王凌琪,董婷婷,陳 雯,甘海鋒,徐小偉,秦 朗,李良俊,賀 振

(揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,揚(yáng)州 225009)

蓮藕NelumbonuciferaGaertn.是蓮科蓮屬多年生水生草本植物,原產(chǎn)中國、印度,是我國栽培面積最大的特色水生蔬菜[1]。近年來,江蘇省蓮藕主產(chǎn)區(qū)普遍出現(xiàn)一種“僵藕”現(xiàn)象,藕身瘦小,質(zhì)地僵硬,表面布有棕褐色斑點(diǎn)、條斑,且深入表皮以下,嚴(yán)重影響蓮藕的產(chǎn)量和品質(zhì)。李良俊等在江蘇地區(qū)“僵藕”葉片的葉肉組織發(fā)現(xiàn)有風(fēng)輪狀內(nèi)含體,且在葉片的粗提取物中發(fā)現(xiàn)線條狀病毒粒子,因此,認(rèn)為“僵藕”可能是由植物病毒引起的[2]。目前,關(guān)于蓮藕上的病毒的報(bào)道較少,主要包括黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)[3]、芋花葉病毒(dasheen mosaic virus,DsMV)[4]、甘薯潛隱病毒(sweet potato latent virus,SPLV)[5]和蘋果莖溝病毒(apple stem groove virus,ASGV)[6]。

甘薯潛隱病毒是馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus的正義單鏈RNA病毒。SPLV全基因組大約為10 kb,包含5′端和3′端的非編碼區(qū)(non-translated region,NTR)及1個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)。基因組5′端是VPg,3′端有一個(gè)Poly(A)尾。ORF編碼一個(gè)大的多聚蛋白(polyprotein),可分割成10個(gè)成熟的蛋白產(chǎn)物,從N端到C端依次為第一蛋白(protein 1,P1)、HC-Pro、第3蛋白(protein 3,P3)、第1個(gè)6K蛋白(the first protein of 6 kD,6K1)、圓柱狀內(nèi)含體蛋白(cytoplasmic inclusion protein,CI)、第2個(gè)6K蛋白(the second protein of 6 kD,6K2)、病毒基因組連接蛋白(viral genome-linked protein,VPg)、核內(nèi)含體蛋白a(nuclear inclusion body ‘a(chǎn)’ protein,NIa)、核內(nèi)含體蛋白b(nuclear inclusion body ‘b’ protein,NIb)以及外殼蛋白(coat protein,CP)[7],其中P1、HC-Pro及NIa具有蛋白酶活性。此外,在P3蛋白中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)小分子蛋白pretty interesting potyvirus ORF(PIPO)[8]。1979年在我國臺(tái)灣的甘薯上首次發(fā)現(xiàn)SPLV[9],該病毒的介體昆蟲為蚜蟲,并且可隨薯苗營養(yǎng)繁殖體及薯塊進(jìn)行傳播[10]。

本實(shí)驗(yàn)室前期在蓮藕中發(fā)現(xiàn)一種甘薯潛隱病毒分離物(sweet potato latent virus-lotus,SPLV-lotus)[11]。該分離物與SPLV甘薯分離物的序列差異很大,核苷酸相似性在76.28%～76.60%,處于國際病毒分類委員會(huì)(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)制定的馬鈴薯Y病毒科病毒分種標(biāo)準(zhǔn)線附近(核苷酸相似性低于76%)。該分離物與SPLV甘薯分離物有4個(gè)蛋白酶水解切割識(shí)別位點(diǎn)存在差異,其編碼PIPO的長度差異較大[5]。SPLV-lotus自然條件下能夠侵染蓮藕,并且通過接種后發(fā)現(xiàn)其能有效侵染豆科、藜科、葫蘆科、茄科植物,但未見明顯癥狀表現(xiàn)[11]。本研究克隆了SPLV-lotusHC-Pro基因,通過原核表達(dá),將純化后的HC-Pro重組蛋白作為抗原制備抗血清,以期為SPLV-lotus的檢測和有效防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶SPLV的蓮藕以及pGEX4T-1載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。普通TaqDNA聚合酶、I-5TM2×High-Fidelity Master Mix購自擎科生物技術(shù)有限公司;T4 DNA連接酶、Premixed Protein Marker、反轉(zhuǎn)錄酶以及限制性內(nèi)切酶、考馬斯亮藍(lán)R250購自TaKaRa公司;快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購自BioTeke公司。大腸桿菌 Rosetta(DE3)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。引物合成和測序由擎科生物技術(shù)有限公司完成。GST標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)購自南京金斯瑞生物科技有限公司。超濾離心管Ultra-15(Millipore,美國)、谷胱甘肽、DTT、蛋白胨、酵母提取物、甲醇、氨芐青霉素(Amp)、SDS、Tris、LiCl購自生工生物工程(上海)股份有限公司;anti-CPPVX兔抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備。NBT(Nitro blue tetrazolium)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)、彩虹180廣譜蛋白marker、IPTG、PMSF、甘油、N′,N′-二甲基甲酰、溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇購自北京索萊寶科技有限公司;PVDF膜購自GE Healthcare。ELISA試劑盒購自上海橋杜生物科技有限公司。

1.2 SPLV-lotus HC-Pro基因的RT-PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)甘薯潛隱病毒蓮藕分離物全基因組序列合成一對引物:上游引物SPLV-lotus-F(5′-CCGGAATTCGCAGACACAGCCCAAAAGTT-3′,下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))和下游引物SPLV-lotus-R(5′-TTGCGGCCGCGACCCACAACATAGAATTTCAT-3′,下劃線部分為NotI酶切位點(diǎn))。采用LiCl法提取蓮藕總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,以cDNA為模板,PCR擴(kuò)增SPLV-lotusHC-Pro基因。50 μL PCR反應(yīng)體系:10 μmol/L上下游引物各2 μL、cDNA 4 μL、RNase Free Water 17 μL、I-5TM2×High-Fidelity Master Mix 25 μL。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性2 min;98℃變性10 s,65℃退火15 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后,利用凝膠回收試劑盒回收純化目的片段,用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切,與同樣用EcoRI和NotI雙酶切的原核表達(dá)載體pGEX4T-1在16℃金屬浴中過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)。經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆后,隨機(jī)選取5個(gè)克隆由擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序,所得序列利用Blastn、BioEdit和DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對和分析,從中選擇測序結(jié)果正確的克隆,提取重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.3 SPLV-lotus HC-Pro的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化

將轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)的陽性單菌落在LB平板上活化,之后接種到含100 mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的菌液以1∶100的比例加入500 mL LB (含100 mg/mL Amp)中,37℃,200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8,加入誘導(dǎo)劑IPTG,使其終濃度為1 mmol/L,18℃,180 r/min 條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)17 h后,在4℃條件下,9 000 r/min離心20 min。收集菌體,用蛋白緩沖液懸浮。加入終濃度為1 mmol/L PMSF,冰浴超聲波破碎后,12 000 r/min 離心1 h。利用GST標(biāo)簽蛋白純化介質(zhì)進(jìn)行蛋白純化。SDS-PAGE電泳檢測純化蛋白。

1.4 抗血清的制備、效價(jià)檢測及Western blot分析

利用純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔并獲得多克隆抗血清PAb-HC-ProSPLV-lotus,通過間接ELISA測定抗血清效價(jià)。將檢測到SPLV-lotus的蓮藕陽性樣品液氮冷凍后用研磨儀磨碎,每0.1 g樣品加蛋白提取緩沖液500 μL,振蕩混勻后靜置10 min,再12 000 r/min 離心10 min。取100 μL上清液加入樣品孔中,加蓋在37℃恒溫黑暗條件下反應(yīng)4 h。將酶聯(lián)板上的抗原溶液倒盡,加入PBST洗滌4次,300 μL/孔,30 s/次。加入封閉液(PBST+5% 脫脂奶粉)100 μL,37℃恒溫黑暗條件下反應(yīng)2 h。加入PBST稀釋 (1∶2 000)蛋白抗血清,稀釋至250、1 000、4 000、16 000、64 000、256 000倍,100 μL/孔,37℃溫育2 h。PBST洗滌4次,每次30 s。加入用PBST稀釋 (1∶5 000) 的AP酶標(biāo)二抗100 μL,37℃孵育60 min。再用PBST洗滌4次,每次30 s。每孔加堿性磷酸酯酶底物顯色溶液90 μL(二抗量的90%),37℃恒溫黑暗條件下反應(yīng)15 min到1 h。最后,每孔加50 μL 2 mol/L NaOH,而后用酶標(biāo)儀測定OD405,保存數(shù)據(jù),進(jìn)行分析。

同時(shí),通過Western blot檢測抗血清特異性,具體試驗(yàn)方法如下。用液氮將檢測到SPLV-lotus的蓮藕陽性樣品冷凍后研磨成粉末,加入100 μL 1×SDS上樣緩沖液,渦旋振蕩;將制備好的樣品置于沸水中加熱10 min后,12 000 r/min離心10 min;取10 μL上清液進(jìn)行SDS PAGE電泳。電泳結(jié)束后,在1×轉(zhuǎn)膜緩沖液中以200 mA,90 min的電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;隨即轉(zhuǎn)入10 mL封閉液(TBST緩沖液+5%脫脂奶粉)中,37℃恒溫條件下反應(yīng)1 h,封閉結(jié)束后在1×TBST緩沖液中洗滌PVDF膜3次,每次10 min。洗滌結(jié)束后將PVDF膜置于含2 μL抗血清的10 mL 1×TBST中,37℃恒溫條件下反應(yīng)1 h;反應(yīng)結(jié)束后用1×TBST緩沖液洗脫3次,每次10 min。隨后將PVDF膜置于含2 μL的AP酶標(biāo)二抗的10 mL 1×TBST中,37℃反應(yīng)45 min;二抗結(jié)束后用1×TBST緩沖液洗脫3次,每次10 min。洗脫結(jié)束后將膜放至含有330 μg/mL NBT和165 μg/mL BCIP的堿性磷酸酯酶緩沖液中避光顯色至條帶清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPLV-lotus HC-Pro基因RT-PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)載體構(gòu)建

以攜帶SPLV的蓮藕樣品反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,利用特異性引物SPLV-lotus-F/SPLV-lotus-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,獲得大小約為1 375 bp的目的片段(圖1)。對構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證(圖2),并對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測序,結(jié)果顯示與目的序列一致,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 SPLV-lotus HC-Pro基因RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of SPLV-lotus HC-Pro gene

2.2 SPLV-lotus HC-Pro基因原核表達(dá)及蛋白純化

使用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組靶標(biāo)蛋白的表達(dá),對誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus在74 kD附近出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的融合蛋白條帶(圖3,泳道2),未誘導(dǎo)對照(圖3,泳道3)在該位置沒有過量表達(dá)蛋白,表明pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus在大腸桿菌中正確表達(dá)。

對18℃誘導(dǎo)17 h后的表達(dá)菌液進(jìn)行超聲波破碎,破碎后將其與GST蛋白純化介質(zhì)融合混合3 h,隨后使用谷胱甘肽洗脫液進(jìn)行洗脫測試(圖4a)。最后,使用超濾離心管Ultra-15(30 kD)對洗脫的蛋白進(jìn)行濃縮。本試驗(yàn)以0.5 mg/mL BSA作為對照,對純化重組HC-ProSPLV-lotus蛋白進(jìn)行定量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HC-ProSPLV-lotus蛋白濃度與0.5 mg/mL BSA相比,都在74 kD大小的位置出現(xiàn)條帶,證明蛋白純化合格(圖4b)。結(jié)果表明,本試驗(yàn)的蛋白質(zhì)純化方法正確,并且HC-ProSPLV-lotus蛋白的濃度滿足多克隆抗血清制備條件的要求,可用于免疫新西蘭大白兔。

圖2 酶切鑒定pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus重組質(zhì)粒Fig.2 Identification of pGEX4T-1-HC-ProSPLV-lotus recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

圖4 HC-ProSPLV-lotus蛋白純化和定量Fig.4 Purification and quantification of the HC-ProSPLV-lotus protein

2.3 抗血清效價(jià)檢測及Western blot分析

將純化的重組蛋白HC-ProSPLV-lotus作為抗原,免疫新西蘭大白兔。將制備好的多克隆抗血清(PAb-HC-ProSPLV-lotus)用于ELISA效價(jià)測定。當(dāng)PAb-HC-ProSPLV-lotus稀釋比為1∶256 000時(shí),ELISA顯色后OD450讀數(shù)仍高于0.6(圖5a),表明所制備的PAb-HC-ProSPLV-lotus效價(jià)合格,可用于后續(xù)血清學(xué)檢測。為驗(yàn)證PAb-HC-ProSPLV-lotus的特異性,利用純化后的HC-ProSPLV-lotus蛋白作為抗原,進(jìn)行Western blot分析驗(yàn)證,檢測結(jié)果顯示目的蛋白帶符合預(yù)期大小(圖5b),說明制備的PAb-HC-ProSPLV-lotus能用于HC-ProSPLV-lotus的特異性檢測。

圖5 評估制備的PAb-HC-ProSPLV-lotus抗體的效價(jià)Fig.5 Evaluation of the titer of prepared PAb-HC-ProSPLV-lotus

2.4 田間蓮藕樣品的檢測

為了測試制備的PAb-HC-ProSPLV-lotus能否用于對田間樣品的檢測,從江蘇省揚(yáng)州市采集了8個(gè)新鮮蓮藕樣品,提取其總蛋白及RNA,使用Western blot和RT-PCR檢測。由于HC-Pro蛋白大小 48 kD 左右,加上GST標(biāo)簽(26 kD)融合表達(dá)大概在74 kD左右,所以蓮藕樣品目的條帶蛋白大小比HC-ProSPLV-lotus純化蛋白要小,Western blot結(jié)果顯示在特定大小位置出現(xiàn)特異性預(yù)期條帶,RT-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致(圖6～7),這表明制備的抗血清能有效的檢測到田間樣品中的SPLV-lotus。

圖6 田間蓮藕樣品RT-PCR檢測結(jié)果Fig.6 RT-PCR detection of the lotus samples from the field

圖7 田間蓮藕樣品Western blot檢測結(jié)果Fig.7 Western blot detection of the lotus samples from the field

3 結(jié)論與討論

植物病毒檢測是研究病毒以及培育脫毒種苗等不可缺少的技術(shù)手段,因此建立一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的檢測方法極其重要。其中,血清學(xué)方法具有靈敏度高、快速且適合大量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn),在植物病毒檢測中不可缺少。自1928年Beale首次將血清學(xué)技術(shù)應(yīng)用于植物病毒的研究,該技術(shù)已逐步發(fā)展成為診斷和鑒定病毒的基礎(chǔ)方法,并在植物病毒的檢疫及測報(bào)、植物病毒的定位、增殖、移動(dòng)、基因功能以及介體和寄主的互作機(jī)理等方面的研究中發(fā)揮著重要作用[13]。

Nikolaeva通過克隆柑橘速衰病毒(citrus tristeza virus,CTV)外殼蛋白基因到表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在該細(xì)菌中得到表達(dá),再通過分離病毒外殼蛋白,制備多克隆抗體,最終將其應(yīng)用于衰退病的檢測[14]。生產(chǎn)上一般利用純化的病毒粒子作為抗原制備抗血清,由于受到提純條件和純化技術(shù)的限制,該方法制備的抗體容易導(dǎo)致假陽性反應(yīng),或者因植株含有大量多糖多酚類物質(zhì)而很難提純[15-17]。通過大腸桿菌表達(dá)病毒蛋白作為抗原制備抗體,不僅能克服上述缺點(diǎn),而且大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相較于酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等具有產(chǎn)量高、細(xì)胞生長速度快及易于操作等優(yōu)點(diǎn),是未來大量而快速制備抗血清發(fā)展的主要方向[18]。

HC-Pro是一種多功能蛋白,它控制植物的蚜傳特性、參與病毒的侵染與復(fù)制、病毒編碼多聚蛋白的加工剪切、病毒的細(xì)胞間和長距離移動(dòng)以及病毒間的協(xié)生作用等,在病毒的生活史中起重要作用[12]。郭明等構(gòu)建了PVY-C HC-Pro基因的原核表達(dá)載體,并制備了HC-Pro的抗血清[19]。郝興安于2006年首次對甘蔗花葉病毒的HC-Pro進(jìn)行了原核表達(dá)[20]。

近年來,甘薯潛隱病毒蓮藕分離物在江蘇省蓮藕主產(chǎn)區(qū)發(fā)生越來越普遍,部分地區(qū)呈現(xiàn)流行暴發(fā)趨勢[5]。目前對該病毒的研究較少,急需建立一種高效且特異的檢測方法。本研究從感病的蓮藕樣品中克隆出SPLV-lotusHC-Pro基因,通過原核表達(dá)并純化了SPLV-lotus的HC-Pro蛋白。使用免疫新西蘭大白兔制備了效價(jià)較高的抗血清,并對抗血清檢測效果進(jìn)行了初步評價(jià),建立了SPLV-lotus抗血清的Western blot檢測體系,適用于田間生產(chǎn)上的檢測,為病毒的防治與研究提供了基礎(chǔ)。