(duì)較少。隨著植物病原菌基因組測(cè)序和核苷酸組成結(jié)構(gòu)研究的深入,分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物病原菌遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究中,如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、微衛(wèi)星分子標(biāo)記(microsatellite)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、短重復(fù)序列標(biāo)記(rep-PCR)等[1,23-24]。多基因聯(lián)合分析技術(shù)可從DNA分子組成上對(duì)單個(gè)堿基差異進(jìn)行檢測(cè),揭示種群內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳多樣性,被廣泛應(yīng)用于植物病原細(xì)菌群體分型和分子進(jìn)化關(guān)系研究中。研究表明,植物病害暴發(fā)成災(zāi)與病原菌群體演替和遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)改變關(guān)系密切[23]。因此,了解病原菌群體在分子水平上的遺傳多樣性,不僅可以揭示病害暴發(fā)成災(zāi)的內(nèi)在機(jī)制,還可為病害的長(zhǎng)期可持續(xù)控制提供理論指導(dǎo)。

前期基于部分省份的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳多樣性研究表明,獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌存在豐富的DNA多態(tài)性,且其DNA多態(tài)性與地理來(lái)源和寄主品種無(wú)明顯相關(guān)性,造成這種遺傳差異的原因以及我國(guó)不同地理來(lái)源的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌種群間的遺傳關(guān)系未見(jiàn)深入研究。因此,筆者擬采用檢測(cè)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌生物型的特異性引物,測(cè)定福建、安徽、四川和陜西4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體的生物型。采用多基因聯(lián)合分析4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的遺傳多樣性,以期確定福建省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的來(lái)源,為阻斷獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌在福建省的傳播提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的安徽省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院張立新教授惠贈(zèng);四川省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院龔國(guó)淑教授惠贈(zèng);福建和陜西省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病理研究室分離保存。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株的編號(hào)、菌株數(shù)、采集年份和來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試的4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌信息Table 1 Information of tested strains of Pseudomonas syringae pv.actinidiae from four provinces

1.2 供試菌株基因組DNA提取

將用30%甘油保存在-80℃超低溫冰箱中的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株于28℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。取1 mL菌懸液接種到100 mL液體LB培養(yǎng)基中,28℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)活化24 h后,取1 mL菌懸液接種到100 mL LB培養(yǎng)基中,相同條件下振蕩培養(yǎng)24～48 h。取2 mL菌懸液于2 mL無(wú)菌離心管中,10 000 r/min離心2 min,棄上清,收集細(xì)胞。獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的基因組DNA提取采用ONE-4-ALL基因組DNA小量提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司],操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA樣品用50 μL TE緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)溶解,核酸定量?jī)x測(cè)定各菌株DNA濃度并用TE緩沖液調(diào)節(jié)至100 ng/μL,DNA樣品保存于-20℃冰箱。

1.3 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的生物型檢測(cè)

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌biovar 1、biovar 2、biovar 3、biovar 5和biovar 6等5種生物型檢測(cè)采用Lee等[25]、Koh等[26]以及Fujikawa等[20]設(shè)計(jì)的生物型檢測(cè)特異引物(表2)。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。由于biovar 4未被學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)可,故本文未作首選檢測(cè),若排除前5種生物型,則考慮檢測(cè)biovar 4。

生物型檢測(cè)PCR擴(kuò)增體系(25 μL):2×PremixTaqMasterMix 12.5 μL(大連寶生物有限公司),引物各10 pmol,DNA模板100 ng,補(bǔ)足ddH2O至25 μL;PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，最適退火溫度(表2)退火45 s，72℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增在C1000TM型熱循環(huán)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)中進(jìn)行。PCR結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于120 V恒定電壓下用含EB的1.2%瓊脂糖凝膠電泳20 min,BioDoc-ItTM型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)檢測(cè)并拍照。

表2 供試引物信息1)Table 2 Information of tested primers

1.4 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體的遺傳多樣性分析

1.4.1基因序列特征和單倍型

本研究采用16S rRNA、ITS、gapA和rpoD等4個(gè)基因用于獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌遺傳多樣性分析。引物詳細(xì)信息見(jiàn)表2。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR擴(kuò)增體系:2×PremixTaqMasterMix 12.5 μL(大連寶生物有限公司),引物10 pmol,DNA模板100 ng,補(bǔ)足ddH2O至25 μL;PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,最適退火溫度(表2)退火45 s,72℃延伸45 s(16S rRNA延伸90 s),35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后取25 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于120 V恒定電壓下用含EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳25 min,BioDoc-ItTM型凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。紫外燈下用無(wú)菌手術(shù)刀切取含目的條帶的瓊脂糖凝膠,采用凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收。目的基因由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

測(cè)序產(chǎn)物利用DNAMAN軟件分別進(jìn)行單基因多重比對(duì),ClustalX軟件[32]進(jìn)行對(duì)齊,再利用DnaSP 6軟件[33]將4個(gè)單基因序列串聯(lián),分析串聯(lián)序列整體特征:G+C含量、總突變位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(number of polymorphic sites;Ns)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity;Pi)、平均核苷酸差異數(shù)(average number of nucleotide differences;K)、單倍型(haplotypes)以及單倍型多樣性(haplotype diversity;Hd)。

1.4.2獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳多樣性

采用DnaSP 6軟件分析中國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌不同地理來(lái)源群體間的單倍型數(shù)、單倍型多樣性、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、核苷酸多樣性以及平均核苷酸差異數(shù)等遺傳多樣性參數(shù),比較不同群體間的遺傳多樣性,采用Tajima’sD和Fu’sF對(duì)4個(gè)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體進(jìn)行中性檢驗(yàn)。

1.4.3獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳分化

將多基因串聯(lián)序列輸入DnaSP 6軟件分析中國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌不同地理來(lái)源群體間的遺傳分化系數(shù)Fst和基因流Nm[Nm=0.25(1-Fst)/Fst],當(dāng)Fst≤0.05:遺傳分化水平極低,0.050.25:遺傳分化水平極高[24];利用GenAlEx 6.5軟件[34]中分子方差分析(analysis of molecular variance;AMOVA)方法檢驗(yàn)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌不同地理來(lái)源群體內(nèi)和群體間的差異顯著性。

1.4.4獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳距離和聚類(lèi)分析

楊梅(Myrica rubra Sieb. et Zucc)原產(chǎn)于我國(guó)南方，主要分布在浙江、江蘇、江西、福建等省，其中以浙江省所產(chǎn)楊梅品質(zhì)最佳。楊梅果實(shí)色澤艷麗、酸甜多汁、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的歡迎。楊梅果實(shí)除含有多種人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如糖類(lèi)、維生素和礦質(zhì)元素)之外，還含有大量的花色苷和多酚類(lèi)物質(zhì)，因此具有較好的自由基清除能力。此外楊梅還具有生津消渴、解酒解暑、行氣止痛等保健功效，被人們贊譽(yù)為“初夏江南珍果”。

利用MEGA 7軟件[35]分析獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌不同菌株和不同地理來(lái)源群體間的遺傳距離,利用遺傳距離數(shù)據(jù)和GenAlEx 6.5軟件中主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)分析獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌不同地理來(lái)源群體內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳差異。利用遺傳距離數(shù)據(jù)和MEGA 7軟件采用鄰近法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的生物型

通過(guò)biovar 1、biovar 2、biovar 3、biovar 5和biovar 6共5對(duì)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌生物型檢測(cè)特異性引物對(duì)我國(guó)4個(gè)地理種群的47株菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,僅biovar 3特異性引物可以擴(kuò)增出一條545 bp的特異性條帶(圖1),表明供試菌株的生物型均為biovar 3。

圖1 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的生物型檢測(cè)Fig.1 Detection of Pseudomonas syringae pv.actinidiae biovars from four provinces in China

2.2 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳多樣性分析

2.2.1基因序列特征和單倍型

通過(guò)對(duì)我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因序列進(jìn)行聯(lián)合,獲得一條全長(zhǎng)2 743 bp的同源序列。聯(lián)合基因G+C含量為57.3%,總突變位點(diǎn)數(shù)為95,多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為87,核苷酸多態(tài)性為0.002 21,平均核苷酸差異數(shù)為5.880。

通過(guò)對(duì)我國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因進(jìn)行聯(lián)合分析,從47個(gè)菌株中共檢測(cè)出27個(gè)單倍型(Hap01～Hap27),單倍型多樣性為0.955。Hap01為安徽省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體特有單倍型;Hap02、Hap10、Hap11、Hap13和Hap16為群體共有的單倍型,其中Hap02共享范圍最廣,為福建、四川和陜西群體共有;Hap03、Hap04、Hap05、Hap06、Hap07、Hap08和Hap09為福建省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體特有單倍型;Hap12、Hap14、Hap15、Hap17、Hap18、Hap19和Hap20為四川省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體特有單倍型;Hap21、Hap22、Hap23、Hap24、Hap25、Hap26和Hap27為陜西省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體特有單倍型(表3)。

表3 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的單倍型分布Table 3 Haplotype distributions of Pseudomonas syringae pv.actinidiae populations from four provinces in China

2.2.2獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳多樣性

來(lái)自我國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體的單倍型數(shù)(Nh)差異較大,安徽省群體僅有1個(gè)單倍型,而四川和陜西群體單倍型數(shù)達(dá)12個(gè);單倍型多樣性(Hd)介于0～0.971之間。4個(gè)群體間的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(NS)差異極顯著(P<0.01),其中安徽群體的NS最低,福建群體的NS最豐富;4個(gè)群體的核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)范圍分別為0～0.005 69和0～15.356,也是安徽和福建群體分別為最低和最高;除安徽群體外,其他3個(gè)群體的Tajima’sD和Fu’sF均小于0,表明3個(gè)群體中稀有等位基因以高頻率存在,是非平衡選擇的結(jié)果(表4)。

2.2.3獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳分化

AMOVA分析表明,3.6%的遺傳變異來(lái)源于群體間,而96.4%的遺傳變異來(lái)源于群體內(nèi),說(shuō)明種群內(nèi)變異是遺傳變異的主要來(lái)源(表5)。遺傳分化指數(shù)(Fst)和基因流(Nm)分析結(jié)果表明,安徽省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體與福建、四川和陜西群體間存在中等到極高的遺傳分化,Fst值介于0.175～0.428之間(Fst>0.15),Nm值較小(0.334～1.179),說(shuō)明群體間缺乏基因交流。福建、四川和陜西兩兩群體間的遺傳分化水平均較低,Fst值介于-0.015～0.017之間,Nm值較大(>14),說(shuō)明群體間基因交流頻繁(表6)。AMOVA分析也表明,群體間的遺傳分化水平極低(Fst=0.036,P<0.05)(表5)。

表4 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體的遺傳多樣性1)Table 4 Genetic diversity of Pseudomonas syringae pv.actinidiae populations from four provinces in China

表5 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌種群內(nèi)和種群間的分子變異分析Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) of genetic variation within and among four populations of Pseudomonas syringae pv.actinidiae in China

表6 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體間的遺傳分化和基因流1)Table 6 Pairwise matrix of genetic differentiation and gene flow among Pseudomonas syringae pv.actinidiae populations from four provinces in China

2.2.4獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體遺傳距離和聚類(lèi)分析

利用獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌16S rRNA、ITS、gapA和rpoD的聯(lián)合基因序列,采用MEGA7軟件計(jì)算4個(gè)群體間的遺傳距離,結(jié)果表明:安徽、福建、四川和陜西4個(gè)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體間的遺傳距離為0.001 45～0.004 64,其中安徽與陜西群體間的遺傳距離最近,而福建與安徽、四川和陜西群體間的遺傳距離均較遠(yuǎn)(表7)。PCoA分析結(jié)果表明,第一和第二主坐標(biāo)分別占總變異的67.16%和28.40%,4個(gè)不同地理來(lái)源的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌個(gè)體之間沒(méi)有明顯的分離(圖2)。基于不同個(gè)體間遺傳距離的聚類(lèi)分析結(jié)果表明,除安徽群體外,不同地理來(lái)源的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌個(gè)體隨機(jī)聚于各個(gè)分支中,說(shuō)明3個(gè)地理來(lái)源的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的親緣關(guān)系較近(圖3)。

表7 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體間的遺傳距離Table 7 Genetic distance between different populations of Pseudomonas syringae pv.actinidiae from four provinces in China

圖2 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體的PCoA分析Fig.2 Principal co-ordinates analysis (PCoA) of Pseudomonas syringae pv.actinidiae populations from four provinces in China

3 討論

Vanneste等[18]根據(jù)致病性、表型和基因組特征,將來(lái)自日本和意大利(1992年)的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體的生物型定義為biovar 1,來(lái)自韓國(guó)的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體定義為biovar 2,來(lái)源于中國(guó)的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體定義為biovar 3。Cunty等[36]通過(guò)可變數(shù)目重復(fù)序列分析(multilocus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)發(fā)現(xiàn),來(lái)自中國(guó)5省的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株和來(lái)自法國(guó)、意大利以及新西蘭的菌株聚于同一分支,盡管這些菌株的來(lái)源地不同,但它們都是同一生物型biovar 3。本研究通過(guò)生物型特異性引物檢測(cè)發(fā)現(xiàn),供試的4省47株獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株的生物型均為biovar 3,未發(fā)現(xiàn)其他生物型,研究結(jié)果與前人報(bào)道一致。鑒于當(dāng)前在我國(guó)未發(fā)現(xiàn)其他獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌生物型,因此,應(yīng)加強(qiáng)檢疫措施,防止外來(lái)生物型菌株的入侵,保障我國(guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

對(duì)分離自安徽、福建、四川和陜西4省的47株獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因序列進(jìn)行聯(lián)合分析,共獲得2 743 bp的有效同源序列,聯(lián)合基因中G+C含量為57.3%,與任雪燕等[23]基于我國(guó)7省的21個(gè)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌菌株全基因組測(cè)序獲得的G+C含量相當(dāng),略低于丁香假單胞菌丁香致病變種P.syringaepv.syringae的全基因組G+C含量[37]。來(lái)自4省47株獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體共檢測(cè)到27個(gè)單倍型,其中安徽群體的單倍型數(shù)最少,僅有1種單倍型;福建、四川和陜西群體的單倍型數(shù)相當(dāng),分別為8、12個(gè)和12個(gè),單倍型多樣性指數(shù)分別為0.956、0.971和0.963。Sawada等[38]通過(guò)致病性相關(guān)基因分析表明,來(lái)自全球范圍的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌不同生物型間存在顯著的遺傳多樣性,且這種多樣性與致病力、基因型和地理來(lái)源有關(guān)。Ferrante等[39]通過(guò)rep-PCR指紋圖譜研究全球早期和現(xiàn)階段獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌流行群體的遺傳結(jié)構(gòu)表明,全球獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌存在豐富的遺傳多樣性。He等[40]通過(guò)rep-PCR、RAPD和IS50-PCR等3種分子標(biāo)記技術(shù),發(fā)現(xiàn)我國(guó)5個(gè)地理種群的biovar 3型獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌存在豐富的遺傳多樣性。任雪燕等[23]通過(guò)全基因組測(cè)序研究我國(guó)7省21株獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的遺傳多樣性,表明不同地理群體間的核苷酸多態(tài)性差異不明顯。本研究結(jié)果表明,來(lái)自我國(guó)4省的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌存在較豐富的遺傳多樣性,基于16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因序列的總突變位點(diǎn)數(shù)為95,多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為87,核苷酸多態(tài)性為0.002 21,平均核苷酸差異數(shù)為5.880。來(lái)自福建群體的遺傳多樣性最豐富,其次為四川群體,安徽群體的遺傳多樣性最差,4個(gè)群體間的核苷酸多態(tài)性存在極顯著差異(P<0.01)。本研究結(jié)果與Sawada等[38],Ferrante等[39]以及He等[40]研究結(jié)果一致,而與任雪燕等[23]研究結(jié)果不吻合,原因可能是分析方法和角度不同造成的[23]。

圖3 中國(guó)4省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的聚類(lèi)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pv.actinidiae from four provinces in China

遺傳分化指數(shù)和基因流是衡量遺傳分化水平的2個(gè)重要指標(biāo),遺傳分化指數(shù)越大,基因流越小,說(shuō)明群體間基因交流越匱乏,遺傳分化水平高[23,41]。安徽群體與福建、四川和陜西群體病原菌之間的基因流均較小,遺傳分化十分明顯(Fst介于0.175～0.428之間),究其原因可能是安徽省是我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌原始發(fā)現(xiàn)地之一,與其他3個(gè)群體來(lái)源不同[13]。福建群體病原菌與四川和陜西2個(gè)群體病原菌的基因交流十分頻繁(Nm>14),從而導(dǎo)致了極低水平的遺傳分化(Fst介于-0.015～0.017之間),主要原因可能是福建省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌是外來(lái)入侵種。近年來(lái)福建省種植的獼猴桃品種大多為‘紅陽(yáng)’品種,而‘紅陽(yáng)’獼猴桃是由四川省蒼溪縣繁育而成[42],此外,陜西和四川省還是我國(guó)重要的獼猴桃苗木培育基地,隨著獼猴桃苗木輸送到全國(guó)各地,造成病原菌隨苗木傳播[23]。因此,應(yīng)強(qiáng)化獼猴桃苗木繁育基地的檢疫措施,阻斷病原菌隨苗木調(diào)運(yùn)的傳播。

PCoA分析和聚類(lèi)分析表明,除安徽病原菌群體外,來(lái)自福建、四川和陜西省的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌較為分散,沒(méi)有表現(xiàn)出較強(qiáng)的地理來(lái)源相關(guān)性。但是,本研究結(jié)果不能得出我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的遺傳多樣性與地理來(lái)源無(wú)關(guān)的結(jié)論,主要原因在于福建省的菌源為外來(lái)菌株,可能隨苗木的調(diào)運(yùn)從四川和陜西省傳入福建。安徽群體表現(xiàn)出較強(qiáng)的地理相關(guān)性,但是由于樣本數(shù)量有限,說(shuō)服力不強(qiáng)。由于我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的來(lái)源地較多(如湖南、安徽和四川等)[11-13],因此,作者推測(cè)我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的遺傳多樣性可能與該菌的地理來(lái)源關(guān)系較為密切。有關(guān)我國(guó)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的遺傳多樣性與地理來(lái)源關(guān)系密切的推論是否成立,仍需進(jìn)一步擴(kuò)大采樣的時(shí)間和空間范圍,作進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié)論

利用獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌生物型PCR檢測(cè)特異性引物,明確了來(lái)自安徽、福建、四川和陜西4省的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的生物型均為biovar 3。采用獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因聯(lián)合分析方法,從DNA分子水平上揭示了安徽、福建、四川和陜西4省的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌群體間存在遺傳多樣性,且不同病原菌群體的遺傳多樣性差異不同。研究結(jié)果為明確福建省獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌的來(lái)源、阻斷其在福建省的傳播以及該病害的長(zhǎng)期可持續(xù)控制提供了理論參考。