李維松,顏曉蕊,3,楊文釗,殷崇文,3,曾 琴,3,馮曉東,王曉亮,秦譽(yù)嘉,3,郭韶堃,3,柳麗君,3,趙紫華,3,李志紅,3*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物生物安全系,北京 100193;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物檢疫有害生物監(jiān)測(cè)防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.三亞中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)研究院,三亞 572000;4.全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,北京 100125)

實(shí)蠅隸屬于雙翅目Diptera實(shí)蠅科Tephritidae,目前世界已知約500個(gè)屬,4 500余種,約250種實(shí)蠅具有重要的經(jīng)濟(jì)意義,其入侵防控受到全球高度關(guān)注[1-3]。番石榴果實(shí)蠅Bactroceracorrecta(Bezzi),屬實(shí)蠅科Tephritidae果實(shí)蠅屬Bactrocera,被中國(guó)、韓國(guó)、日本、古巴、墨西哥等列為進(jìn)境檢疫性有害生物,引起世界各國(guó)植物檢疫機(jī)構(gòu)高度重視[2,4]。該蟲寄主范圍廣泛,可為害番石榴、蓮霧、芒果、櫻桃、腰果等30個(gè)科60余種植物[2,5],以熱帶及亞熱帶的果蔬植物為主。其雌成蟲在寄主果皮下產(chǎn)卵,孵化的幼蟲蛀食造成果實(shí)品質(zhì)降低,經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[2,6]。在印度南部,番石榴果實(shí)蠅對(duì)番石榴的為害率最高可達(dá)80%,遠(yuǎn)超其他實(shí)蠅類害蟲[6],在泰國(guó),番石榴果實(shí)蠅同橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis(Hendel)被認(rèn)為是影響芒果和番石榴生產(chǎn)的主要害蟲[7]。

番石榴果實(shí)蠅首次于1916年在印度東北部比哈爾報(bào)道發(fā)生[8],現(xiàn)廣泛分布于不丹、緬甸、尼泊爾、巴基斯坦、斯里蘭卡、泰國(guó)等南亞及東南亞國(guó)家[2,9];該蟲于1986年在美國(guó)的加利福尼亞州及佛羅里達(dá)州監(jiān)測(cè)到發(fā)生,美國(guó)已于2015年宣布該蟲被徹底根除[10-11]。在我國(guó),番石榴果實(shí)蠅首次于1989年在云南元江、漠沙報(bào)道發(fā)生[12],Qin等基于mtDNAcox1基因及12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn),對(duì)世界主要分布區(qū)番石榴果實(shí)蠅的種群遺傳結(jié)構(gòu)及入侵路線進(jìn)行分析,推測(cè)出番石榴果實(shí)蠅具有從南亞到東南亞再到中國(guó)云南的擴(kuò)散趨勢(shì)[13]。我國(guó)于2003年-2011年,在云貴川及廣西4省區(qū)108個(gè)市縣進(jìn)行監(jiān)測(cè),結(jié)果表明,番石榴果實(shí)蠅起初僅分布于云南縱向嶺谷區(qū)部分市縣,而后逐步向云南北部擴(kuò)散,西北至六庫(kù)地區(qū),中北至金沙江流域元謀一帶,滇東擴(kuò)散至南盤江流域盤溪。2009年-2011年番石榴果實(shí)蠅已入侵至四川攀枝花和米易[14]。2017年3月,番石榴果實(shí)蠅于廣西百色、田陽被監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),該地距番石榴果實(shí)蠅最近報(bào)道的云南東部地區(qū)300 km[15],進(jìn)一步表明番石榴果實(shí)蠅已經(jīng)出現(xiàn)由云南向外擴(kuò)散的現(xiàn)象。

番石榴果實(shí)蠅在18～33℃條件下,各階段發(fā)育歷期與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,實(shí)驗(yàn)室條件下控制溫度25～34℃,相對(duì)濕度70%,其完成1個(gè)世代僅需30 d左右[16-17]。海南省地處熱帶北緣,全年平均溫度24℃以上,雨水充沛,是我國(guó)重要的熱帶水果產(chǎn)區(qū),出口約180多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。三亞市地處海南省南部,溫度、濕度等氣候條件非常適合實(shí)蠅類害蟲生長(zhǎng)發(fā)育;近年來三亞市果蔬產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展,果蔬的產(chǎn)量直接影響農(nóng)民生活質(zhì)量及三亞市整體經(jīng)濟(jì)[18],該蟲入侵為害將影響蓮霧、芒果、番石榴等海南優(yōu)質(zhì)熱帶水果的生產(chǎn)和出口貿(mào)易,因此避免番石榴果實(shí)蠅入侵為害至關(guān)重要。本研究通過對(duì)在海南省三亞市崖州灣科技城誘捕到的500頭實(shí)蠅成蟲樣品進(jìn)行形態(tài)鑒定,隨機(jī)挑取5頭實(shí)蠅成蟲樣品進(jìn)行DNA條形碼及常規(guī)PCR鑒定,證實(shí)誘捕到的實(shí)蠅成蟲為番石榴果實(shí)蠅,為相關(guān)植物檢疫部門進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)其監(jiān)測(cè)防控,防止此類實(shí)蠅科害蟲擴(kuò)散蔓延提供決策支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2021年10月至2022年6月連續(xù)9個(gè)月在海南省三亞市崖州灣科技城(18.32°N,109.16°E),通過懸掛誘捕器,放置甲基丁香酚(ME)、誘蠅酮(CUE)及蛋白誘劑誘集到橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅Zeugodacuscucurbitae(Coquillett)及疑似番石榴果實(shí)蠅,從中分離出疑似番石榴果實(shí)蠅并隨機(jī)選取供試實(shí)蠅成蟲共500頭進(jìn)行形態(tài)鑒定,參考植物檢疫抽樣技術(shù)規(guī)則[19],按1% 抽樣率從500頭中隨機(jī)挑取5頭進(jìn)行分子鑒定,編號(hào)為(HNSY1～HNSY5),全部樣品置于裝有無水乙醇的離心管中液浸,-80℃冰箱凍存。

1.2 方法

1.2.1形態(tài)鑒定

在Olympus(SZ51)體視鏡下觀察500頭供試實(shí)蠅成蟲樣品的形態(tài)特征,并根據(jù)《實(shí)蠅類重要害蟲鑒定圖冊(cè)》[5]所描述的番石榴果實(shí)蠅鑒定特征與之比對(duì)。

1.2.2DNA條形碼鑒定

1.2.2.1DNA提取

單頭實(shí)蠅基因組DNA提取按照姜帆的方法[20],使用天根生化科技(北京)有限公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取完成后,在Q5000超微量紫外分光光度計(jì)下(美國(guó)Quawell),取1 μL DNA模板測(cè)量其純度及濃度。

1.2.2.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序

參照Folmer等[21]設(shè)計(jì)的LCO1490/HCO2198引物對(duì)(引物由北京擎科生物科技有限公司合成),使用VeritiTM96-well Thermal Cycler PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems),擴(kuò)增實(shí)蠅成蟲樣品mtDNAcox1基因,擴(kuò)增片段大小 658 bp。擴(kuò)增體系為25 μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR程序?yàn)?4℃ 3 min;95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用0.01% Gene Green [天根生化科技(北京)有限公司]染色,以D2000 DNA marker 為分子標(biāo)記,最后在Gel Logic 212 PRO凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Carestream Kodak)中觀察結(jié)果。檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.2.3序列分析

測(cè)序結(jié)果利用DNAMAN 5.2.2.0進(jìn)行拼接處理[22],得到5頭實(shí)蠅樣品DNA條形碼序列。利用Bold Systems v4的IDENTIFICATION-Species Level Barcode Records功能對(duì)所獲得的5條實(shí)蠅DNA序列進(jìn)行比對(duì)，從而確定供試實(shí)蠅樣品種類(相似性≥98%時(shí)判定為同一種)。

1.2.2.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用MEGA 7分析軟件[23]的Kimura 2-parameter模型,鄰接(NJ)法，構(gòu)建本研究所得5條DNA條形碼序列與GenBank中不同地理種群及近緣種的DNA條形碼序列(表1)系統(tǒng)發(fā)育樹,以棗實(shí)蠅Carpomyavesuviana為外群。

表1 從 GenBank 中選取的用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的DNA 序列Table 1 Selected DNA sequences from GenBank for constructing phylogenetic trees

1.2.3番石榴果實(shí)蠅的PCR鑒定

參考Jiang等[24]基于mtDNAcox1基因設(shè)計(jì)的番石榴果實(shí)蠅特異性引物對(duì)BCOR-F/BCOR-R(5′-TGACTTGTCCCCCTAATACTG-3′/5′-GTCGATCG-

CATGTTAATAACG-3′)進(jìn)行擴(kuò)增。引物對(duì)由北京擎科生物科技有限公司合成,擴(kuò)增片段大小281 bp。擴(kuò)增體系為25 μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR程序?yàn)?5℃ 3 min;95℃ 15 s,60℃退火延伸1 min,30個(gè)循環(huán)后60℃延伸1 min。

反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用0.01% Gene Green染色,最后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)鑒定500頭供試實(shí)蠅成蟲樣品均為番石榴果實(shí)蠅,主要形態(tài)鑒別特征如下:成蟲體色黑黃相間;頭部具顏面斑1對(duì),呈黑褐色,顏面斑向中部相連形成深色橫帶(有時(shí)不連接);中胸背板呈黑色,縫后兩側(cè)黃條紋平行,延伸至后翅上鬃后,肩胛、背側(cè)胛及小盾片黃色,小盾片基部具黑色橫帶;翅前緣帶褐色,終于r1室的末端,在r2+3室的下端和r4+5室的上端形成狹褐斑(圖1)。

圖1 番石榴果實(shí)蠅主要形態(tài)鑒定特征Fig.1 The main morphological identification features of Bactrocera correcta

2.2 DNA條形碼鑒定結(jié)果

本研究選取的5頭采自海南省三亞市崖州灣科技城的實(shí)蠅成蟲樣品測(cè)序所得的658 bp DNA條形碼序列,與Bold Systems v4數(shù)據(jù)庫(kù)中番石榴果實(shí)蠅序列對(duì)比,相似性為99.49%～100%,結(jié)果表明隨機(jī)挑選的5頭實(shí)蠅成蟲樣品均為番石榴果實(shí)蠅。

基于鄰接(NJ)法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖2所示,本研究所獲5條DNA條形碼序列與GenBank中記錄的番石榴果實(shí)蠅序列聚在同一分支上且為單系,與DNA條形碼序列比對(duì)結(jié)果一致。

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的番石榴果實(shí)蠅及其近緣種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Bactrocera correcta and its relatives based on neighbor-joining method

2.3 PCR鑒定結(jié)果

以番石榴果實(shí)蠅特異性引物對(duì)實(shí)蠅成蟲樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示,條帶清晰,片段大小為281 bp,進(jìn)一步說明隨機(jī)挑選的5頭實(shí)蠅成蟲樣品為番石榴果實(shí)蠅。

3 結(jié)論與討論

本研究從海南省三亞市崖州灣科技城采集到疑似番石榴果實(shí)蠅成蟲樣品,利用形態(tài)特征,DNA條形碼及常規(guī)PCR等方法,對(duì)樣品進(jìn)行鑒定,確定誘集到的實(shí)蠅樣品為番石榴果實(shí)蠅成蟲。

番石榴果實(shí)蠅1989年首次在我國(guó)云南省報(bào)道發(fā)生后,近幾十年來其已經(jīng)呈現(xiàn)出向周邊省份擴(kuò)散的趨勢(shì)。生態(tài)位模型表明番石榴果實(shí)蠅在我國(guó)的中、高適生區(qū)域主要包括云貴川高原、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地區(qū)[25]。羽化率模型表明從5月到9月,我國(guó)大部分地區(qū)均適合番石榴果實(shí)蠅的生長(zhǎng),對(duì)廣東、廣西、云南、海南等省份需全年加強(qiáng)監(jiān)測(cè);隨著未來全球氣溫變化,番石榴果實(shí)蠅在我國(guó)的適生區(qū)將北移至33°N附近,原有的高度適生區(qū)和中度適生區(qū)范圍面積明顯擴(kuò)大,新增江西大部和豫鄂交界地帶為高度適生區(qū);因此,若不加強(qiáng)番石榴果實(shí)蠅的檢疫監(jiān)測(cè)管理,其具有非常大的可能性入侵我國(guó)大部分省市[26]。綜上所述,番石榴果實(shí)蠅如進(jìn)一步擴(kuò)散將對(duì)我國(guó)水果產(chǎn)區(qū)造成非常嚴(yán)重的破壞。

準(zhǔn)確了解掌握實(shí)蠅科害蟲入侵機(jī)制及入侵來源有助于完善入侵防控的管理體系和技術(shù)體系[3],但目前有關(guān)番石榴果實(shí)蠅的入侵機(jī)制及防控技術(shù)的研究仍非常缺乏;Gu等針對(duì)番石榴果實(shí)蠅及橘小實(shí)蠅在高溫下的熱馴化機(jī)制進(jìn)行探究,結(jié)果表明兩種實(shí)蠅在45℃高溫下均表現(xiàn)出馴化現(xiàn)象,增強(qiáng)了抵御高溫脅迫的能力;在35℃下,許多熱激蛋白基因(Hsps)僅在番石榴果實(shí)蠅中上調(diào)[27],此結(jié)果能合理解釋目前番石榴果實(shí)蠅在我國(guó)主要分布現(xiàn)狀及為何在溫度更高的印度南部地區(qū)具有比其他實(shí)蠅更高的為害率,為進(jìn)一步研究其入侵機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

海南省地處熱帶北緣,島內(nèi)物產(chǎn)豐富,國(guó)內(nèi)外貿(mào)易往來頻繁,2020年6月,中共中央、國(guó)務(wù)院印發(fā)《海南自由貿(mào)易港建設(shè)總體方案》,這標(biāo)志著我國(guó)擴(kuò)大對(duì)外開放,積極推進(jìn)全球經(jīng)濟(jì)一體化的決心和毅力,是重大的歷史機(jī)遇也是挑戰(zhàn)[28]。方案中明確指出要以海南南繁科研育種基地為基礎(chǔ),建設(shè)全球動(dòng)植物種質(zhì)資源引進(jìn)中轉(zhuǎn)基地,充分利用國(guó)內(nèi)外資源,豐富我國(guó)種質(zhì)資源,推動(dòng)我國(guó)種業(yè)不斷創(chuàng)新發(fā)展,服務(wù)于國(guó)家重大戰(zhàn)略決策[29]。此次在三亞崖州灣科技城發(fā)現(xiàn)番石榴果實(shí)蠅,筆者認(rèn)為亟須在海南開展番石榴果實(shí)蠅田間調(diào)查、樣品收集、精準(zhǔn)鑒定，從而確定其發(fā)生范圍及寄主范圍,以及基于基因組學(xué)等明確其來源,采取必要措施控制其發(fā)生擴(kuò)散,以避免對(duì)海南優(yōu)質(zhì)熱帶水果種質(zhì)及產(chǎn)品出口造成影響,促進(jìn)海南自貿(mào)港及全球動(dòng)植物種質(zhì)資源引進(jìn)中轉(zhuǎn)基地的建設(shè)。

總的來說,本研究證實(shí)海南三亞崖州灣科技城誘集到的疑似番石榴果實(shí)蠅樣品為番石榴果實(shí)蠅。筆者建議相關(guān)植物檢疫機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)番石榴果實(shí)蠅適生區(qū)的檢疫、監(jiān)測(cè)及防控,以防止其進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延至我國(guó)其他省份。此外,需系統(tǒng)性開展番石榴果實(shí)蠅快速檢測(cè)鑒定技術(shù)、種群溯源技術(shù)、檢疫處理技術(shù)的研究與應(yīng)用,加強(qiáng)番石榴果實(shí)蠅入侵機(jī)制研究,從而為番石榴果實(shí)蠅入侵防控、保護(hù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全、促進(jìn)我國(guó)果品出口提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。