賈世平，曾維愛，吳小森，史子涵，王玉生，蔡海林，譚 琳*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南省煙草公司長沙市公司，長沙 410019；3.湖南省煙草公司湘西州公司永順縣分公司，湘西 416700)

斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)屬鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲之一。其幼蟲食性雜，取食量大，可嚴(yán)重為害多種作物的葉片、嫩枝和花果，且具遷飛習(xí)性，易暴發(fā)成災(zāi)[1]。斜紋夜蛾是煙草生長中、后期的主要害蟲，發(fā)生嚴(yán)重時會給煙農(nóng)造成毀滅性的損失。為減少經(jīng)濟損失，生產(chǎn)上常通過化學(xué)防治來控制斜紋夜蛾，但長期使用一種或者一類化學(xué)藥劑常導(dǎo)致該蟲的抗藥性不斷增強，而且在葉片成熟期用藥存在農(nóng)藥殘留的隱患。隨著煙草病蟲害綠色防控體系的不斷發(fā)展和完善，對環(huán)境友好的生物防治技術(shù)逐漸引起重視。

以蟲治蟲、以菌治蟲等方法作為生物防治手段常被用來控制處于不同發(fā)育階段的害蟲,這些方法在持續(xù)防治害蟲方面具有顯著的優(yōu)勢。昆蟲桿狀病毒(baculovinus)能在寄主體內(nèi)復(fù)制，并在寄主種群中流行，且具專一性強、殺蟲毒力高等特點，被廣泛用于防治鱗翅目幼蟲[2]。如斜紋夜蛾核型多角體病毒Spodopteralituranuclear polyhedrosis virus(SpltNPV)被廣泛用于防治斜紋夜蛾[3-4]。鱗翅目害蟲的寄生性天敵有膜翅目和雙翅目昆蟲，寄生可發(fā)生在寄主的任一生育期[5]。卵寄生蜂中赤眼蜂應(yīng)用較早，目前在一定程度上實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，并被用于農(nóng)林業(yè)鱗翅目害蟲的防治[6]。寄生蜂與寄主、桿狀病毒與寄主間的關(guān)系是物種之間長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，在自然條件下寄生蜂與桿狀病毒也會共存于同一寄主體內(nèi)，共享同一個寄主并且獨立地抑制寄主的免疫反應(yīng)[7-8]。SpltNPV還可借助幼蟲寄生蜂斑痣懸繭蜂Meteoruspulchricornis傳播。有些寄生蜂還能精準(zhǔn)識別出已被病毒感染的寄主而選擇健康、未感染病毒的寄主進(jìn)行寄生[9-10]。目前，對斜紋夜蛾核型多角體病毒和赤眼蜂的研究主要集中于斜紋夜蛾核型多角體病毒對斜紋夜蛾幼蟲、成蟲壽命及產(chǎn)卵量的影響，赤眼蜂品系篩選和分子生物學(xué)方面[11-15]，關(guān)于兩者聯(lián)用的研究鮮見報道。湖南煙區(qū)在單項防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以“性誘劑防治成蟲、赤眼蜂寄生卵粒、捕食性天敵防控幼蟲”為主，核型多角體病毒等生防微生物為補充的斜紋夜蛾全程綠色防控技術(shù)體系。斜紋夜蛾在湖南每年發(fā)生4.0～4.5代，遷入煙田的第1代到第2代發(fā)生不整齊，存在卵期和低齡幼蟲期重合的情況[16]，因此，在防治中會同時使用赤眼蜂和斜紋夜蛾核型多角體病毒。本研究以煙田及周邊生態(tài)系統(tǒng)中常見的松毛蟲赤眼蜂TrichogrammadendrolimiMatsumura、螟黃赤眼蜂T.chilonisIshii和斜紋夜蛾核型多角體病毒為材料，評價赤眼蜂和SpltNPV聯(lián)用對斜紋夜蛾卵期和幼蟲期的防治效果，以期為斜紋夜蛾的田間防治提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試斜紋夜蛾由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院經(jīng)濟作物害蟲生防實驗室提供，在室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)于(26±1)℃，相對濕度(RH)60%～70%，光周期L∥D=14 h∥10 h的人工氣候培養(yǎng)箱中。已連續(xù)飼養(yǎng)多代。挑選8 h內(nèi)初產(chǎn)的無覆毛新鮮飽滿單層卵塊進(jìn)行試驗。為排除病毒與細(xì)菌的干擾，供試卵在試驗前均用5%甲醛溶液浸漬10 s然后用無菌水沖洗3次后再用濾紙吸干。

松毛蟲赤眼蜂購自萊切諾生物科技有限公司,螟黃赤眼蜂購自河南省科云生物農(nóng)藥有限公司。將赤眼蜂蜂卡置入透氣性的養(yǎng)蟲盒(14 cm×8.6 cm×5 cm)中飼養(yǎng)，待羽化后向養(yǎng)蟲盒中加入適量飽滿的滅活柞蠶卵供其寄生并在人工氣候培養(yǎng)箱中連續(xù)飼養(yǎng)多代。飼養(yǎng)條件：(26±1)℃，RH 40%～50%，光周期L∥D=14 h∥10 h。挑選能正常飛行且位于養(yǎng)蟲盒上蓋的健康赤眼蜂用于試驗。

1.2 供試病毒

斜紋夜蛾核型多角體病毒水分散粒劑(SpltNPV-KY)購自河南省科云生物農(nóng)藥有限公司，有效成分為200億PIB/g,用無菌水配制成含量為2.0×107PIB/mL的溶液備用。

1.3 試驗方法

1.3.1不同前處理方式對斜紋夜蛾卵孵化與幼蟲成活率的影響

挑取8 h內(nèi)初產(chǎn)的無覆毛新鮮飽滿的斜紋夜蛾單層卵塊，分別在無菌水(A)或5%甲醛溶液中浸漬10 s，然后用無菌水沖洗3次后用濾紙吸干(B)；或先用5%甲醛溶液浸漬10 s然后用無菌水沖洗3次，隨后再在2.0×107PIB/mL SpltNPV-KY病毒液中浸漬10 s，用濾紙將多余的病毒液吸干(C)。待卵塊室溫晾干后，將不同處理的卵置于(26±1)℃、RH 60%～70%、光周期L∥D=14 h∥10 h的人工氣候培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。幼蟲孵化后及時將其挑出單獨飼養(yǎng)。各處理分別觀察3個卵塊(每卵塊至少含50粒單層的斜紋夜蛾卵)，并進(jìn)行5次生物學(xué)重復(fù)。每天記錄各處理方式下斜紋夜蛾卵的孵化情況，計算卵孵化率、已孵化的卵發(fā)育至3齡幼蟲概率。

1.3.2兩種赤眼蜂對斜紋夜蛾卵寄生能力的測定

分別挑選8 h內(nèi)初產(chǎn)的無覆毛新鮮飽滿的斜紋夜蛾單層卵塊，用5%甲醛溶液浸漬10 s，用濾紙吸干卵塊表面多余的甲醛溶液，待卵塊在室溫下自然晾干后將其放入透明養(yǎng)蟲盒中，按蜂卵比1∶5分別接入松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂，24 h后將卵塊轉(zhuǎn)移至滅菌的養(yǎng)蟲盒內(nèi)并置于人工氣候培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。對照處理為經(jīng)5%甲醛溶液浸漬的卵塊。每天記錄卵被寄生(卵變黑)和卵孵化的情況。將孵化的斜紋夜蛾幼蟲移至有新鮮飼料的12孔培養(yǎng)板中(1頭/孔)飼養(yǎng)，直至幼蟲死亡或化蛹，每天記錄各處理組斜紋夜蛾幼蟲死亡情況。各處理分別觀察5個卵塊(各卵塊至少含50粒單層的斜紋夜蛾卵)，并進(jìn)行5次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3SpltNPV與兩種赤眼蜂聯(lián)用對斜紋夜蛾的室內(nèi)防治試驗

挑取8 h內(nèi)初產(chǎn)的無覆毛、新鮮飽滿的斜紋夜蛾單層卵塊，置于100 mL燒杯中內(nèi)用5%甲醛溶液浸漬10 s，然后用無菌水清洗3次，隨后再用2.0×107PIB/mL的SpltNPV-KY病毒液浸漬10 s，用濾紙吸干卵塊表面多余的病毒液，于室溫下自然晾干，然后分裝于透明養(yǎng)蟲盒中。按蜂卵比1∶5分別接入松毛蟲赤眼蜂、螟黃赤眼蜂。以用5%甲醛溶液浸漬10 s然后用無菌水清洗3次再用濾紙吸干的卵塊為對照。其余步驟見1.3.2。每天分別記錄各處理組斜紋夜蛾幼蟲存活狀態(tài)并計算卵孵化率、卵寄生率、赤眼蜂出蜂率、斜紋夜蛾幼蟲死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

孵化率=孵化卵粒數(shù)/總卵粒數(shù)×100%；

發(fā)育至3齡幼蟲概率=發(fā)育至3齡幼蟲數(shù)/孵化卵粒數(shù)×100%；

幼蟲死亡率=幼蟲死亡蟲數(shù)/孵化總幼蟲數(shù)×100%；

校正幼蟲死亡率=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)]×100%；

寄生率=[(變黑亮有羽化孔的卵粒數(shù)+變黑亮無羽化孔的卵粒數(shù))/試驗總卵粒數(shù)]×100%；

赤眼蜂出蜂率=赤眼蜂出蜂數(shù)/被寄生卵粒數(shù)×100%；

總死亡率=[(寄生卵粒數(shù)+幼蟲死亡數(shù))/供試卵粒數(shù)]×100%。

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算和繪圖利用Excel 2020進(jìn)行，使用SPSS 20.0軟件單因素方差分析方法中的LSD法在0.05水平下進(jìn)行差異顯著性分析。

圖1 不同前處理對斜紋夜蛾卵孵化率及其發(fā)育至3齡幼蟲的概率的影響Fig.1 Effect of different pretreatment on hatching rate and probability of development to 3rd-instar larvae of Spodoptera litura

2 結(jié)果與分析

2.1 不同前處理方式對斜紋夜蛾卵孵化與幼蟲成活的影響

卵塊由圖1a可知，經(jīng)無菌水(CK)、5%甲醛溶液和SpltNPV-KY病毒液處理過的斜紋夜蛾卵塊的孵化率沒有顯著差異(F2,12=0.88，P>0.05)。SpltNPV-KY與5%甲醛溶液處理后斜紋夜蛾卵的孵化率分別為83.20%和84.40%。經(jīng)無菌水、5%甲醛溶液和SpltNPV-KY溶液處理斜紋夜蛾卵塊后，卵孵化并發(fā)育至3齡幼蟲的概率存在顯著差異(F2,12=821.493，P<0.05)。無菌水和5%甲醛溶液處理斜紋夜蛾卵塊后，卵孵化并發(fā)育至3齡幼蟲的概率顯著高于SpltNPV-KY病毒液處理的卵塊(圖1b)。無菌水和甲醛處理組卵孵化并發(fā)育至3齡階段的概率分別是88.28%和93.85%，而用SpltNPV-KY處理后卵發(fā)育至3齡幼蟲的概率僅為30.76%。由此可見，用5%甲醛溶液處理卵塊對卵及幼蟲的發(fā)育沒有明顯不良影響，結(jié)合其在抑制微生物方面的良好效果，可供卵塊表面消毒以排除干擾。

2.2 SpltNPV-KY與兩種赤眼蜂聯(lián)用對斜紋夜蛾卵孵化率的影響

卵塊用5%甲醛溶液消毒后分別接入松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂讓其寄生卵塊，24 h后移除赤眼蜂，斜紋夜蛾的卵孵化率僅為36.00%和44.00%。而SpltNPV-KY+松毛蟲赤眼蜂聯(lián)用組和SpltNPV-KY+螟黃赤眼蜂聯(lián)用組的斜紋夜蛾卵孵化率分別為37.60%和43.60%(圖2)。結(jié)果表明，赤眼蜂單獨寄生處理或與SpltNPV-KY聯(lián)用對斜紋夜蛾卵的孵化的抑制效果無顯著差異(松毛蟲赤眼蜂：F1,8=0.762,P>0.05;螟黃赤眼蜂:F1,8=0.024,P>0.05)。

圖2 赤眼蜂單用或與SpltNPV-KY聯(lián)用對斜紋夜蛾孵化率的影響Fig.2 Effect of Trichogramma alone or in combination with SpltNPV-KY on the average hatching rate of Spodoptera litura eggs

2.3 SpltNPV-KY與兩種赤眼蜂聯(lián)用對斜紋夜蛾幼蟲的致死效果

對孵化的斜紋夜蛾幼蟲進(jìn)行跟蹤觀察后發(fā)現(xiàn)SpltNPV-KY與赤眼蜂聯(lián)用組的幼蟲在3齡前陸續(xù)死亡。SpltNPV-KY+松毛蟲赤眼蜂、SpltNPV-KY+螟黃赤眼蜂和SpltNPV-KY處理組斜紋夜蛾幼蟲校正死亡率均無顯著差異。其幼蟲校正死亡率分別為72.93%、64.52%和67.22%(圖3)。研究表明，上述3種處理對斜紋夜蛾幼蟲均具有顯著的毒殺作用，且不存在顯著差異(F2,12=0.888,P>0.05)。SpltNPV-KY病毒在斜紋夜蛾卵期傳播和侵染后對幼蟲期的斜紋夜蛾具有較好的殺滅效果。

2.4 SpltNPV-KY與兩種赤眼蜂聯(lián)用對赤眼蜂寄生率和出蜂率的影響

松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂對斜紋夜蛾卵均有良好的寄生效果，兩種寄生蜂單獨處理的寄生率分別為64.00%和56.00%，而與SpltNPV-KY聯(lián)用的寄生率分別為62.40%和56.40%，寄生蜂單獨使用或與SpltNPV-KY聯(lián)用時松毛蟲赤眼蜂的寄生率均顯著高于螟黃赤眼蜂(表1)。SpltNPV-KY對松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂的寄生效果均無顯著影響；但相對于感染病毒的寄主，松毛蟲赤眼蜂更偏向于寄生新鮮健康的卵，且對感毒處理的卵塊搜尋時間明顯延長，攻擊次數(shù)明顯減少，寄生率降低了1.60百分點。同時，與SpltNPV-KY病毒聯(lián)用后兩種赤眼蜂寄生斜紋夜蛾卵后的出蜂率亦未受到明顯影響(F1,8=1.367,P>0.05)。研究結(jié)果表明，SpltNPV-KY浸卵對兩種赤眼蜂寄生斜紋夜蛾的效果及出蜂率均無明顯影響。結(jié)合赤眼蜂對卵期的斜紋夜蛾具有良好的寄生效果表明SpltNPV-KY與松毛蟲赤眼蜂聯(lián)用可作為卵期-幼蟲期防治斜紋夜蛾的一種重要手段。

圖3 赤眼蜂與SpltNPV-KY聯(lián)用對斜紋夜蛾幼蟲的致死率Fig.3 Corrected mortality of Spodoptera litura larvae treated with Trichogramma and SpltNPV-KY

表1 兩種赤眼蜂與 SpltNPV-KY聯(lián)用及單用對赤眼蜂寄生率和出蜂率的影響1)Table 1 Effects of combined use of two Trichogramma species with SpltNPV-KY or single use on the parasitism and emergence rates of Trichogramma species

2.5 不同處理下斜紋夜蛾卵-幼蟲期總死亡率

5%甲醛溶液(對照組)、SpltNPV-KY、松毛蟲赤眼蜂、SpltNPV-KY+松毛蟲赤眼蜂、螟黃赤眼蜂和SpltNPV-KY+螟黃赤眼蜂組的斜紋夜蛾卵-幼蟲期總死亡率分別為31.60%、87.60%、84.00%、94.80%、80.00%和90.00%(圖4)，各處理組與對照組的斜紋夜蛾總死亡率存在顯著差異(SpltNPV-KY:F1,8=417.021,P<0.05;松毛蟲赤眼蜂：F1,8=512.269,P<0.05;SpltNPV-KY+松毛蟲赤眼蜂：F1,8=713.257,P<0.05;螟黃赤眼蜂:F1,8=437.045,P<0.05;SpltNPV-KY+螟黃赤眼蜂：F1,8=592.111,P<0.05)。SpltNPV-KY+松毛蟲赤眼蜂聯(lián)用組的總死亡率顯著高于SpltNPV-KY和松毛蟲赤眼蜂單獨處理組(P<0.05)；SpltNPV-KY+螟黃赤眼蜂聯(lián)用組與SpltNPV-KY單獨處理組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于螟黃赤眼蜂單獨處理組(P<0.05)。研究結(jié)果表明，SpltNPV-KY與赤眼蜂聯(lián)合使用能夠在一定程度上提高防治效果。SpltNPV-KY與兩種赤眼蜂聯(lián)用使大量斜紋夜蛾卵被赤眼蜂寄生，同時卵塊在孵化過程中由于幼蟲取食卵殼而獲毒，被SpltNPV-KY侵染的斜紋夜蛾表現(xiàn)為幼蟲孵化后在早期發(fā)育階段大量死亡、蛹期壞死和畸形而不能正常發(fā)育至成蟲。

圖4 不同處理下斜紋夜蛾卵及幼蟲的總死亡率Fig.4 Total mortality of egg and larvae of Spodoptera litura in different treatments

3 結(jié)論與討論

保護(hù)和利用寄生性天敵與生物農(nóng)藥使用是有害生物綜合治理中的重要舉措。寄生蜂和核型多角體病毒都可以有效地抑制害蟲種群數(shù)量，是重要的生物防治資源[17]。本文研究了在室內(nèi)對斜紋夜蛾卵塊進(jìn)行前處理消毒以及斜紋夜蛾核型多角體病毒與赤眼蜂聯(lián)用對斜紋夜蛾的室內(nèi)防治效果及其對赤眼蜂的寄生和出蜂數(shù)影響。研究結(jié)果表明，用5%甲醛溶液對卵進(jìn)行消毒可作為室內(nèi)飼養(yǎng)斜紋夜蛾的前處理方式，可防止病毒及細(xì)菌感染導(dǎo)致的幼蟲早期大量死亡，這與徐莉等對斜紋夜蛾卵處理的結(jié)果一致[15]。本研究表明，松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂均能成功寄生無覆毛新鮮、飽滿的斜紋夜蛾單層卵塊，田俊策等和李志剛等研究發(fā)現(xiàn)螟黃赤眼蜂等5種赤眼蜂均可以寄生草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith)的卵[14,18]，而許晶發(fā)現(xiàn)松毛蟲赤眼蜂偏好寄生新鮮的1日齡玉米螟卵[19]。由此可見，松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂不僅對斜紋夜蛾具有較好的控制潛力，還可應(yīng)用于多種農(nóng)作物鱗翅目害蟲的卵期防治。

本研究結(jié)果顯示，兩種赤眼蜂單用或與核型多角體病毒室內(nèi)聯(lián)用均能降低斜紋夜蛾卵的孵化率，并影響低齡幼蟲的正常發(fā)育。曾維愛等測定核型多角體病毒對斜紋夜蛾卵的毒力時發(fā)現(xiàn)，因幼蟲孵化后會取食卵殼，經(jīng)核型多角體病毒處理過的斜紋夜蛾的卵殼上少量的病毒也被幼蟲攝入體內(nèi)，導(dǎo)致其死亡[20]。據(jù)此推測，低齡幼蟲的死亡和發(fā)育異常與核型多角體病毒通過卵表傳播有關(guān)。核型多角體病毒與赤眼蜂聯(lián)用后對寄主害蟲的防效和赤眼蜂安全性評估結(jié)果顯示，SpltNPV-KY和赤眼蜂聯(lián)用組的寄生率和出蜂率與赤眼蜂單獨寄生組無明顯差異，表明SpltNPV-KY對赤眼蜂寄生效果和出蜂效果無不良影響，核型多角體病毒對赤眼蜂是安全的、無顯著的致死或亞致死效應(yīng)。這一結(jié)果與朱亞芳等關(guān)于側(cè)溝繭蜂Microplitissp.對感毒與健康宿主斜紋夜蛾的選擇行為的研究結(jié)果相似[21]。綜上所述，供試的松毛蟲赤眼蜂和螟黃赤眼蜂均可寄生斜紋夜蛾卵，并且與核型多角體病毒聯(lián)用對斜紋夜蛾卵及幼蟲均有良好防效，核型多角體病毒對卵寄生蜂羽化無不良影響，將核型多角體病毒與卵寄生蜂協(xié)同應(yīng)用于害蟲綠色防控切實可行且安全。必須指出的是本試驗以單層寄主卵作為研究對象，而自然情況下斜紋夜蛾的卵有可能為多層且覆毛，赤眼蜂對多層或覆毛卵的寄生情況今后還應(yīng)進(jìn)一步研究。