吳瑞瑞,葉云鋒,陳松余,徐幼平,樓兵干,蔡新忠*

(1.浙江大學(xué)海南研究院,三亞 572025;2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)研究所,浙江省作物病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310058;3.浙江大學(xué)分析測(cè)試中心,杭州 310058)

由革蘭氏陰性菌——解淀粉歐文氏菌Erwiniaamylovora引起的梨火疫病是世界范圍內(nèi)的毀滅性病害,已被我國(guó)列為重要的檢疫性有害生物[1-2]。梨火疫病菌寄主范圍廣,主要侵染薔薇科仁果類果樹(shù)和其他植物,如梨、蘋(píng)果和山楂。其毀滅性還體現(xiàn)在可以侵染寄主植物地上部分所有組織,包括花、嫩枝、樹(shù)干、主干、果實(shí)以及砧木[3]。該病害起源于北美,但是隨著人類活動(dòng)現(xiàn)已傳播擴(kuò)散至世界60多個(gè)國(guó)家和地區(qū) (https:∥gd.eppo.int/taxon/ERWIAM/distribution)。我國(guó)果樹(shù)資源豐富,蘋(píng)果和梨的栽培面積和總產(chǎn)量均居世界首位。僅梨年出口創(chuàng)匯就達(dá)2億美元以上,是中國(guó)農(nóng)村和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。如果火疫病在我國(guó)大面積發(fā)生將造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4],因此必須進(jìn)行有效預(yù)防和控制。

E.amylovora主要通過(guò)自然孔口和傷口侵入植物,進(jìn)而通過(guò)薄壁組織的細(xì)胞間隙移至維管束系統(tǒng),菌體在木質(zhì)部大量積累阻礙寄主植物的水分傳輸,從而導(dǎo)致植物枯萎甚至死亡[5]。E.amylovora致病分子機(jī)制已有系統(tǒng)研究,鑒定明確的致病因子包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)和胞外多糖[6]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白包括DspA/E,HrpN,HrpW,Eop1,Eop3和AvrRpt2EA等[7]。分別與DspA/E和HrpN互作的DIPMs和HIPMs為蘋(píng)果感病基因[8-10]。

植物抗火疫病分子機(jī)制近年來(lái)取得了重要進(jìn)展。已經(jīng)明確植物對(duì)火疫病的抗性是一種數(shù)量性狀。目前已經(jīng)有一些抗火疫病的數(shù)量性狀位點(diǎn) (quantitative trait loci,QTLs) 得到了鑒定,如FB_Mr5,FB_Mfu10以及FB_Mar12[7]。有些QTL編碼典型抗病蛋白 (resistance protein,R protein),具有識(shí)別Avr等典型基因?qū)蚧プ飨到y(tǒng)中R蛋白的功能。如FB_Mr5編碼一個(gè)CC-NBS-LRR類R蛋白,識(shí)別火疫病菌AvrRpt2EA對(duì)蘋(píng)果RPM1互作蛋白4 (RPM1 interacting protein 4,RIN4) 的攻擊,激發(fā)抗病性[11]。鑒定明確了一個(gè)蘋(píng)果凝集因子 (agglutination factor) 為抗火疫病病程相關(guān)蛋白(pathogenesis related proteins,PRs)[12]。Hamdoun等[13]發(fā)現(xiàn)E.amylovora侵染引起寄主植物蘋(píng)果和非寄主植物擬南芥的水楊酸含量增加和水楊酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)上升,過(guò)表達(dá)水楊酸下游的抗病反應(yīng)關(guān)鍵調(diào)控基因NPR1可提升蘋(píng)果對(duì)E.amylovora的抗性;而沉默水楊酸調(diào)節(jié)基因EDS1則降低擬南芥對(duì)E.amylovora的抗性,但是擬南芥ICS1(編碼水楊酸合成關(guān)鍵酶)基因突變體并沒(méi)有減少病原菌引起的寄主細(xì)胞死亡。因此,水楊酸在植物抗E.amylovora侵染中發(fā)揮的作用仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。此外,下調(diào)茉莉酸通路也會(huì)降低蘋(píng)果對(duì)E.amylovora的抗性,乙烯含量在蘋(píng)果接種病原菌5 h后遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組,但這兩個(gè)通路在植物抗性中的作用機(jī)制仍不明確[14-15]。

總體而言,目前抗火疫病作物品種缺乏,植物抗火疫病分子機(jī)制尚不夠明確。本研究鑒定了梨品種‘玉露香’對(duì)火疫病的抗性,并利用該材料開(kāi)展抗性相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。研究明確了‘玉露香’對(duì)E.amylovora表現(xiàn)出明顯早期抗性。通過(guò)高通量蛋白組學(xué)分析,鑒定獲得一組抗病和防衛(wèi)相關(guān)蛋白,為進(jìn)一步揭示梨火疫病抗性分子機(jī)制及抗病育種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 菌株和植物材料

本研究所用梨火疫病菌菌株為XJSZ0102,分離自新疆伊犁的山楂病樣,配成含20%甘油的菌液于-80℃保存。菌株活化培養(yǎng)用NA和NB培養(yǎng)基。

NA培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,蔗糖5 g,瓊脂粉15 g,加水定容至1 000 mL,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2,121℃高壓滅菌20 min。NB培養(yǎng)基配方同NA,但不加瓊脂粉。

本研究所用植物材料為梨,品種為‘玉露香’和‘庫(kù)爾勒香梨’。將一年生梨苗移栽于新疆庫(kù)爾勒市農(nóng)業(yè)局育苗中心3號(hào)大棚。

1.2 梨火疫病菌接種分析

每個(gè)品種挑選10株移栽45 d且生長(zhǎng)狀態(tài)一致的植株用于接種。菌株XJSZ0102在NA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)后挑取單菌落在NB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至濃度為1×109cfu/mL(OD600=0.4),稀釋10倍后用于接種。接種時(shí)使用滅菌的牙簽,先在菌液中浸泡2～3 min,使牙簽充分吸收菌液,而后用牙簽在嫩枝離頂端15 cm處穿刺,穿刺深度為5 mm,穿刺后停留3 s。每株接種1個(gè)嫩枝,每枝1個(gè)接種點(diǎn)。接種后梨苗在大棚條件下正常管理。連續(xù)觀察梨苗的發(fā)病情況,觀測(cè)記錄病斑長(zhǎng)度。整個(gè)接種試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 梨蛋白質(zhì)組質(zhì)譜分析

剪取移栽45 d、未接種的梨植株嫩枝離頂端 10 cm 處向下6 cm長(zhǎng)枝段,迅速置于液氮中冷凍。每個(gè)品種每樣取6株梨苗、每株1個(gè)嫩枝的相應(yīng)枝段。取出冷凍的梨枝小段,用研缽研磨成細(xì)粉。采用TCA/丙酮沉淀法提取總蛋白。蛋白提取,還原,烷化,酶解,脫鹽,純化,LC-MS/MS質(zhì)譜分析具體操作參考曹嘉懿[16]的方法。蛋白通過(guò)超高分辨率質(zhì)譜儀 (Orbitrap elite) 進(jìn)行肽段鑒定,Theromo Xcalibur Qual Browser進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,Proteome Discoverer 2.0軟件的Sequence HT方法檢索NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)中的白梨Pyrusbretschneideri基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

1.4 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)分析

采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組鑒定分析技術(shù)比較分析‘玉露香’和‘庫(kù)爾勒香梨’嫩枝蛋白質(zhì)組。以 |log2fold change|≥1且Pvalue<0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白鑒定分析。采用公共數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進(jìn)行Pathway分析。

1.5 Cu2+對(duì)梨火疫病菌的抑菌作用分析

在NB培養(yǎng)液中培養(yǎng)梨火疫病菌至OD600為 0.2,然后分別加入CuSO4、MgSO4和CuCl2至終濃度分別為1、1.5、2 mmol/L(CuSO4)和 3 mmol/L(MgSO4和CuCl2)。在48孔板中加入800 μL含有不同濃度金屬離子的菌液,未加金屬離子的菌液作為對(duì)照。用全自動(dòng)細(xì)胞成像多功能微孔板檢測(cè)儀(BioTek Cytation 1,德國(guó))對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。儀器設(shè)置溫度為28℃,線性晃動(dòng),每隔0.5 h記錄1次菌液的OD600。培養(yǎng)18 h后,取各處理孔板中的培養(yǎng)液先稀釋2倍然后再進(jìn)行10倍梯度稀釋,吸取5 μL菌液點(diǎn)樣于NA培養(yǎng)板,觀察菌落生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘玉露香’對(duì)火疫病的抗性分析

‘玉露香’是以‘庫(kù)爾勒香梨’為母本,‘雪花梨’為父本雜交育成的優(yōu)質(zhì)中熟梨新品種[17]。為了探究‘玉露香’對(duì)火疫病是否具有抗性,以感病品種‘庫(kù)爾勒香梨’為對(duì)照,對(duì)其進(jìn)行梨火疫病抗性鑒定。移栽45 d的梨植株嫩枝經(jīng)針刺接種后32 h，不同品種出現(xiàn)了表型差異,48 h后差異達(dá)到峰值(圖1),感病對(duì)照品種‘庫(kù)爾勒香梨’病枝率為86%,而‘玉露香’僅為14%,表現(xiàn)出明顯的抗性。但接種后4 d,‘庫(kù)爾勒香梨’和‘玉露香’的病枝率均為100%,即全部接種枝條均發(fā)病(圖1a)。從病斑長(zhǎng)度看,接種后4 d內(nèi)兩個(gè)品種有顯著差異。接種后2 d和4 d,‘庫(kù)爾勒香梨’的平均病斑長(zhǎng)度分別為16.7 mm和71.8 mm,而‘玉露香’的平均病斑長(zhǎng)度依次分別只有3.3 mm和39.8 mm。但接種6 d以后,兩品種間無(wú)顯著差異?！畮?kù)爾勒香梨’的平均病斑長(zhǎng)度為195.0 mm,‘玉露香’的平均病斑長(zhǎng)度也達(dá)183.9 mm(圖1b)。接種7 d后,‘庫(kù)爾勒香梨’近半的枝條已經(jīng)呈現(xiàn)牧羊鞭狀,而‘玉露香’沒(méi)有產(chǎn)生該癥狀的枝條。這些結(jié)果表明,‘玉露香’對(duì)火疫病表現(xiàn)較顯著的早期抗性,可能具有抗侵入或早期抗擴(kuò)展的特性。

圖1 ‘玉露香’對(duì)火疫病的抗性Fig.1 Resistance of ‘Yuluxiang’ to fire blight

2.2 ‘玉露香’與‘庫(kù)爾勒香梨’的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析

為明確‘玉露香’對(duì)火疫病的抗性機(jī)制,對(duì)‘玉露香’和感病品種‘庫(kù)爾勒香梨’的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了鑒定分析,共鑒定到2 589個(gè)蛋白。以|log2fold change|≥1且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),鑒定出在‘玉露香’和‘庫(kù)爾勒香梨’中顯著差異表達(dá)的蛋白192個(gè),其中133個(gè)蛋白在‘玉露香’中上調(diào)表達(dá),59個(gè)下調(diào)表達(dá)。

2.3 ‘玉露香’抗火疫病相關(guān)蛋白的鑒定

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)192個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了富集分析。結(jié)果顯示,差異表達(dá)蛋白涉及多個(gè)富集較明顯的通路(圖2)。其中,前8個(gè)通路為代謝途徑(metabolic pathways)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、碳代謝(carbon metabolism)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白組加工(protein processing in endoplasmic reticulum)、乙醛酸和二羧酸代謝(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)和植物-病原互作(plant-pathogen interaction)通路。其中MAPK信號(hào)和植物-病原互作兩個(gè)通路均富集到了2個(gè)鈣調(diào)蛋白(calmodulin和calmodulin-7),表明基于鈣調(diào)蛋白的鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑可能在‘玉露香’早期抗火疫病中起重要作用。

圖2 ‘玉露香’與‘庫(kù)爾勒香梨’差異表達(dá)蛋白的KEGG信號(hào)通路富集分析Fig.2 Enrichment analysis of KEGG signal pathway of proteins differentially expressed between ‘Yuluxiang’and ‘Korla fragrant pear’

進(jìn)一步的序列功能注釋和文獻(xiàn)搜索分析顯示,192個(gè)差異表達(dá)蛋白中,29個(gè)為抗病和防衛(wèi)相關(guān)蛋白(表1),其中包括3個(gè)免疫受體FERONIA,LYK4 (lysM domain receptor-like kinase 4) 和LecRKⅧ.2 (L-type lectin-domain containing receptor kinase Ⅷ.2);一組防衛(wèi)相關(guān)蛋白如碳酸酐酶 (carbonic anhydrase,CA),鞘脂激活蛋白原 (prosaposin,PASP)和SRG1-like;一組酚類合成調(diào)控酶;一組病程相關(guān)蛋白(PR1-like,germin-like protein,subtilisin-like protease,endochitinase)以及一個(gè)銅轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase蛋白 (copper-transporting ATPase) HMA5。此外,差異表達(dá)蛋白還包括13個(gè)氧化還原相關(guān)蛋白 (SOD,PDI,phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase,laccase,thioredoxin等)。這些結(jié)果表明,基于FERONIA,LYK4 和LecRKⅧ.2等的免疫、碳酸酐酶,鞘脂激活蛋白原和SRG1-like介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)、酚類合成以及氧化還原調(diào)控可能參與‘玉露香’對(duì)火疫病抗性的調(diào)控。

表1 ‘玉露香’與‘庫(kù)爾勒香梨’差異表達(dá)的抗病相關(guān)蛋白1)Table 1 Resistance-related proteins differentially expressed between ‘Yuluxiang’ and ‘Korla fragrant pear’

2.4 Cu2+對(duì)E.amylovora 的抑菌作用

銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase蛋白HMA5在‘玉露香’中的積累量顯著高于‘庫(kù)爾勒香梨’(表1)。為了明確抗病品種‘玉露香’是否通過(guò)在胞外積累高濃度銅離子,殺死火疫病菌,從而表現(xiàn)對(duì)火疫病的抗性,本研究分析了E.amylovora對(duì)銅離子的敏感性。Cu2+和E.amylovora共培養(yǎng)分析結(jié)果顯示,Cu2+的抑菌作用隨濃度升高而增強(qiáng),2 mmol/L CuSO4對(duì)E.amylovora的抑制率達(dá)到了100%(圖3)。CuCl2具有相同效果,然而濃度高達(dá)3 mmol/L的MgSO4不影響火疫病菌生長(zhǎng),表明在金屬離子中Cu2+對(duì)火疫病菌有一定的抑制作用。

圖3 Cu2+對(duì)梨火疫病菌的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Cu2+ on the growth of Erwinia amylovora

3 結(jié)論與討論

梨火疫病早在19世紀(jì)末就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),針對(duì)病害的研究前期主要集中在病原菌的致病機(jī)理上[18],植物對(duì)火疫病的抗性機(jī)制研究明顯落后。此外,關(guān)于E.amylovora與植物的互作,主要集中在蘋(píng)果和非寄主擬南芥上。梨和蘋(píng)果雖同為寄主,但對(duì)病原菌的敏感性有很大差異。Santander等[19]發(fā)現(xiàn),在E.amylovora從根系侵染杜梨苗時(shí),能夠很快擴(kuò)展到植物的地上部分,這與蘋(píng)果中緩慢而有限的向地上部分遷移相反[20-21],進(jìn)一步表明梨抗性機(jī)制研究的重要性。

火疫病抗性品種的鑒定和獲取是該病害綠色防控的重要途徑。本研究通過(guò)枝條針刺接種,以病枝率和病斑長(zhǎng)度為指標(biāo),初步明確了‘玉露香’對(duì)火疫病具有早期抗性,表現(xiàn)抗侵入特性。但該抗性強(qiáng)度及持久性等有待結(jié)合癥狀和菌量分析進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定了29個(gè)抗病和防衛(wèi)相關(guān)蛋白,其中值得注意的包括鈣調(diào)蛋白,FERONIA、LYK4 和LecRKⅧ.2等免疫受體,碳酸酐酶 (CA)、鞘脂激活蛋白原 (PASP) 和SRG1-like等防衛(wèi)相關(guān)蛋白。FERONIA是RALF(rapid alkalinization factor)的受體,可以正向或負(fù)向調(diào)控植物對(duì)不同病原物的抗性[22-24]。另一免疫受體LYK4在擬南芥中參與幾丁質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),正向調(diào)控?cái)M南芥對(duì)植物病原細(xì)菌丁香假單胞菌Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)DC3000和病原真菌蕓薹生鏈格孢Alternariabrassicicola的抗性[25]。在本研究中,感病品種‘庫(kù)爾勒香梨’中檢測(cè)到這兩個(gè)蛋白,而表現(xiàn)出早期抗性的‘玉露香’中并未檢測(cè)到,表明它們有可能在梨抗火疫病中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。flg22抑制擬南芥中β-CA1和β-CA4的表達(dá),ca1和ca4雙突變植株對(duì)Pst DC3000抗性明顯增強(qiáng)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)在‘玉露香’中有一個(gè)γ-CA1 (gamma carbonic anhydrase 1)表達(dá)量顯著低于‘庫(kù)爾勒香梨’,有可能在梨抗火疫病中發(fā)揮作用。PSAP是鞘脂活化蛋白的前體,存在于溶酶體和分泌蛋白中。已有研究報(bào)道它們具有抗微生物的活性,比目魚(yú)中的PSALP1和PSALP2能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[27]。雖然PSAP家族成員是否參與植物抗病性尚無(wú)相關(guān)報(bào)道,但在本研究中發(fā)現(xiàn),PSAP僅積累于‘玉露香’中,意味著PSAP可能抑制E.amylovora生長(zhǎng),使‘玉露香’產(chǎn)生抗性表型。擬南芥SRG2和SRG3是依賴水楊酸的植物免疫途徑的正調(diào)控因子[28]。‘玉露香’中SRG1-like的顯著下調(diào),暗示其可能參與梨火疫病抗性的調(diào)控。

E.amylovora主要通過(guò)木質(zhì)部而非韌皮部在植物組織內(nèi)繁殖[19]?！衤断恪}信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白鈣調(diào)蛋白(calmodulin,calmodulin-7)較‘庫(kù)爾勒香梨’顯著上升,鈣調(diào)蛋白作為一些病原菌的效應(yīng)子的輔因子與擬南芥中MAP65(microtubule-associated protein 65)互作進(jìn)而抑制植物基于細(xì)胞壁的細(xì)胞外免疫[29]。這些結(jié)果表明,‘玉露香’可能通過(guò)改變維管束的生理、生化性狀或信號(hào)識(shí)別途徑來(lái)抵御病原菌的侵染和定殖。該假設(shè)也一定程度上解釋了‘玉露香’的抗性主要表現(xiàn)在侵染早期。

本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白HMA5,相較于‘庫(kù)爾勒香梨’,在‘玉露香’中明顯上調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)銅離子對(duì)于E.amylovora具有明顯的抑制作用。Yuan等[30]在水稻中發(fā)現(xiàn),COPT1和COPT5兩個(gè)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以與抗病蛋白Xa13互作。維管束中銅離子濃度升高,COPT轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水稻白葉枯病菌PXO99 表現(xiàn)出明顯的抗病表型。在梨中開(kāi)展HMA5的功能分析,闡明其在銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及不同細(xì)胞和組織部位中積累的作用及機(jī)制,分析其對(duì)E.amylovora的響應(yīng)動(dòng)態(tài),有助于揭示‘玉露香’對(duì)E.amylovora是否與水稻抗白葉枯病菌相似具有依賴于HMA5的抗性調(diào)控機(jī)制。

本研究通過(guò)KEGG分析富集到了很多與次生代謝有關(guān)的蛋白。相關(guān)研究表明E.amylovora侵入植物后,一些次生代謝物水平發(fā)生顯著變化,如類苯丙烷和類黃酮途徑衍生化合物。該途徑有大量的分支,可以通過(guò)結(jié)合還原酶、轉(zhuǎn)移酶類、加氧酶類和結(jié)合酶等產(chǎn)生眾多次生代謝物[31-33]。Jensen等[34]表明類苯基丙烷途徑的整體表達(dá)可能在植物抗E.amylovora中發(fā)揮一定作用。此外,植物體內(nèi)的次生代謝物也會(huì)因?yàn)槠贩N、菌株的不同而有所差異,比如,抗性品種中的熊果苷含量較高,感病品種中綠原酸含量較高[35]。表1所列酚類合成調(diào)控酶在抗火疫病中的作用值得進(jìn)一步分析。

本研究通過(guò)對(duì)抗病和感病梨品種的組成性差異蛋白組學(xué)分析,挖掘了一批潛在的參與火疫病抗性調(diào)控基因。它們已在其他植物抗病性機(jī)制中發(fā)揮重要作用。我們通過(guò)蛋白組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白也很有可能在梨對(duì)火疫病的抗性中扮演重要角色,為進(jìn)一步采用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等分析揭示抗火疫病分子機(jī)制提供了候選基因,并為梨火疫病抗性的遺傳改良和更高效的防治措施提供參考。