趙振興,范奇璇,馮黎霞,李獻(xiàn)鋒,張永江

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,北京 100193;3.廣州海關(guān)技術(shù)中心,廣州 510623)

玉米ZeamaysL.是世界三大糧食作物之一,也是重要的飼料和工業(yè)原料。自2007年起,玉米超過(guò)水稻,成為我國(guó)種植面積最大的作物,并于2013年起成為總產(chǎn)量最高的作物(http:∥www.fao.org)。玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成我國(guó)糧食安全的重要基礎(chǔ),對(duì)我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定發(fā)展有重要意義。

玉米病毒病是玉米上最嚴(yán)重的病害之一,超過(guò)40種病毒病威脅著全世界的玉米生產(chǎn)。在我國(guó)至少有12種病毒侵染玉米,其中水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)、南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)和甘蔗花葉病毒(sugarcane mosaic virus,SCMV)是我國(guó)玉米病毒病的主要病原[1]。隨著國(guó)際貿(mào)易交流,大量的玉米種子及其產(chǎn)品的進(jìn)口帶來(lái)了外來(lái)有害生物入侵的風(fēng)險(xiǎn),如玉米褪綠斑駁病毒(maize chlorotic mottle virus,MCMV)于2009年首次在我國(guó)云南元謀縣田間玉米中檢測(cè)到[2],隨后逐漸擴(kuò)散,成為我國(guó)玉米生產(chǎn)的潛在威脅[3]。

目前,《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中侵染玉米的病毒有玉米褪綠矮縮病毒(maize chlorotic dwarf virus,MCDV)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaic virus,MDMV),其中玉米矮花葉病毒MDMV于2021年4月9日新增補(bǔ)至該名錄中,是我國(guó)關(guān)注的入侵物種。MDMV屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae,馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus,病毒粒體彎曲桿狀,大小約為750 nm×14 nm,在寄主細(xì)胞可以形成風(fēng)輪狀及卷筒狀內(nèi)含體[4]。MDMV是一種世界性病害,其與SCMV、約翰遜草花葉病毒(Johnsongrass mosaic virus,JGMV)都可造成玉米矮花葉病,由于它們引起的癥狀相似,導(dǎo)致某一地區(qū)玉米矮花葉病的病原難以分辨[5-6]。我國(guó)玉米矮花葉病病原主要為SCMV[7],近年來(lái),大量鑒定結(jié)果顯示，引起我國(guó)玉米矮花葉病主要病原均為SCMV(原被認(rèn)為是MDMV-B株系)[8]。我國(guó)廈門(mén)、上海等口岸從智利、阿根廷輸華玉米種子中多次檢出MDMV[9]。MDMV侵染玉米,造成植株矮化、葉片褪綠、不育、有時(shí)提早枯死,一般造成玉米產(chǎn)量減產(chǎn)20%以上,嚴(yán)重時(shí)絕收[4,10-11]。MDMV與MCMV可以復(fù)合侵染,引起玉米致死性壞死病(maize lethal necrosis disease,MLND),玉米發(fā)生MLND時(shí)葉片會(huì)嚴(yán)重黃化褐變,最終導(dǎo)致植株死亡,造成減產(chǎn)乃至絕收的嚴(yán)重后果[12]。目前我國(guó)關(guān)于MDMV的相關(guān)研究較少,對(duì)入境玉米種子中MDMV的檢測(cè)對(duì)我國(guó)玉米生產(chǎn)安全具有重要意義。

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)具有快速、靈敏、引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。RPA技術(shù)體系包含3種核心酶:重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶。通過(guò)一對(duì)引物,在存在目標(biāo)序列的情況下,于最適反應(yīng)溫度(37～42℃)啟動(dòng)DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增,可廣泛用于病毒基因組DNA或RNA的快速檢測(cè)[13]。在植物病毒檢測(cè)領(lǐng)域中,RPA技術(shù)至少已被用于35種植物病毒和4種類(lèi)病毒的檢測(cè),相關(guān)報(bào)道逐年增加[14],RPA技術(shù)已被用于檢測(cè)玉米中的MCMV[15-17]和RBSDV[18],由于玉米矮花葉病毒的定義發(fā)生了變化,以往國(guó)內(nèi)認(rèn)定的玉米矮花葉病毒均已證實(shí)為其他病毒[4,6-7,19-20],MDMV 的檢測(cè)研究較少,也未見(jiàn)MDMV的RPA檢測(cè)研究。本研究擬建立基于RPA技術(shù)的玉米矮花葉病毒的快速檢測(cè)方法,以用于玉米種子和田間作物的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究中所用的帶病毒玉米材料包括:SCMV、RBSDV、CMV侵染的‘鄭58’玉米葉片和MCMV侵染的玉米‘B73’種子由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存;小麥條紋花葉病毒(wheat streak mosaic virus,WSMV)從烏克蘭輸華玉米種子中檢出,由日照海關(guān)提供;MDMV帶毒玉米種子由廣州海關(guān)技術(shù)中心從智利輸華玉米種子中檢出并提供。

1.2 玉米材料總RNA提取

取10 g攜帶病毒或健康的玉米種子在干磨機(jī)中打碎至粉末狀,按質(zhì)量體積比1∶2比例加入PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl,12.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4·12H2O,2 mmol/L KH2PO4),充分混合放置15～30 min,取1 mL上清液備用;取攜帶病毒或健康的玉米葉片在液氮中充分研磨,取0.1 g備用。按照天根植物總RNA提取試劑盒(DP432)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行種子粉末上清液或葉片干粉的RNA提取,提取后放置于-80℃保存。

1.3 RPA引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中的MDMV外殼蛋白(coat protein,CP)基因序列,進(jìn)行序列比對(duì)分析,使用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo Primer Analysis Software version 7.60 (Molecular Biology Insights,Inc.,Cascade,CO,USA)設(shè)計(jì)引物(表1)。使用NCBI中Primer-BLAST (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行驗(yàn)證,確保其特異性。本研究所有引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

合成的RPA引物使用RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型)-Ⅱ(安普未來(lái)生物科技有限公司)進(jìn)行初步驗(yàn)證,擴(kuò)增產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序,并進(jìn)行比對(duì)。

1.4 RPA反應(yīng)體系優(yōu)化

本研究采用的RPA擴(kuò)增體系為50 μL,按照RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(基礎(chǔ)型)-Ⅱ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制,其中RNA模板為2 μL,buffer A 29.4 μL,buffer B 2.5 μL,ddH2O和引物總體積為16.1 μL。反應(yīng)結(jié)束后,加入Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提液,1∶1混勻抽提反應(yīng)液,12 000 r/min離心5 min,取5 μL上清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 用于擴(kuò)增玉米矮花葉病毒的RPA和RT-PCR引物Table 1 Primers of RPA and RT-PCR for amplification of maize dwarf mosaic virus

首先進(jìn)行了RPA引物濃度優(yōu)化,設(shè)置了5個(gè)濃度,分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L,反應(yīng)溫度為42℃,反應(yīng)時(shí)間為30 min;然后對(duì)RPA體系的反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)置了37、39.5、42、44.5、47℃ 5個(gè)反應(yīng)溫度,引物濃度為0.4 μmol/L,反應(yīng)時(shí)間為30 min;最后對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,分別設(shè)置5、10、15、20、25、30 min,反應(yīng)溫度為42℃,引物濃度為0.4 μmol/L。

1.5 RPA特異性驗(yàn)證和靈敏度測(cè)試

利用優(yōu)化好的RPA體系,提取SCMV、MCMV、RBSDV、WSMV和CMV侵染的玉米材料總RNA為模板,對(duì)該體系的特異性進(jìn)行檢測(cè)。

使用MDMV CP全長(zhǎng)特異性引物MDMV-CP-F/-R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并比對(duì),由北京擎科生物科技有限公司提供克隆服務(wù),將該片段連入pUC57克隆載體中,獲得陽(yáng)性質(zhì)粒。RT-PCR參照TransScript?Ⅱ One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒(全式金)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?？偡磻?yīng)體系為20 μL,包括模板RNA 4 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL、TransScript?Ⅱ One-Step Enzyme Mix 0.4 μL、2×TS Ⅱ One-Step Reaction Mix 10 μL、ddH2O 4.8 μL。反應(yīng)條件:50℃ 15 min;94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃,10 min。將陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋為108拷貝/μL(≈0.369 ng/μL),然后使用ddH2O將其梯度稀釋到1拷貝/μL,使用這9個(gè)梯度濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行靈敏度測(cè)試。

同時(shí)使用MDMV特異性檢測(cè)引物3MDF和1MDR[19]對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行靈敏度測(cè)試,參照全式金2×EasyTaq?PCR SuperMix試劑盒配制50 μL反應(yīng)體系,包括模板質(zhì)粒1 μL,正向引物和反向引物(10 μmol/L)各1 μL、2×EasyTaq?PCR SuperMix 25 μL、ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán);72℃,10 min。并與建立的RPA體系進(jìn)行比較。

1.6 玉米樣品檢測(cè)

使用建立的RPA體系和普通RT-PCR體系對(duì)近3年收集的100份玉米樣品進(jìn)行MDMV檢測(cè)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較,其中33份德國(guó)樣品為玉米葉片,其他67份樣品為玉米種子(表2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA體系的建立

為建立最適的RPA反應(yīng)體系,設(shè)計(jì)了3對(duì)RPA引物(表1),提取攜帶MDMV的玉米種子樣品CHI204-1、CHI204-2、CHI205-1、CHI205-2和健康玉米種子總RNA,以健康種子RNA為陰性對(duì)照,使用RPA試劑盒推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行了測(cè)試(圖1),結(jié)果顯示,3對(duì)RPA引物均能成功擴(kuò)增所有RNA樣品的目的片段,其中MDMV-RPA-1F/-1R引物組合的擴(kuò)增反應(yīng)最為穩(wěn)定且陰性對(duì)照雜帶最少,挑選為待優(yōu)化RPA體系的引物組合。

圖1 玉米矮花葉病毒RPA引物篩選Fig.1 Screening of RPA primers for maize dwarf mosaic virus

2.2 RPA體系的優(yōu)化

為獲得最優(yōu)的RPA反應(yīng)條件,首先對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示,擴(kuò)增條帶亮度在0.1～0.4 μmol/L 間逐漸變亮,當(dāng)濃度增加到0.4 μmol/L時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物亮度達(dá)到最亮,當(dāng)引物濃度為0.5 μmol/L時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物亮度減弱,因此選擇引物對(duì)終濃度為0.4 μmol/L 為最優(yōu)引物終濃度(圖2a)。

隨后對(duì)反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示在37、39.5、42℃和44.5℃條件下,RPA體系均能獲得較多的擴(kuò)增產(chǎn)物,表明RPA體系能適應(yīng)較廣的反應(yīng)溫度,當(dāng)溫度升高到47℃時(shí),擴(kuò)增效率才受到一定的影響,5個(gè)反應(yīng)溫度中,42℃時(shí)RPA擴(kuò)增體系條帶背景最弱,選為最終反應(yīng)溫度(圖2b)。

最后對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物亮度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在反應(yīng)20 min時(shí)達(dá)到最高值,隨后變化差異不大,故20 min選為最佳反應(yīng)時(shí)間(圖2c)。最終的RPA反應(yīng)體系中引物終濃度為0.4 μmol/L,反應(yīng)溫度為42℃,反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.3 RPA體系的特異性

為了驗(yàn)證RPA反應(yīng)的特異性,對(duì)分別帶有MDMV、SCMV、MCMV、RBSDV、WSMV和CMV的玉米樣品進(jìn)行RPA檢測(cè)。基于優(yōu)化的RPA反應(yīng)體系,帶MDMV病毒的樣品檢測(cè)為陽(yáng)性,帶有其他5種玉米病毒的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性,沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的情況(圖3)。

2.4 RPA體系的靈敏度

以獲得的攜帶MDMV-CP片段的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板,RPA反應(yīng)能檢測(cè)到濃度為105拷貝/μL(≈369 fg/μL),而RT-PCR的檢測(cè)靈敏度為106拷貝/μL(≈3.69 pg/μL),在此條件下,RPA檢測(cè)的靈敏度高于RT-PCR,是RT-PCR的10倍(圖4)。

圖2 RPA檢測(cè)玉米矮花葉病毒反應(yīng)體系優(yōu)化Fig.2 Optimization of RPA reaction system for detecting maize dwarf mosaic virus

圖3 玉米矮花葉病毒RPA體系特異性分析Fig.3 Specificity assay of RPA for maize dwarf mosaic virus

圖4 玉米矮花葉病毒RPA和PCR體系靈敏度分析Fig.4 Sensitivity test of RPA and PCR for maize dwarf mosaic virus

2.5 玉米樣品的檢測(cè)

對(duì)近3年送檢的國(guó)內(nèi)外100份玉米種子或葉片提取總RNA,分別使用RPA和RT-PCR進(jìn)行種子或葉片攜帶MDMV的檢測(cè),使用MDMV CP質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示,總共8批次,共100個(gè)玉米樣品均未檢出MDMV(表2)。

表2 RPA和RT-PCR檢測(cè)100份玉米樣品攜帶玉米矮花葉病毒的情況Table 2 Detection results of maize dwarf mosaic virus from 100 maize samples by RPA and RT-PCR

3 結(jié)論與討論

近年來(lái),等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè),與傳統(tǒng)的基于PCR的檢測(cè)技術(shù)相比,其具有反應(yīng)條件簡(jiǎn)便,高效特異的優(yōu)點(diǎn)[13]。玉米矮花葉病毒威脅玉米生產(chǎn),是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄中新列入的重要病毒。本研究建立了基于RPA技術(shù)的MDMV檢測(cè)方法,具有特異性高、操作難度小、反應(yīng)時(shí)間短、不依賴(lài)PCR儀等優(yōu)點(diǎn),為MDMV的快速精準(zhǔn)檢測(cè)提供了一種新方法。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)[21]、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification,RCA)[22]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[23]、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)[24]等,相對(duì)于基于PCR的檢測(cè)技術(shù),它們最大的優(yōu)勢(shì)在于能夠在恒定溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),使擴(kuò)增反應(yīng)不依賴(lài)于PCR儀的限制。在等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中,RPA技術(shù)僅需設(shè)計(jì)1對(duì)引物,反應(yīng)溫度為37～42℃,反應(yīng)時(shí)間通常為30 min,靈敏度高,且易與其他技術(shù)相結(jié)合的特點(diǎn),使其應(yīng)用和發(fā)展更具優(yōu)勢(shì)。本研究根據(jù)MDMV CP的保守序列,設(shè)計(jì)了3對(duì)RPA引物,盡管效率和穩(wěn)定性有差異,但都可以對(duì)MDMV進(jìn)行特異性檢測(cè),表明RPA引物的設(shè)計(jì)難度并不大。進(jìn)行了引物濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化,結(jié)果顯示在引物濃度0.4 μmol/L、反應(yīng)溫度42℃與反應(yīng)時(shí)間20 min條件下擴(kuò)增效果最好,其中反應(yīng)溫度在37～44.5℃之間均能高效擴(kuò)增;而擴(kuò)增時(shí)間達(dá)到5 min后,就可以通過(guò)凝膠電泳觀(guān)察到陽(yáng)性反應(yīng)。以上結(jié)果顯示出RPA體系的穩(wěn)定性和高效性。

本研究挑選了玉米中重要的5種病毒作為對(duì)照,驗(yàn)證了建立的RPA體系的特異性。通過(guò)梯度稀釋MDMV-CP參照質(zhì)粒,檢測(cè)構(gòu)建的RPA體系的靈敏度為105拷貝/μL(≈369 fg/μL),靈敏度高于RT-PCR 的106拷貝/μL(≈3.69 pg/μL)。RPA體系易與除凝膠電泳外的其他核酸產(chǎn)物檢測(cè)方法相結(jié)合,如與側(cè)流層析試紙條法(lateral flow dipstick,LFD)相結(jié)合,其檢測(cè)靈敏度是RT-PCR的100倍[25],還可減少總的檢測(cè)耗時(shí);與CRISPR/Cas報(bào)告系統(tǒng)相結(jié)合,可增加檢測(cè)靈敏度[26-27]。本研究構(gòu)建的RPA體系也有進(jìn)一步改良的潛力。

以智利來(lái)源的MDMV帶毒玉米種子為陽(yáng)性對(duì)照,使用本研究建立的RPA技術(shù)和RT-PCR[19]方法對(duì)國(guó)內(nèi)玉米樣品中MDMV的檢測(cè)結(jié)果與MDMV不是我國(guó)玉米矮花葉病的主要病原的報(bào)道一致[1,6,20]。對(duì)來(lái)自德國(guó)、俄羅斯、烏克蘭和美國(guó)的部分玉米樣品進(jìn)行檢測(cè),均未檢測(cè)到MDMV,但各口岸屢有截獲從阿根廷、智利等南美洲國(guó)家進(jìn)口的攜帶MDMV的玉米種子[8],因此要利用好高效快速精準(zhǔn)的檢測(cè)方法,重點(diǎn)做好南美洲等疫區(qū)進(jìn)境玉米的檢測(cè)工作。